Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området Principer Koncentrationsmätning Detektion Kromoforer, kolorimetriska assays DNA Komparativ analys Proteinrening Jonbindning
Peptidgruppens absorbans π π* ε max 7000 n π* ε max 100
För proteiner: störst absorbans i regionen 180-200 nm
Vad absorberar mer i UV hos ett protein? Trp Tyr Phe ε*10-4 för Trp: 0.5 / 280nm; Tyr: 0.1 / 280nm; Phe:0.01 / 260nm Flera aminosyrors sidokedjor absorberar < 230 nm, t ex Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, His, men med mycket mindre ε vilket gör detektionen svår.
Empiriskt: Beer-Lamberts lag Andelen absorberat ljus är proportionell mot antalet absorberande molekyler -di/i = C ε dl Integrera: Med 10 som bas: ln (I 0 /I) = C ε l A (λ) = C ε (λ) l Maximal absorbtion: ε = 10 5 M -1 cm -1 (härledning i kompendiet) För en stark absorbent: ε = 10 4 M -1 cm -1 dvs 10% av allt ljus absorberas
Koncentrationsmätning A (λ) = ε (λ) l c Bestämning av ε : görs vanligen vid 280 nm, då beror detta främst av antalet Trp, Tyr, Phe OBS: strukturberoende! ph-beroende! HUR GÖRA?
Teoretisk uppskattning av extinktionskoefficienter Det är möjligt att få en god uppskattning av den molära extinktionskoefficienten från aminosyrasammansättningen vidph 6.5, 6.0 M guanidium hydrochlorid, 0.02 M fosfatbuffer, och våglängder >260 nm om proteinet innehåller tyrosin, tryptofan och/eller cystine (S-S) (cystein absorberar dåligt >260 nm) Följande ekvation används: ε(prot) = #(Tyr)* ε(tyr) + #(Trp)* ε(trp) + #(Cys)* ε(cys) Gill S.C., von Hippel P.H. "Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data." Anal. Biochem. 182:319-326(1989).
http://www.expasy.org/tools/protparam.html MPVSASLACK NYDYDYDSIQ PYFYFDNDDFYHHQQGQT QPSAPSEDIW KKFELLPTPP LSPSRRQSLS TAEQLEMVSE FLGDDVVSQS FICDDADYSQ SFIKSIIIQD CMWSGFSAAA Number of amino acids: 120 Molecular weight: 13689.0 Theoretical pi: 4.01 Extinction coefficients: Extinction coefficients are in units of M -1 cm -1, at 280 nm. Ext. coefficient 21555 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.575, assuming ALL Cys residues appear as half cystines Ext. coefficient 21430 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.565, assuming NO Cys residues appear as half cystines Om utan W (2 st): Ext. coefficient 10555 Om utan W,Y (7 st): Ext. coefficient 1615 : 8 F inte tillräckligt!
Procedur för experimentell bestämning av extinktionskoefficienten: Fördelar / Nackdelar!
Kromoforer prostetiska grupper
ε*10-4 för Trp: 0.5 / 280nm; Tyr: 0.1 / 280nm; Phe:0.01 / 260nm
Kromoforer kan utnyttjas för att bestämma koncentrationen av biomolekyler - Specifik bindning till vissa strukturer / aminosyror - Mindre specifik bindning: massa, hydrofobicitet etc - ofta kolorimetrisk: ger en färg eller färgändring Kalibreringskurvor krävs! - Protein som liknar det analyserade
Analytiska assays använder ofta kromoforer: Lätt att analysera Enkel spektroskopi Billigt Kan automatiseras
Enkla analyser på papper/sticka
Lowrys metod och BCA-metoden Lowry: En molybdenförening reduceras (detektion vid 660 nm) genom koppar-katalyserad oxidation av aromater Används idag främst för analytisk bestämning av fenolhalter i livsmedel (t ex vin) Detektionsgräns 10 mikrogram protein / ml BCA: Cu2+ reduceras till Cu+ genom reaktion med peptidbindningar, Cu+ reagerar med BCA => absorbans vid 562 nm; detektionsgräns 0.5 mikrogram protein /ml
Bradfords metod Coomassie Brilliant Blue G-250 Absorbtionsspektrumet förändras vid inbindning till protein + Enkelt att använda, icke-toxiska reagens - Detektionsgräns 20 ug/ml - Beroende av att proteinet innehåller Arg eller Lys
Enzymatiska assays för detektion
Enzymkinetik: diagnostisk enzymologi Förutsättningar: allt i överskott utom det analyserade enzymet (PFK i detta fall)
Differens-spektra Buffertsubtraktion dra bort ursprungstillståndet för att se förändringen
Subtraktion av referensprov i spektrofotometern : dubbelstråleinstrumentet
Detektion upprening, isolering: känsligt! snabbt! tydligt! men kompletterande analys behövs oftast
Vad kan det vara för fördel/nackdel att detektera vid 220 nm?
Geldetektion
DNA: Nukleinsyrors absorbtion Varför varierar absorbansen med ph? Vid vilken våglängd är det klokt att analysera DNA-koncentration? Är det en känslig assay?
Konformationsberoende: duplex single strand Vilket är Enzymic digest och vilket är Native DNA?
DNA detekteras i UV med interkalerad EtBr
Komparativ analys: substansidentifiering
Bindningsanalyser: mätning av binding av cancerinhibitor till RNA
Jonbindning - zinkfingrar Med konkurrerande kromofor (i e BAPTA) Med Co 2+ istället för Zn 2+
Summering!