Introduktion till laboration Biokemi 1



Relevanta dokument
Introduktion till labkursen på Biokemi 1

Preparation av hemoglobin med hjälp av gelfiltrering

Isolering och rening av proteinet tiopurinmetyltransferas

Expression, produktion och rening av Fatty acid binding protein (FABP) från ökenmyran Cataglyphis fortis

Institutionen för laboratoriemedicin Bilaga 2 Biomedicinska analytikerprogrammet Analytisk Kemi och Biokemisk metodik Ht 2010, Termin 3

Preparation och spektroskopisk karakterisering av Myoglobin

Kromatografi. Kromatografi

LAB 12. Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli

DNA-labb / Plasmidlabb

BASÅRET KEMI B BIOKEMI VT PROTEINER OCH ENZYMER (sid )

Uttryck av kloratreduktas och kloritdismutas i Ideonella dechloratans odlade i aerob miljö med tillsatt klorat

Transport över membran hur olika ämnen kommer in i cellen. Kap 1

Datum Skrivtid 240 minuter. Charlotte Sahlberg Bang, 8 poäng. Ulla Ericsson, 6 poäng Karin Franzen, 7 poäng Rolf Pettersson, 6 poäng

Jonbyteskromatografi

Rening av proteiner: hur och varför?

Namn: student x & student y Kurs: FAGBH0 Utförd:

Utveckling av reningsmetod för cytokrom c-id1 från Ideonella dechloratans

Analysera gifter, droger och andra ämnen med HPLC och GC. Niklas Dahrén

Transport över membran hur olika ämnen kommer in i cellen. Kap 1

Rening, inmärkning och användning av ett målprotein

Jonisering. Hur fungerar jonisering? Vad är en jon?

FACIT TILL FINALEN GRUNDBOK

UMEÅ UNIVERSITET Målsättning Att använda metoder för direkt observation av mikroorganismer.

Örebro universitet Institutionen för hälsovetenskap och medicin Enheten klinisk medicin. Datum Skrivtid 240 minuter. Charlotte Sahlberg Bang

Människokroppens kemi. Upprop Kursintroduktion Kompendieutdelning Föreläsning: Kemisk bindning

Kromatografimetod. Separation genom olika distribution av molekyler mellan en mobil fas och en stationär fas

Provtagning Klinisk kemi, gruppundervisning L1

KEMI 1 MÄNNISKANS KEMI OCH KEMIN I LIVSMILJÖ

Felveckning och denaturering av proteiner. Niklas Dahrén

Aquatron UV brunn. Aquatron International AB Ekebyvägen Västerås mail: info@aquatron.se

Tentamen i Immunteknologi 28 maj 2003, 8-13

Uppsala Universitet Institutionen för fotokemi och molekylärvetenskap EG FH Konjugerade molekyler

NO: KEMI. Årskurs

Western blot. BMA-09, VT-11, Termin 4. Ylva Hedberg Fransson

Diagnostik av subarachnoidalblödning ur laboratoriets synvinkel. Peter Ridefelt Klinisk kemi och farmakologi, Akademiska sjukhuset, Uppsala

Att Påvisa olika sorters Närings Ämnen i Föda:

Datum Skrivtid 4 tim. Charlotte Sahlberg Bang

CSV proteiner. Equalis 25:e mars 2010

få se en naturvetenskaplig forskningsmiljö och träffa människorna i den miljön.

Titrering av en stark syra med en stark bas

OBS! Under rubriken lärares namn på gröna omslaget ange istället skrivningsområde, ex Lösningsberedning. Totalt ska ni använda 9 gröna omslag.

Proteiner. Biomolekyler kap 7

LABORATIONS-KOMPENDIUM

Vad menas med att mäta biopotentialer. Bioelektriska signaler. Sammanfattning I. Sammanfattning I. Vilka är de?

Biokemisk analys och separationsteknik VT08

Teori Den här laborationen går ut på att du ska studera vad som händer då du stör en jämviktsreaktion. Det jämviktssystem som du ska studera är

Transport över membran Undersökning osmos och växtceller (potatis)

Trycket beror på ytan

Analys av nukleinsyra. Molekylärbiologisk metodik T3 ht 11 Märit Karls

75102 Anatomiset. Människokroppen är den mest komplicerade maskinen i världen. Ta detta tillfället att lära dig mer om människokroppen.

