Utveckling och standardisering av metodik för analys av klostridiesporer i träck

EN RAPPORT FRÅN SVENSK MJÖLK FORSKNING Rapport nr: 7070-P 007-0-0 Utveckling och standardisering av metodik för analys av klostridiesporer i träck Anders Christiansson, Inger Andersson, Jessica Flodin & Lena Tryggvason

Utveckling och standardisering av metodik för analys av klostridiesporer i träck Anders Christiansson, Inger Andersson, Jessica Flodin & Lena Tryggvason Sammanfattning En standardiserad analysmetod för klostridiesporer i träck har tagits fram för att på ett tillförlitligt sätt kunna jämföra sporhalten i mjölk och träck. Syftet är att kunna bedöma mjölkproducentens möjligheter att minska mjölkens sporhalt genom stall- och mjölkningshygienåtgärder, alternativt att överväga foderbyte. I projektet analyserades träck- och mjölkprover från 4 gårdar med fyra olika analysmetoder. Analysresultaten skiljde sig mellan metoderna. För bästa jämförelse rekommenderas användning av rör (MPN)-metoden med BBB-substrat för både träck och mjölk. Det rekommenderas att samtliga analyslaboratorier använder denna teknik. Analysresultatet ska inte användas fristående utan användas tillsammans med rådgivarens bedömning av historiska mjölkanalysdata, bedömning av kornas renhet och spenrengöringsmetoden samt noggrannheten i avtorkningen. Rapporten ger en vägledning för utförande av bedömningen där också hänsyn tas till analysvariationen för mjölk och träck. Om sporhalten i träcken understiger 0.000/g (log 4) bör man kunna uppnå en sporhalt i mjölken som understiger 400 sporer/l. Om sporhalten i träcken ligger kring 0.000-00.000/g (log 4 till 5/g) kan låg sporhalt i mjölk uppnås med noggrann avtorkning av spenarna med fuktig duk, följt av torr avtorkning. Vid samma sporhalt i träcken, men sämre avtorkningsmetod eller mindre noggrannhet kan sporhalten i mjölken överstiga 000/l. Vid mer än några 00 000 sporer/g träck är risken stor att sporhalten i mjölken överstiger 000/l oavsett avtorkningsmetod och noggrannhet. I sådana fall bör foderbyte rekommenderas om det är möjligt. Bedömningen bör också innefatta förekomst av extremt smutsiga eller många måttligt nedsmutsade kor i besättningen, eftersom sådana kor bidrar med en mycket stor andel av sporerna i mjölken. Förbättrad stallhygien kan bidra till att minska sporhalten i mjölken, liksom riktade rengöringsåtgärder mot de smutsigaste korna.

Bakgrund Lantbrukare som fått anmärkning och kvalitetsavdrag för höga sporhalter i mjölken måste kunna åtgärda problemet på ett effektivt sätt. Om problemet inte åtgärdas innebär det inkomstbortfall som kan vara mycket kännbara. Det finns två vägar att på gården undvika/åtgärda problem med klostridiesporer i mjölken. Den första (och grundläggande) är att vara noggrann vid ensilageinläggning så att risken för höga sporhalter minimeras (). Om man har ensilage med höga sporhalter, och därmed sporer i träcken är en noggrann stallhygien särskilt viktig (, ). Avtorkning av spenarna före mjölkning reducerar antalet sporer som överförs till mjölken. Vid måttligt höga sporhalter kan intensifierade avtorkningsrutiner räcka för att sporhalten i mjölken ska kunna förbättras till en acceptabel nivå (4). Är sporhalten i ensilaget och träcken mycket hög kommer bättre avtorkningsrutiner visserligen att reducera sporhalten, men inte tillräckligt för att undvika kvalitetsavdrag. I den mån det är möjligt bör foderbyte övervägas i sådana fall. Det är därför av betydelse för lantbrukaren att veta hur högt sportrycket är på gården. Analyser av ensilage ger en uppfattning om sporhalten i ensilaget. En svårighet är emellertid att ta ut ett representativt prov från en ensilagebal eller silo, eftersom sporerna inte är jämnt fördelade i partiet. Om istället prov tas ut från träcken har ensilaget effektivt omblandats genom bearbetningen i kons matsmältningskanal och sporerna fördelats jämnt. En tidigare undersökning har visat att analyser av träck ger god överensstämmelse med sporhalt i mjölk och avsevärt högre korrelation än mellan mjölk och ensilage (5). Under 005/006 drabbades många lantbrukare av avdrag för hög sporhalt i mjölken. Träckanalyser har prövats som rådgivningsverktyg i detta sammanhang men har inte alltid visat sig kunna förklara förekomsten av sporer i mjölken. Olika analysföretag erbjuder analyser av sporinnehållet i träck. En ringanalys där Svensk Mjölk skickade ut gödselprover med känd sporhalt till laboratorier som utför sådana analyser visade på mycket stor spridning i analysresultaten för samma prov (6). Vi fann att analysmetoderna skiljde sig mellan de olika laboratorierna. Det är av yttersta vikt att metoden är väl genomarbetad och utförs likformigt för att analysresultaten ska bli jämförbara. De olika laboratoriernas information om och förslag till tolkning av analysresultat presenterades dessutom på olika sätt, vilket gör det svårt för mottagaren att förstå hur resultaten ska användas som åtgärdsunderlag. Analys av klostridiesporer i mjölk görs vanligen med rörmetoden (MPN-metoden). Olika volymer av mjölkprovet portioneras i ett antal rör (t.ex. 9 rör med ml och rör med 0, ml). Mjölken i rören blandas med odlingssubstrat som gynnar klostridier, varefter rören värms för att eliminera icke sporbildare. Genom att ha ett paraffinlager på toppen av vätskan skapas och bevaras syrefria förhållanden. Klostridiesporerna gror då ut och bakterietillväxt påvisas genom att gasbildning skjuter upp paraffinproppen. Halten sporer beräknas med ledning av antalet rör där tillväxt skett. Utmärkande för MPN-metoden är att konfidensintervallen för haltuppskattningarna är stora. Vid träckanalys kan rörmetoden användas, men eftersom halterna är höga kan även spädning och spridning på agarplatta användas. Denna metod ger teoretiskt sett högre preci- 4

sion och är enklare att utföra. Mätprincipen är koloniräkning och behöver inte nödvändigtvis ge samma resultat som rörmetoden som baseras på gasutvecklingen. För att kunna bedöma informationsvärdet i mikrobiologiska analysresultat är det nödvändigt att känna till och ta hänsyn till den variation i analyssvar som uppträder i alla metoder vid upprepade analyser av samma prov. Ett stort antal odlingssubstrat med olika sammansättning har beskrivits i litteraturen (7-4). Inget av dessa substrat leder till att man detekterar endast sporer av Clostridium tyrobutyricum, den art som vanligast orsakar ostjäsning (5). Olika tillsatser för att gynna klostridietillväxt, t.ex. stärkelse (6), gynna sporgroning (7, 8) eller för att lättare detektera klostridier framför gasbildande Bacillus, t.ex. neutralrött (9) och D-cycloserin (0) har prövats med varierande framgång. Tillsats av laktat som kolkälla (, ) har prövats för att gynna Cl. tyrobutyricum, liksom lågt ph eftersom arten är mera syratolerant än flertalet klostridier (7). Ingen av dessa metoder har varit fullständigt framgångsrik. Under senare tid har immunologisk detektion (, ) och molekylärbiologiska metoder (-5) bekräftat bristen på specificitet och sensitivitet hos de olika odlingssubstraten. PCR öppnar möjligheter för en specifik detektion av Cl. tyrobutyricum, men av bl.a. kostnadsskäl är sådana metoder inte möjliga i massanalys. I denna undersökning har därför traditionella analysmetoder utvärderats. Utgångspunkten i vårt substratval har varit att använda de substrat som är/varit aktuella i rutinanalyserna som används i mejeriernas kvalitetsprogram. Av ovan nämnda skäl är det viktigt att jämföra olika metoder och ta fram en standardiserad metod som försäkrar att bästa möjliga informationsvärde och samstämmighet mellan träck- och mjölkanalyser erhålls. För att kunna utnyttja träckanalyser och mjölkanalyser i rådgivningsarbetet är det viktigt att rådgivaren har en god förståelse för mätmetodernas begränsningar och möjligheter. I detta projekt har en sådan analysmetod tagits fram som förhoppningsvis ska kunna ge lantbrukaren och rådgivaren ett effektivt verktyg för att välja rätt åtgärder vid höga halter klostridiesporer i mjölken. Analysresultatet ska inte användas fristående utan användas tillsammans med rådgivarens bedömning av historiska mjölkanalysdata, bedömning av kornas renhet och spenrengöringsrutinerna. Rapporten ger en vägledning för utförande av bedömningen. 5

Utförande Provtagning Prover på gödsel och tankmjölk från gårdar med olika sporhalt i mjölken baserat på resultat från ordinarie mjölkanalys insamlades inom Arlas område med hjälp av rådgivare från husdjursföreningarna. Totalt samlades prover från 4 gårdar. Gödselprovet (5-70 g) togs som ett samlingsprov från färsk gödsel taget på -4 ställen i ladugården. Mjölkprovet togs från mjölktanken genom manluckan med bulkotestprovtagare eller kloraminbehandlad skopa. Två provburkar om 50 ml vardera togs ut. Proverna märktes och frystes vid -0 C före transport till laboratoriet. Analyserna gjordes av Eurofins Steins Laboratorium i Jönköping. I samband med provtagningen noterades och bedömdes gårdens spenavtorkningsrutiner. Avtorkningsmetoderna kodades enligt följande: ) ingen avtorkning; ) torrt papper, ) fuktig duk/papper; 4) fuktig och torr duk eller 5) annan, specificera. Noggrannheten vid användning av de olika avtorkningsmetoderna bedömdes som ) bra; ) acceptabla eller ) dåliga. Det fanns också en möjlighet att skriva kommentarer på bedömningsformuläret. Rådgivarna behövde inte utöver följesedeln göra några särskilda anteckningar för projektet, men deras allmänna intryck av gårdarna redovisades muntligen i samband med utvärdering och tolkning av analysresultaten. Övriga prover En noggrann enkätundersökning av ensileringsförhållandena på 4 gårdar med sporproblem i mjölken gjordes i ett examensarbete vid SLU (6). Enkäten besvarades i samband med ett rådgivningsbesök. Gödselprover togs i flytgödselbrunnen på gårdar med mycket hög sporhalt i mjölken och från gårdar 9 som inte haft sporanmärkning. De sistnämnda gårdarna besvarade samma enkät. Gödselproverna som analyserades med rörmetoden med BBBsubstrat vid Steins laboratorium Eurofins (enligt metodbeskriving från oss) och ingår också i bedömningsunderlaget för denna rapport. Analysresultat från ytterligare 4 från gårdar under utredning för klostridiesporer analyserades med ovanstående metod och inkluderas också i rapporten. Analysmetoder Träckproven (4 st) analyserades med 4 olika metoder - plattspridning med MRCM-substrat - plattspridning med BBB-substrat (BBB-buljong med tillsats av 5 g agar per liter) - MPN-metodik med MRCM-substrat i rör med paraffinpropp - MPN-metodik med BBB-substrat i rör med paraffinpropp Mjölken (4 st) analyserades med två metoder - MPN-metodik med MRCM-substrat (6 x ml +6 x 0, ml) 6