Föreläsning 21. Sammanfattning F21. 1) Introduktion 2) Upprening 3) Karaktärisering. 4) Beräkningskemi 5) Mer organisk kemi 6) Forskning

FÖRETAGSAMHET LÖNAR SIG ALLTID

Diagnosticera sicklecellsanemi med DNA-analys. Niklas Dahrén

Elektrolysvatten. Miljövänlig teknologi för vattenrening,desinfektion och sterilisering

Gungande tvätt. Uppgift. Materiel

KRISTALLISERING AV LYSOZYM

Kemi. Fysik, läran om krafterna, energi, väderfenomen, hur alstras elektrisk ström mm.

30. Undersökning av aminosyror i surkål

Downstream Processing

Glukosdehydrogenas. Laktos och Galaktos. Enzymatisk bestämning i livsmedel

S-IGF1, isys, IDS Malmö

SÄKERHETSVISAREN 1. LEDNING OCH PRIORITERINGAR

Kapacitansmätning av MOS-struktur

C Kol H Väte. O Syre. N Kväve P Fosfor. Ca Kalcium

Analytisk kemi. Kap 1 sid 15-22, Kap 9 sid

Detta prov består av del 1 och 2. Här finns också facit och förslag till poängsättning

Kartläggning av arbetsmiljörisker vid heta övningar-övningsfälten Sandö och Revinge

Survivor 06 (Model # /# ) GB DE FRA NL DK SWE NOR FIN IT ESP POR

Valet 2010 på facebook!

5.1 Den korresponderande basen till en syra är den partikel du får då en proton har avgivits. a) Br - b) HCO 3. c) H 2 PO 4.

BIMA15 HT Säkerhetsföreskrifter och kompletterande laborationer 1

Pilotförsök Linje 1 MembranBioReaktor

Valet 2010 på facebook!

Leucosep-rör LTK.615 BIPACKSEDEL. För in vitro-diagnostik PI-LT.615-SE-V3

Proteinstruktur samt Hemoglobin

1. a) Markera polära och icke-polära delar i nedanstående molekyl. Vilken typ av ämne är det, och vad heter molekylen? (2p)

Analysera gifter, droger och läkemedel med högupplösande vätskekromatografi (HPLC) Niklas Dahrén

Uppgifter talmönster & följder

Guide till projektarbetet

GIT L0002B INTRODUKTION TILL PROGRAMMERING OCH C# Information inför kursstart

Ballingmetoden. Jonas Roman. En genomgång av Ballingmetoden i teori och praktik. Utgåva 2.0

Laboration Enzymer. Labföreläsning. Introduktion, enzymer. Kinetik. Första ordningens kinetik. Michaelis-Menten-kinetik

Tanklining. Invändig målning och beläggning i Tankar. Grundläggande. Lagringstemperatur

DNA-analyser: Diagnosticera cystisk fibros och sicklecellanemi med DNA-analys. Niklas Dahrén

UPPGIFT!! Sortera sedan notisarna på A3 pappret efter respektive kategori.

DET HANDLAR OM MAT. MAT SOM ÄR LIVSVIKTIGT FÖR OSS FÖR ATT VI SKALL MÅ BRA OCH KUNNA PRESTERA I OLIKA SITUATIONER! GENOM ATT VI ÄTER OCH DRICKER FÅR

Identifiera okända ämnen med enkla metoder. Niklas Dahrén

Kromatografi. Den kromatografiska processen. Fördelar med HPLC - (utförs under högt tryck ca 400 Bar) Vätskekromatografi. Olika former av LC

atomkärna Atomkärna är en del av en atom, som finns mitt inne i atomen. Det är i atomkärnan som protonerna finns.

Cu i rent vatten. Efter 6 månader. Experimentaluppställning

Introduktion till Lean, dag1

SPEKTROFOTOMETRISK BESTÄMNING AV KOPPARHALTEN I MÄSSING

OBS! Under rubriken lärares namn på gröna omslaget ange istället skrivningsområde.

Vatten har: 1. Stor ytspänning. 2. Hög kokpunkt. 3. Högt ångbildningsvärme. 4. Stor dielektricitetskonstant.

Lik- och Växelriktning

Månadstema September: Kommunikation Laborationer för 7-9. Se även laborationsförslag för gymnasiet och F-6

A4-ark 1, framsida. A4-ark 1, baksida. A4-ark 2, framsida. A4-ark 2, baksida

Partiklars rörelser i elektromagnetiska fält

Hur mäts kunskap bäst? examinationen som inlärningsmoment

Schema för BL2011 Gener, celler och populationer / Schema för BL2018 Cell- och molekylärbiologi: Mikrobiologi 4.5 hp, VT 2015

Transkript:

Introduktion till laboration Biokemi 1 Annica Blissing IFM Biochemistry

Upplägg Laborationen sträcker sig över flera tillfällen Isolering, gelfiltrering, absorbansmätning och påvisande av sulfat Provberedning, SDS-PAGE, pipettkalibrering, gelinfärgning Dataanalys och diskussion kring resultat Rapport 2

Förberedelser Tillfälle 1 Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Tillfälle 2 Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Beräknat provvolym till SDS-PAGE Alltså VAD och VARFÖR Vi hjälper er med HUR! Tillfälle 3 analys och diskussion All insamlad data Repeterat teorin inför diskussion 3

Teori inför laborationen 4

Separationstekniker Inom biokemi vill man i princip alltid separera komponenter i en lösning. Isolera och rena hemoglobin Olika separationskriterier centrifugering och utsaltning gelfiltrering Kontrollera renhet och bestämma molekylvikt med SDS-PAGE 5

Hemoglobin 4 subenheter kvartärstruktur 6

Hemoglobin 7

Erytrocyter Semipermeabelt membran Erytrocyt Porer och kanaler ClNa+ K+ K+ Na+ H2O joner Na+ Na+ Cl- Na+ Cl- K+ K+ K+ Diffusion ClSamma osmotiska tryck i och utanför cellen 8

Osmos Diffusion från högre koncentration till lägre koncentration, tills koncentrationsgradienten är utjämnad. 9

Lysering H2O H2O H2O H2O [NaCl] Isoton lösning 0.9% NaCl H2O H2O [NaCl] H2O H2O H2O H2O Hypoton lösning < 0.9% NaCl H2O H2O Hyperton lösning > 0.9% NaCl H2O H2O H2O 10

Utsaltning Proteiner har laddningar på ytan Olika sammansättning av laddningar på ytan löslighet neutralisera laddningarna faller ut vid olika saltkoncentrationer löslighet tillsätt motladdningar tills proteinets laddningar neutraliserats Separation med avseende på löslighet (NH4)2SO4 11

Gelfiltrering Separation med avseende på storlek och form. Tvärbunden glukospolymerer Små molekyler går in i gelkornen Större molekyler får inte plats vandrar runt gelkornen lång vandringssträcka kortare vandringssträcka Size exclusion chromatography 12

13

Kromatogram Absorbans 280 nm baslinjeseparation Voidvolym Volym (ml) fraktioner 14

Gelfiltrering Separation med avseende på storlek och form. Avlånga och utsträckta molekyler uppför sig som att de hade högre molekylvikt Calmodulin PDB molecule of the month Aug 2003 http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momid=44 15

Gelfiltrering Avlånga och utsträckta molekyler uppför sig som att de vore större Hydrodynamisk radie svårare att ta sig in i gelkornen än globulära partiklar separation trots samma molekylvikt! globulär 16

Gelfiltrering Omvänd sil störst går först Separation med avseende på storlek och form. separationskriterier 17

Gelelektrofores Laddad partikel rör sig mot pol i elektriskt fält jmf elektrolys polyakrylamidgel Proteiner har laddningar på ytan tredimensionellt nätverk 18

Polyakrylamidgelelektrofores Tredimensionellt nätverk Bestämd porstorlek bisakrylamid Separation med avseende på storlek Stora molekyler retarderas Små molekyler passerar lättare Minst går först 19

Polyakrylamidgelelektrofores 20

Polyakrylamidgelelektrofores Proteinbanden färgas med coomassie visualisera 21

Polyakrylamidgelelektrofores MEN formen påverkar migrationen! Kan ha samma form men olika laddningar på ytan Nativ struktur påverkar migrationen form laddning Lösning: denaturera! 22

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis disulfidbryggor och primärstruktur intakta bryter icke-kovalenta bindningar Sekundär Tertiär Kvartär β-mercaptoetanol denaturering SDS binder till proteiner negativ nettoladdning Alla peptidkedjor får samma form och laddning 23

SDS-PAGE Alla peptidkedjor samma laddning och form Samma elektroforetiska mobilitet Separation endast m a p storlek Molekylviktsbestämning Renhetsbedömning 24

SDS-PAGE Molekylviktsbestämning Referensproteiner med kända molekylvikter Mät vandringslängder Log-diagram Log molekylvikt Vandringslängd (mm) Exempelrapport på kurshemsidan! 25

Log-diagram SDS-PAGE 5.5 f(x) = -0.02x + 5.37 5.3 Logaritmerad molekylvikt 5.1 Använd för att räkna ut molekylvikten 4.9 4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 0 10 20 30 40 50 60 vandringslängd (mm) 26