- MPN-metodik med BBB-substrat (6 x ml + 6x 0, ml = ordinarie rutinmetod, men med modifierade rörkombinationer för att erhålla bästa möjliga analysprecision över ett stort mätområde). Beredning av substrat: BBB rörmetod: BBB (Bryant and Burkey Broth (with resazurine) modified by Bergère, Biokar), ph 5,9 +/- 0,. Autoklaverat substrat ( C/5 min) förvaras mörkt vid i kyla i max dagar före användning. Substratet ändrar färg från röd till gul vid autoklavering. Det kan åter delvis rödfärgas vid förvaring, men det är viktigt att substratet avfärgas helt efter värmebehandlingssteget i analysen. Om substratet inte avfärgas bör det kasseras. MRCM rörmetod: Modified Reinforced Clostridial Medium, RCM-medium från Oxoid (CM049) med tillsats av 0,005% neutralrött (slutkoncentration). Neutralrött bereds som en koncentrerad vattenlösning och sätts till substratet före autoklavering ( C/5 min). ph 6,8 +/- 0,. Autoklaverat substrat förvaras mörkt i kyla i max dagar före användning. MRCM platta: RCM-agar från Oxoid (CM05) samt 0,005% neutralrött, ( C/5 min) ph 5,9 +/- 0,. Plattorna göts manuellt och förvarades mörkt i kyl i max dygn. BBB platta: BBB-buljong från Biokar med tillsats av 5 g agar per l, ( C/5min), ph 6,8 +/- 0,. Plattorna göts manuellt och förvarades mörkt i kyl i max dygn. Provberedning och analys De frysta proverna tinades i rumstempererat vattenbad. Vid analysen blandades träcken noggrant och 5 g vägdes i en tom provburk och 45 ml peptonvatten tillsattes. Provet skakades kraftigt i burken under 5-0 sekunder. Resterande gödselmängd frystes in igen. Värmebehandling. All värmebehandling skedde i vattenbad på samma sätt som vid analys av mjölkprov i ordinarie rutin: Värmning av prov gjordes i provrör i ett vattenbad ställt på 8 C. Temperaturen mättes i ett kontrollrör. När temperaturen nått 79 C i kontrollröret startades klockan med hålltid 0 minuter, varefter rören togs upp och kyldes ned. Sluttemperaturen fick inte överstiga 8 C. Det är viktigt att hela vätskevolymen i rören hamnar under vattenbadets yta. För plattanalyser av träckprov värmebehandlades 0 ml av första spädningen (- ). Resten av spädserien gjordes sedan från det värmebehandlade provet. För MPN-analyser av träckprov och mjölk gjordes värmebehandlingen i rören med medium och paraffin, alltså ingen värmebehandling av enbart spätt prov. Plattspridning träck: Spädningar -, -, -4, -5, -6 Ytspridning (0, ml prov) på torra plattor 7

Inkubering anaerobt, 4 dygn, 7 C Ca 5 kolonier per prov konfirmerades med katalastest Mätområde: x 0 per g 0 8 per g $ Rörmetod träck och mjölk: Träck. 6 rör med 9 ml substrat och ml prov+ 6 rör med 9,9 ml substrat och 0, ml prov från vardera av spädningarna -, -5, -7. (d.v.s. totalt 6 rör per prov.) Pipettering av substrat och prov gjordes manuellt. (detta motsvarar: 6 rör x 0 - ml 6 rör x 0-4 ml 6 rör x 0-5 ml 6 rör x 0-6 ml 6 rör x 0-7 ml 6 rör x 0-8 ml) Mätområde ca x 0 per g 0 8 per g Mjölken analyserades med två metoder - MPN-metodik med MRCM-substrat (6 rör med 9 ml substrat och ml mjölk+6 rör med 9,9 ml substrat och 0, ml mjölk) - MPN-metodik med BBB-substrat (6 x ml + 6x 0, ml som ovan MPN-analyserna gjordes i 6,5 mm rör med tillsats av substrat, prov och paraffinpropp. Inkubering av rören gjordes aerobt men med syreskydd av paraffin (cirka mm hög propp), 4 dygn (96 +/- 4 timmar) vid 7 +/- C. Rör räknades som positiva om paraffinproppen lyfts fullständigt från vätskeytan. Avläsningstabeller finns i bilaga. Repeterbarhet av analysresultat För träck- och mjölkprover från 7 gårdar upprepades analyserna med BBBrörmetoden. Dessa prover hade frysförvarats fram till det andra analystillfället. Medelvärden för de två analystillfällena beräknades liksom repeterbarhetsstandardavvikelsen ( ((x -x ) /*n) ). 95%-iga konfidensintervall för analysosäkerheten beräknades. Statistisk analys Analys (Wilcoxon signed rank test, Spearmans rangkorrelation) gjordes med Systat ver (Systat Software Inc. USA). 8

Resultat och diskussion Mjölkanalys Mjölkproverna analyserades med MPN (rör)-metoden och BBB-substrat eftersom detta är ordinarie rutinmetod i mjölkanalysverksamheten. Dessutom gjordes samma analys med MRCM-substrat. Anledningen till detta var att MRCM tidigare använts som substrat i rutinmetoden för mjölkanalysverksamheten. I Figur jämförs resultaten. Resultaten är angivna i logskala (log -5), vilket motsvaras av 0-00000 sporer/l (se den understa skalan i figuren). Sporhalten i mjölkproverna varierade mellan mindre än 00/l till mer än 0000/l. Om analysmetoderna skulle ge likvärdiga resultat borde lika många punkter ligga på var sida om linjen, men analysvärdena med MRCM är i genomsnitt högre än för BBB (Wilcoxon signed rank test p=0,04). Det är värt att notera att de förhöjda mjölkanalysvärden som uppträdde under 005/006 alltså inte berodde på övergången till ett nytt substrat i mjölkkvalitetsanalyserna. Log sporer/l mjölk (MRCM-substrat) 5 4 4 5 Log sporer/l mjölk (BBB-substrat) 0 00.000 0.000 00.000 Sporer/l mjölk Figur. Jämförelse mellan analysresultat för mjölk med BBB- och MRCM-substrat Träckanalys I den inledande värderingen av träckanalysmetoderna utvärderades förekomst av katalaspositiva kolonier på plattorna samt graden av läsbarhet. BBB-plattor var betydligt lättare att avläsa än MRCM-plattor p.g.a. distinktare kolonier och mindre förekomst av utflytande kolonier (spridare). Katalaspositiva kolonier påträffades endast för ett av 4 prover på BBB-plattor medan för av 4 prover på MRCM-platta fanns det katalaspositiva kolonier. I de flesta fallen understeg andelen sådana kolonier 50% av totalantalet på plattan. Vid jämförelse mellan metoderna (korrelationsanalys och Wilcoxon signed rank test) utvärderades resultaten med och utan korrektion för förekomst av katalaspositiva kolonier. Korrektionen påverkade endast samvariationen mellan de logaritmerade analysvärdena för metoderna marginellt och i det följande anges endast okorrigerade platträkningsdata. 9

Tabell visar samvariationen i mätresultat för de olika träckanalysmetoderna. En hög korrelationskoefficient i tabellen betyder att metoderna samvarierar starkt (värdet kan variera mellan 0 (ingen samvariation) och (perfekt samvariation) eller mellan 0 och - (perfekt samvariation men den ena variabeln har lågt värde när den andra ett högt värde). Det fanns en positiv samvariation mellan samtliga analysmetoder med värden från 0,54 till 0,88. Vid jämförelse mellan mikrobiologiska analysmetoder är det normalt att samvariationen inte är perfekt ens vid jämförelse av samma prover analyserade två gånger med samma metod. Det beror på att mikrobiologiska analysdata alltid är behäftade med en relativt stor analysvariation. Men låg korrelationskoefficient, som t.ex. 0,54, antyder att även andra faktorer bidrar till skillnaden. Den bästa samstämmigheten (korrelationskoefficient 0,88) fanns mellan analys med BBB på platta och i rör (Tabell ). Även rörmetoden för BBB och MRCM (0,80), samt rörmetoden med MRCM och BBB platta (0,74) gav hög samvariation. Tabell. Samvariation i analysresultat för träck (Spearman-korrelationer) BBB platta MRCM platta BBB rör MRCM rör BBB platta.00 MRCM platta 0.6.00 BBB rör 0.88 0.55.00 MRCM rör 0.74 0.54 0.80.00 Figur Jämförelse mellan analysresultat för träck med BBB-medium och -platta respektive rör 7 Log sporer/g träck (BBB-rör) 6 5 4 4 5 6 Log sporer/g träck (BBB-platta) Att samvariation finns mellan analysresultaten med olika metoder behöver inte betyda att samma analysresultat fås med metoderna. Detta illustreras i Figur och. I genomsnitt blev analysvärdena cirka 0,5 logenheter högre i rör än på platta med BBB-medium (fler punkter i Figur ligger ovanför än under linjen). Skillnaden är statistiskt signifikant (Wilcoxon signed rank test p<0,00). Figur visar att plattspridning av träck på BBB och MRCM gav likvärdiga resultat. Punkterna sprider sig likartat kring linjen (Wilcoxon signed rank test p=0,6). 0

6 Log sporer/g träck (MRCM-platta) 5 4 4 5 6 Log sporer/g träck (BBB-platta) Figur Jämförelse mellan analysresultat för träck på platta med BBB- och MRCMmedium. I Tabell visas utvärdering med Wilcoxon signed rank test för samtliga kombinationer av träckanalysmetoder (p-värden). Analysresultaten för BBB i Tabell. Parvisa jämförelser av skillnader i analysresultat för träck med Wilcoxon signed rank test. P-värden <0,05 anger signifikanta skillnader. BBB platta MRCM platta BBB rör MRCM rör BBB platta.00 MRCM platta 0.6.00 BBB rör <0.00 <0.00.00 MRCM rör 0.6 0.047 0.00.00 rör var signifikant högre än för MRCM på platta (Figur 4) och även jämfört med MRCM i rör (Figur 5). Pilarna i Tabell anger vilket substrat som gav högst värde bland de skillnader som var statistiskt signifikanta. Sammanfattningsvis kan sägas att analys med BBB i rör gav högre resultat än analys på platta med båda substraten. BBB i rör gav högre analys värden än MRCM i rör. Den genomsnittliga skillnaden var 0,5 - logenheter. Plattmetoden gav likartat resultat för båda substraten men var lägre än BBB i rör. Valet av träckanalysmetod är därför av betydelse om kvantitativa jämförelser med mjölk ska kunna göras.

7 Log sporer/g träck (BBB-rör) 6 5 4 4 5 6 Log sporer/g träck (MRCM-platta) Figur 4 Jämförelse mellan analysresultat för träck med MRCM-platta och BBB-rör. 7 Log sporer/lg träck (MRCM-rör) 6 5 4 4 5 6 7 Log sporer/g träck (BBB-rör) Figur 5. Jämförelse mellan analysresultat för träck med BBB och MRCM i rör Jämförelser mellan mjölk- och träckanalys Samvariationen i analysresultat mellan de olika träck- och mjölkanalysmetoderna visas i Tabell. Korrelationerna mellan mjölk- och träckresultat var generellt högre för mjölkanalyserna med MRCM än för mjölkanalyser med BBB. Träckanalys med rörmetoden gav högre korrelationer med mjölkanalysresultaten träckanalys med plattspridning. Det är sannolikt att MRCM-metoden gynnar en mera bred grupp av sporbildare i mjölk än BBB eftersom substratet innehåller glykos medan BBB innehåller laktat och håller dessutom ett lägre ph, vilket delvis begränsar vilka sporbildare som kan tillväxa. Träckanalys rapport

Tabell. Samvariation mellan mjölk och träckanalyser (Spearmankorrelationskoefficienter) BBB platta MRCM platta BBB rör MRCM rör BBB mjölk (rör) 0.6 0.6 0.4 0.5 MRCM mjölk (rör) 0.58 0.4 0.75 0.60 Det är dock svårt att enbart med ledning av korrelationskoefficienterna avgöra vilken kombination av analysmetoder som är optimal. Observera att de lägre korrelationerna mellan mjölk och träckanalyser kan ha andra orsaker är skillnader i analysmetod. Mjölkvärdena påverkas också av de åtgärder som görs på gården bl.a. i samband med mjölkning. Träckanalyserna kommer i praktisk tillämpning också att jämföras med ordinarie mjölkanalyser, som görs med BBB i rör. Det är därför rimligt att välja denna metod för mjölkanalyser även vid utredande extraanalyser trots att korrelationskoefficienterna vid jämförelse med träck är lägre. Eftersom träckanalys i rör ger högre värden än på platta och BBB ger högre värden än MRCM i rör, så är det logiskt att även använda BBB i rör för träckanalysen. På detta sätt minimeras de skillnader i analysresultat som beror på valet av analysmetod. I fortsättningen utvärderades därför kombinationen träckanalys med BBB i rör och mjölkanalys med BBB rör. Figur 6 visar utfallet vid analys med den valda metodkombinationen. Figuren har delats i A och B för att lättare kunna se de enskilda gårdarnas värden. Gårdarna har numrerats -4. Linjerna i figuren avskiljer gårdar med låg sporhalt <400/l mjölk (log,6) och gårdar med mer än 000 sporer (log ) per liter. Träckanalysresultaten har delats upp i värden under log 4 (0.000/g), log 4-5, och mer än log 5 (00.000/g). Att döma av dessa resultat klarar flertalet gårdar med mindre än 0.000 sporer/g gödsel att hålla en sporhalt under 400/l. Över denna gräns varierade sporhalten i mjölken i Figur 6A från <00/l till 400/l (log,4). Figur 6A och B. Jämförelse mellan träckanalys med BBB-rör och mjölkanalys med BBB för de olika proverna. 5 Log sporer/l mjölk (BBB-rör) 4 7 9 0 8 9 4 6 8 75 0 6 4 5 4 5 6 7 Log sporer/g träck (BBB-rör) Träckanalys rapport