Log-diagram SDS-PAGE 5.5 f(x) = -0.02x + 5.37 5.3 Logaritmerad molekylvikt 5.1 4.9 4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 0 10 20 30 40 50 60 vandringslängd (mm) 27

Viktigt! Molekylvikten säger INGENTING om provets renhet! Hur avgör man renheten? 28

SDS-PAGE Renhetsbedömning Ett band = en molekylvikt Ofta en sorts protein Ett band = rent protein 29

Renhetsbedömning MEN vissa proteiner kan uppvisa fler än ett band Kom ihåg: Hb har 4 subenheter Så är inte alltid fallet! Hb:s subenheter väger lika ~ 16 000 g/mol endast ett band på gelen! 30

Jämförelse Gelfiltrering PAGE Calmodulin PDB molecule of the month Aug 2003 http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do? momid=44 Nativt protein SDS-PAGE Nativt protein storlek storlek form form Denaturerat protein storlek laddning 31

Jämförelse Absorbans 280 nm Använda gelfiltrering för molekylviktsbestämning? Kända referensproteiner på samma sätt som SDS-PAGE Referensproteiner med samma form! Volym (ml) 32

Isolering och rening av hemoglobin 33

Laborationer på Biokemi 1 Kom i tid Kom förberedd Labbar börjar med genomgång och kort förhör Förväntas ha koll på läget Närvaro förutsättning för att få labba! Obligatorisk närvaro Hela labpasset Meddela förhinder till handledare i god tid Meddela oss direkt om något händer! Rapportera närvaro efter avslutat labtillfälle Gör vid varje labtillfälle! 34

1.5 ml helblod 500 g, 15 min Supernatanten kastas Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min Supernatanten kastas Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4 1000 g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 35

1.5 ml helblod 500 g, 15 min pellet Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min H2O Supernatanten kastas Supernatanten kastas Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4 1000 g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 36

1.5 ml helblod 500 g, 15 min Supernatanten kastas Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min Supernatanten kastas Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4 H2O 1000 g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 37

0.5 ml Viktigt att gelytan är rak! Gelen får aldrig torrläggas! Gelfiltrering för att separera (NH4)2SO4 från Hb Gelen ekvilibrerad jämviktad anpassade buffertförhållanden från utfällningen Ekvilibreringslösning genom kolonnen 38

Absorbansmätning Lambert-Beers lag A=ε c l ε = 14480 M-1 cm-1 I I0 l = 1 cm c = koncentrationen i molar ε = molära absorptiviteten l Om A > 1 måste provet spädas 39

40

Påvisa sulfatjoner Giftigt! En droppe Ba(NO3)2 OBS! Inte till toppfraktionen! anvisad plats skyddsutrustning Högst koncentration Hb till SDS-PAGE 41

Kromatogram konstruerat av Forskarskolans elever 2011 42

hemoglobin sulfatjoner Separation! 43

Utbyte 0.5 ml supernatant absorbansvärden koncentration massa eller substansmängd hemoglobin 44

Rapporten 45

46

Rapporten Utförlig och komplett rapport! Inledning Syfte och utförlig teori Resultat Redovisas tydligt Rådata, beräkningar, figurer/bilder, tabeller... Utförande Beskriv tillvägagångssätt Passiv form! Håll isär utförande och teori! Riskanalys Diskussion Diskutera resultaten Felkällor och hur de har påverkat resultatet Jämförelse GF + SDS-PAGE Akrylamid 47

Rapporten Examination 5 arbetsdagar En rapport för alla tillfällen Tänk på helheten! Elektronisk inlämning 3 rättningar Enligt riktlinjer Gäller även returer + punkterna i handledningen Copy paste oacceptabelt Se baksidan på försättsbladet Track changes aktiverat Fullständig! Saknas något retur right-first-time 48

Tips inför rapporten Skriv inledning och utförande så snart som möjligt Se det som förberedelse Skriv resultat och diskussion så snart som möjligt Se även Redovisning i kompendiet! Checka av att allt är med Passa på att fråga oss på schemalagd tid Vi svarar gärna! Utanför schemalagd tid jobbar vi med annat Säkrast: e-mail Använd allt tillgängligt material! Föreläsningsanteckningar Kursboken Labhandledningen 49

Förberedelser Tillfälle 1 gelfiltrering Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Tillfälle 2 SDS-PAGE Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Beräknat volym Hb Alltså VAD och VARFÖR Vi hjälper er med HUR! Tillfälle 3 analys och diskussion All insamlad data Funderat på förväntad molekylvikt 50

Vi ses på lab! Annica Blissing Amelie Wallenhammar Mikaela Eliasson annij@ifm.liu.se amewa@ifm.liu.se mikel@ifm.liu.se 51