När sporhalten i träcken översteg log 5 så klarade endast gård (med 6.000 sporer/g gödsel) en sporhalt i mjölken under 400/l. Övriga gårdar hade mer sporer i mjölken. Figur 6B 5 Log sporer/l mjölk (BBB-rör) 4 8 40 6 4 0 4 5 9 4 5 7 4 9 8 4 7 6 4 5 6 7 Log sporer/g träck (BBB-rör) Bland de gårdar som redovisas i Figur 6B finns det flera gårdar med sporhalt i gödseln som översteg 00.000 sporer/g (log 5). Majoriteten av dessa hade mer än 000 sporer/l tankmjölk. Några leverantörer (nr 40, 4, 4) hade mer än 000 sporer/l mjölk trots mindre än 0.000 sporer/g träck. Avvikelser från det allmänna mönstret skulle kunna förklaras med skillnader dels i avtorkningsmetod dels i noggrannhet vid avtorkning. Dessa uppgifter redovisas i Figur 7. Siffrorna vid varje symbol indikerar gårdar med dåliga avtorkningsrutiner (), acceptabla rutiner () och noggranna rutiner (). Figur 7 visar att det är vanligare med fuktig plus torr avtorkning (gröna fyrkanter) när sporhalten i träcken överstiger 0.000-00.000/g (log 4->log 6/g). Vid en sporhalt i träcken <log 4,0 var det vanligare med endast fuktig avtorkning (cirklar). Sporhalten i mjölken var låg (oftast <400/l) även när torr eller fuktig avtorkning med dålig noggrannhet användes. Detta tyder på att flertalet av mjölkgårdarna anpassar avtorkningsrutinerna efter signaler om hög sporhalt i mjölken. I intervallet log 4- log 5 sporer/g träck fanns det leverantörer som använde noggrann fuktig plus torr avtorkning och lyckades understiga 000 sporer/l mjölk. En robotgård (DeLaval-robot) fanns också bland dessa. Där producerades mjölk med mindre än 00 sporer/l. Detta är säkert en effekt av goda rutiner och visar att i detta intervall kan sporhalten sänkas genom effektiv avtorkning. I samma intervall fanns även gårdar med dåliga eller sämre avtorkningsrutiner där mjölkens sporhalt inte understeg 000/l. Noggrannheten vid avtorkning i denna grupp var mindre tillfredsställande och avtorkningsmetoderna inte de bästa. I vissa fall fanns det också smutsiga djur. Enstaka gårdar med torr avtorkning fanns i alla grupperna. Vid sporhalt över log 5 i träcken tillämpade flertalet leverantörer bra avtorkningsmetoder med tillfredställande eller bra noggrannhet men kunde ändå inte sänka sporhalten i mjölken till under 000/l. 4

Denna bild bekräftades av rådgivarnas iakttagelser att flera av dessa gårdar var välskötta. Figur 7. Avtorkningsmetoder och bedömning av noggrannhet för samtliga gårdar. Röd cirkel: avtorkning med torrt papper, blå triangel: fuktig avtorkning, grön fyrkant: fuktig avtorkning följt av torr. Siffrorna står för bedömning av avtorkningsrutinen : Dålig, : tillfredsställande : noggrann. 5 Log sporer/l mjölk (BBB) 4 4 5 6 7 Log sporer g/träck (BBB-rör) 0 00.000 0.000 00.000 miljon 0 miljoner sporer/g Ytterligare två faktorer kan påverka analysresultatet för mjölken. Den ena är analysmetodernas variation. Av Figur 7 kan dras slutsatsen att vid <log 4 sporer/g gödsel bör det inte vara problem att uppnå mindre än log,6 sporer/l mjölk. Några leverantörer hade mera en 000 sporer/l mjölk men mindre än log 4/g träck. Detta kan bero på analysmetodens osäkerhet. Ett ungefärligt 95- igt konfidensintervall för medelvärdet vid en upprepad analys är +/- 0,8 logenheter (se nedan). Det betyder att det sanna värdet för dessa leverantörer skulle kunna vara lägre. Rådgivarna beskrev dock att på dessa tre gårdar fanns det många smutsiga kor, vilket också kan förklara en förhöjd sporhalt. 5

Figur 8. Variation i analysvärden vid upprepad analys för åtta gårdar 5 Log sporer/g mjölk (BBB-rör) 4 7A 7B 9B 9A!5A 4A 4B 4A 6A 4B 5A B 6B 5B A 5B 4 5 6 7 Log sporer/g träck (BBB-rör) Figur 8 visar exempel på repeterbarhet vid upprepad analys av prover från åtta gårdar. Det är viktigt att känna till storleksordningen av variationen i analysresultat för att rätt kunna tolka analysbeskedet. Repeterbarhetsstandardavvikelsen var 0,4 logenheter för mjölk och 0,4 för träck för de 7 prover som analyserades två gånger. Skillnaden var inte statistiskt signifikant och ett genomsnittligt 95%-igt konfidensintervall om 0,8 logenheter har använts i Figur 9 som visar hur analysosäkerheten kan beskrivas grafiskt för mjölk och träck från en gård. Punkten beskriver ett analyssvar där träcken innehöll log 6,0 sporer/g och mjölken log 4, sporer/l. Linjerna från punkten anger de 95%iga konfidensintervallen för analyserna. I 95% av fallen ligger det riktiga analysvärdet det intervall som motsvaras av linjens längd. 6

Figur 9. Grafisk beskrivning av analysosäkerheten (95% konfidensintervall) 5 Log sporer/g mjölk (BBB-rör) 4 4 5 6 7 Log sporer/g träck (BBB-rör) Förekomst av enstaka mycket smutsiga kor eller hög förekomst av många måttligt smutsade kor har också betydelse. Även med en bra och noggrann avtorkningsrutin avlägsnas endast en viss procent av gödseln. För en ko med smutsiga spenar avlägsnas procentuellt sett lika mycket smuts som från en ko med renare spenar vid samma behandling men mängden kvarvarande smuts blir större. En eller flera extremt smutsiga kor bidrar därför mycket mer till tankmjölkens sporhalt än de som är rena. Därför kan det finnas anledning att se över stallrutinerna i övrigt så att korna är så rena som möjligt när de kommer till mjölkning. Detta bekräftades också i rådgivarnas tolkning och kommentarer om gårdarna. I en matematisk simulering där hänsyn togs till variationen i graden av smutsighet hos korna samt variationen i effekten av spenavtorkning med och inom olika metoder visades det att smutsiga kor gav det i särklass kraftigaste bidraget till sporhalten i mjölken (7). En vidareutveckling av simuleringsmodellen modifierad för svenska förhållanden har gjorts och resultaten kommer att redovisas i en separat rapport (A. Christiansson). Vissers utvidgade också simuleringsmodellen till att omfatta en större del hanteringskedjan på gården (8). Resultaten av simuleringarna stöder de slutsatser som dragits i denna rapport. Den absolut viktigaste faktorn som avgör sporhalten i mjölken är sporhalten i ensilaget. Vid låg sporhalt i gödseln (enligt Vissers 000/g) spelar avtorkningsmetoden ingen roll, det går ändå att klara mindre än 000 sporer/l mjölk. Vid högre sporhalt (upp till 00.000/g träck) är valet av spenavtorkningsmetod och noggrannheten i avtorkningen de faktorer som kan användas för att minska mjölkens sporhalt. I simuleringen visas också att smutsiga kor bidrar mest och att en viss effekt kan uppnås genom att hålla undan mjölken från de smutsigaste korna. Vid mer än några 00.000 sporer/g gödsel är det nästan omöjligt att hålla sp0rhalten i mjölken under nivån 000/l (8). 7

Resultat från kompletterande undersökningar Figur 0 visar sporhalter från prov tagna i flytgödselbrunnen hos leverantörer som vid ett flertal tillfällen haft mycket höga sporhalter i mjölken (000 eller 000 sporer/l mjölk) jämfört med sporhalt i flytgödsel från leverantörer som inte haft någon sporanmärkning under säsongen. Resultaten kommer från ett examensarbete vid Lantbruksuniversitet, där man tillämpat de analysmetoder som tagits fram i vårt träckanalysprojekt (6). Siffrorna bekräftar tolkningen ovan: Vid <log 4 sporer/g förekommer i allmänhet inga problem med sporanmärkning för mjölken. Vid log 4-5 sporer/g träck är det möjligt att sänka sporhalten i mjölken med noggranna rutiner. Vid > log 5 sporer/g är det stor risk att avtorkning inte är tillräckligt effektiv för att nå godtagbar sporhalt i mjölken.. Figur 0 Resultat från examensarbetet Log sporer/l mjölk 5.5 5.0 4.5 4.0.5.0.5.0.5 4 5 6 7 Log sporer/g träck Resultat från 4 gårdar med utredning om sporproblem visas i tabell 4. Värdena stämmer in i det allmänna mönstret från Figur 7. För tolkning krävs ytterligare observationer enligt nedan. Tabell 4. analysresultat från andra gårdar Gård nr Log sporer/g träck Log sporer/l mjölk Sporer/g träck Sporer/l mjölk 4., 0 000 0 5., 00 000 000 4.8.7 60 000 500 4 5.5,9 700 000 70 8

Sammanfattande diskussion Det är tydligt att analysvärden för mjölk och träck skiljer sig åt mellan olika metoder och substrat. Det är därför nödvändigt att alla laboratorier som analyserar klostridiesporer i mjölk och träckprover använder sig av samma analysmetod. Mjölkbonden får signaler om hög sporhalt via mjölkkvalitetsanalyserna, som görs med BBB-rörmetoden. Därför är det nödvändigt att mjölkanalysprov som tas ut för jämförelse med träckprov också analyseras med samma metod. Högre korrelationskoefficienter erhölls mellan MRCM-rörmetoden för mjölk och de olika träckanalysmetoderna än när BBBrörmetoden användes. Detta tycks dock vara en artefakt som beror på de systematiska skillnaderna i resultat mellan metoderna. För bästa jämförelse med mjölk bör även träckprov analyseras med BBB-rörmetoden. Även om korrelationskoefficienten mellan träck och mjölk med BBB-rörmetoden kan synas låg så beror detta i hög grad på faktiska förhållanden d.v.s. faktorer på gården (smutsiga djur, avtorkningsmetod och noggrannhet i rutinerna). Träckanalys ska inte ses som en precisionsanalys. Om hänsyn tas till analysvariationen kan rådgivarens egna iakttagelser och bedömningar dock användas för att vägleda bonden om det är lämpligt/möjligt att förbättra stalloch mjölkningshygien eller om ett byte av foder är att föredra. Rekommendationer och tolkningsvägledning Rekommenderad provtagningsrutin: Vid besök på gården tas -4 delprov gödsel från ladugården i en plastburk av den typ som används för mjölkanalyserna. En vanlig plastsked kan användas vid provtagningen. Gödseln ska vara färsk. Vid samma tillfälle tas prov på mjölken med desinficerad skopa eller med bulkotestprovare genom manluckan (tankens omrörare ska ha varit på innan provet tas). Burkarna märks, förseglas väl med tejp och placeras i frys om de inte kan transporteras till laboratoriet omedelbart. Observationer i samband med provtagningsbesöket: Notera vilken metod för rengöring av spenarna som används vid mjölkning (t.ex. torrt papper, fuktigt papper eller duk, fuktig avtorkning följt av avtorkning med torrt papper, eller annan rutin). Bedöm också hur noggrant rengöringen utförs (dåliga, acceptabla eller bra rutiner). Notera och bedöm kornas renhet i stallet. Finns det extremt smutsiga kor? Är många kor måttligt smutsiga? Är korna rena? Analysbesked Begär att få analysresultaten från laboratoriet redovisade både som log-värden och normala värden. Log-värdena behövs för att kunna göra tolkningen nedan, medan det kan vara en hjälp för lantbrukaren att också få de icke logaritmerade siffrorna. Utvärdering av analysresultatet: Rörmetoderna har en ganska stor analysvariation och där för måste man ta hänsyn till detta när man tolkar resultatet. Genom rita in analysresultatet i ett diagram av typ figur 9 ovan så ser man ungefär hur gårdens analysvärden ligger till. Ritar man dessutom ut +/- 0,8 logenheter i vardera riktningen (x och y-led) från punkten så får man 9

en uppfattning om analysvariationens betydelse. Punkten beskriver ett analyssvar där träcken innehöll log 6,0 sporer/g och mjölken log 4, sporer/l. Linjerna från punkten anger de 95%iga konfidensintervallen för analyserna. I 95% av fallen ligger det riktiga analysvärdet inom ett intervall som motsvaras av linjens längd. På så sätt kan man göra en försiktigare tolkning i områdena nära klassgränserna (strecken) i figuren. Tolkning av analysresultat Kontrollera alltid de föregående sporanalysresultaten för gården. En leverantör som historiskt sett har haft flera anmärkningar i klass II eller III i mjölkanalysen har hög sporhalt i mjölken oavsett om analysvärdet för mjölk i samband med träckprovtagningen tillfälligtvis kan ligga lägre. Det är då också rimligt att anta att halten är hög när mjölk och gödselprovet togs ut. På så sätt vinner man säkerhet vad gäller mjölken. För gödselprovet får man ta hänsyn till analysvariationen. Om osäkerheten är stor så föreslå ytterligare en analys. Sporhalt i träck: < log /g och upp till log /g betyder att ensilaget är perfekt. Inga eller mycket få sporer påträffas i ett väl konserverat ensilage. Log -4/g antyder att sporhalten kan ha varit förhöjd i delar av ensilaget. Log 4-5/g: Här finns definitivt ett sporproblem i ensilage Log >5-6/g: Allvarligt sporproblem Genom att ta hänsyn till den avtorkningsmetod som används och noggrannheten vid rengöring av spenarna så kan man ytterligare bedöma möjligheten till förbättringar. Vid medelhög sporhalt i mjölk (över 400/l men inte mer än drygt 000/l)och torr avtorkning kan resultat förbättras genom att byta till fuktig kombinerad med torr avtorkning. Om noggrannheten i rutinerna bedöms som dåliga finns det också en förbättringspotential. Se t.ex. cirklar eller trianglar med siffran eller i figur 7. Däremot är möjligheterna att sänka sporhalten i mjölken till klass för en gård med bästa avtorkningsmetod (kvadrat) och bra rutin () begränsade. På en sådan gård är det bättre att råda till foderbyte om det är möjligt. Ytterligare en faktor som är viktigt att bedöma kornas smutsighetsgrad. En eller flera extremt smutsiga kor bidrar mycket mer till tankmjölkens sporhalt än de som är rena. Därför kan det finnas anledning att se över stallrutinerna i övrigt, samt klippa korna, så att korna är så rena som möjligt när de kommer till mjölkning. Vid sporhalt i träcken upp till några 00.000/g (log 5) kan det dessut0m löna sig att lägga extra energi på rengöringen av de smutsigaste korna. Om sporhalten i träcken är över miljon/g (log 6) så räcker inga åtgärder till för att nå ned till <400/l i mjölken. 0

Referenser. Stadhouders, J., and Spoelstra, S.F. 990. The prevention of the contamination of raw milk by making a good silage. Bulletin of the International Dairy Federation 5:4-.. Herlin, A., and Christiansson, A. 99. Cheese-blowing anaerobic spores in bulk milk from loose-housed and tied dairy cows. Milchwissenschaft 48:686-669.. Stadhouders, J., and K., J. 990. Prevention of the contamination of raw milk by a hygienic milk production. Bulletin of the International Dairy Federation 5:-6. 4. Magnusson, M., Christiansson, A., Svensson, B., and Kolstrup, C. 006. Effect of different premilking manual teat-cleaning methods on bacterial spores in milk. Journal of Dairy Science 89:866-875. 5. Bertilsson, J., Gyllenswärd, M., and Lingvall, P. 996. Factors affecting the contamination of bulk milk with clostridia spores. In Symposium on Bacteriological Quality of Raw Milk. I.D. Federation, editor. Wolfpassing, Austria: International Dairy Federation. -5. 6. Christiansson, A., and Andersson, I. 006. Resultat av ringanalys av klostridiesporer i träck. In Svensk Mjölk Forskning rapport nr 706-I. 7. Van Beynum, J., and Pette, J.E. 95. Zuckervergärung and laktatvergärende Buttersäurebakterien. Zentralblatt für Bakteriologie 9:97-. 8. Crossley, E.L. 94. The routine detection of spore-forming anaerobic bacteria in canned foods. Journal of the Society for the Chemical Industry 60:-6. 9. Bergère, J.L., and Sivelä, S. 990. Detection and enumeration of clostridial spores related to cheese quality. Bulletin of the International Dairy Federation 5:8-. 0. Bourgeois, C.M. 984. Membrane filtration of milk for counting spores of Clostridium tyrobutyricum. Journal of Dairy Science 67:49-499.. Cerf, O., and Bergère, J.L. La enumeration des spores de Clostridium et son application au lait et aux produits laitiers. II. Numeration des différents group de Clostridium. Le Lait 48:50-59.. Fryer, T.F., and Halligan, A.C. 976. The detection of Clostridium tyrobutyricum in milk. New Zealand Journal of Dairy Science and Technology :.. Rosen, B., Mern, U., and Rosenthal, I. 989. Evaluation of clostridia in milk. Milchwissenschaft 44:55-57. 4. Senyk, G.F. 989. Evaluation of methods for determination of sporeformers responsible for the late blowing of cheese. Journal of Dairy Science 7:60-66 5. Klijn, N., Nieuwenhof, F.F., Hoolwerf, J.D., Van der Waals, C.B., and Weerkamp, A.H. 995. Identification of Clostridium tyrobutyricum as the causative agent of late blowing in cheese by species-specific PCR. Applied and Environmental Microbiology 6:99-94. 6. Olsen, A.M., and Scott, W.J. 946. Influence of starch in media used for the detection of heated bacterial spores. Nature 985 7.

7. Beester, H., and Classens, J.W. 970. The effect of various factors on the spore germination and growth of Clostridium butyricum and Clostridium tyrobutyricum Phytopathologia :7-. 8. Bergère, J.L. 969. La germination de la spore de Clostridium tyrobutyricum. Annales de L'Institut de Pasteur 7:79-95. 9. Kaufmann, L., and Weaver, R.H. 960. Use of neutral red fluorescence for the identification of colonies of clostridia. Journal of Bacteriology 79:9-94. 0. Jonsson, A. 990. Enumeration and confirmation of Clostridium tyrobutyricum in silages using neutral red, D-cycloserine and lactate dehydrogenase. Journal of Dairy Science 7:79-75.. Bergère, J.L., and Favreau, B. 987. Immunodetection des spores de Clostridium tyrobutyricum agent du gonglement butyrique des fromages.. Christiansson, A., Ollermark, I., and Bergman, M. 99. Utvärdering av ett ELISA-kit för konfirmering av Clostridium tyrobutyricum i MPN(rör)- system med hjälp av antikroppar mot vegetativa celler. In Rapport från Svensk Mjölk Forskning nr 4889.. Herman, L.M.F., De Block, J.H.G.E., and Waes, G.M.A.V. 995. A direct PCR detection method for Clostridium tyrobutyricum in up to 00 milliliters of raw milk. Applied and Environmental Microbiology 6:44-446. 4. Klijn, N. 994. Identification of Clostridium tyrobutyricum and related species using sugar fermentation, organic acid formation and DNA probes based on specific 6S rrna sequences 5. Knabel, S. 997. Identification of Clostridium butyricum Cl. sporogenes and Clostridium tyrobutyricum by hybrization with 6S rrna-targeted oligonucleotide probes. 6. Johansson, H. 007. Dokumentation av ensilering med fokus på clostridiesporer i mjölk. In Sveriges Lantbruksuniversitet. Uppsala: Institutionen för Husdjurens Utfodring och Vård. Examensarbete 6. 7. Vissers, M.M.M., Magnusson, M., Christiansson, A., and Te Giffel, M.C. 005. Improving farm management by modelling teat cleaning applied to reduce the contamination of raw milk with bacterial spores. In Proceedings of the Third Intenational Symposium of Modelling as an Innovative Technology in the Agri-Food Chain. M.I.A.T.M. Hertog, and B.M. Nicolaie, editors: Acta Horiculturae 674:. 49-55. 8. Vissers, M.M.M., Driehuis, F., Te Giffel, M.C., De Jong, P., and Lankveld, J.M.G. 006. Improving farm management by modelling the contamination of farm tank milk with butyric acid bacteria. Journal of Dairy Science 89:850-858.

Bilaga A MPN-tabell för analys av 6* + 6*0, mjölk Antal positiva rör MPN MPN ml 0. ml Sporer/l Log sporer/l 0 0 75 0 5. 0 08.5 0 64..5 504.7 0 6.6 550.7 744.9 0 606.8 86.9 055.0 95. 4 0 9.0 4 0. 4 494. 4 807. 5 0 47. 5 798. 5. 5 76.4 5 4 6.5 5 5 405.6 6 0 98.4 6 57.5 6 46.7 6 70.8 6 4 0990 4.0 6 5 798 4.

Bilaga B. MPN-tabell för analys av träck Antal positiva rör i spädning MPN MPN - -4-5 Sporer/g Log sporer/g 0 0 0 75.9 0 0 50. 0 0 5. 0 0.5 0 0 05.5 0 0 6. 0 6.5 0 9.5 495.7 0 499.7 667.8 0 67.8 0 0 57.6 0 59.7 0 544.7 79.9 98.0 0 76.9 96.0 0 94.0 8. 4 0 8. 0 0 599.8 0 807.9 0 0.0 0 85.9 0.0 5. 0 04.0 65. 49. 0 78. 509. 4 0 56. 4 0 0 98.0 4 0 70. 4 0 4. 4 0 84. 4 45. 4 79. 4 0 469. 4 75. 4 047. 4 0 775. 4 076. 4 9.4 4 4 0 06. 4 4 48.4 4

4 5 0 465.4 5 0 0 89. 5 0 70. 5 0 00. 5 0 759. 5 8. 5 55.4 5 0 79. 5 605.4 5 07.5 5 0 66.4 5 45.5 5 675.6 5 4 0.5 5 4 774.6 5 4 474.6 5 5 0 88.6 5 5 4509.7 6 0 0.4 6 0 984.5 6 0 850.6 6 0 096.5 6 4044.6 6 505.7 6 686.8 6 0 47.6 6 5709.8 6 7489.9 6 9456 4.0 6 4 5 4. 6 0 67.8 6 88.9 6 0554 4.0 6 955 4. 6 4 5478 4. 6 4 0 98 4.0 6 4 08 4. 6 4 496 4. 6 4 807 4. 6 4 4 466 4. 6 4 5 554 4.4 6 5 0 47 4. 6 5 798 4. 6 5 8 4. 6 5 759 4.4 6 5 4 6 4.5 6 5 5 4048 4.6 6 6 0 979 4.4 6 6 570 4.5 6 6 468 4.7 6 6 700 4.8 6 6 4 09895 5.0 6 6 5 7976 5. 6 6 6 585 5.6 5

SVENSK MJÖLK FORSKNING Telefon: 077 9900 E-post: fornamn.efternamn@svenskmjolk.se