Laboration Enzymer. Labföreläsning. Introduktion, enzymer. Kinetik. Första ordningens kinetik. Michaelis-Menten-kinetik



Relevanta dokument
Laboration Enzymer. Maria Svärd Molekylär Strukturbiologi, MBB, KI

Biologisk katalysator

Lite basalt om enzymer

Enzymer Farmaceutisk biokemi. Enzymet pepsin klyver proteiner i magsäcken till mindre peptider

Enzymkinetik. - En minskning i reaktantkoncentrationen per tidsenhet (v = - A/ t)

Kinetik. Föreläsning 4

dess energi ökar (S blir mer instabilt) TS sker tidigare i reaktionen strukturen på TS blir mer lik S (2p).

BIMA15 HT Säkerhetsföreskrifter och kompletterande laborationer 1

Avsnitt 12.1 Reaktionshastigheter Kemisk kinetik Kapitel 12 Kapitel 12 Avsnitt 12.1 Innehåll Reaktionshastigheter Reaktionshastighet = Rate

Kapitel 12. Kemisk kinetik

Arbete A3 Bestämning av syrakoefficienten för metylrött

Hastighet HOCH 2. *Enzymer är Katalysatorer. *Påverkar inte jämvikten

BIMA12/13 ht 2012, Introduktionslab. 1. Teoretisk introduktion till laborativt arbete

Kemisk Dynamik för K2, I och Bio2

Tentamen i Kemi för miljö- och hälsoskyddsområdet: Allmän kemi och jämviktslära

Bestämning av hastighetskonstant för reaktionen mellan väteperoxid och jodidjon

Energi, katalys och biosyntes (Alberts kap. 3)

Institutionen för laboratoriemedicin Bilaga 2 Biomedicinska analytikerprogrammet Analytisk Kemi och Biokemisk metodik Ht 2010, Termin 3

Uppsala Universitet Institutionen för fotokemi och molekylärvetenskap EG FH Konjugerade molekyler

På samma sätt ges ph för en lösning av en svag bas och dess salt av:

2BrO 2 (mycket snabb) Härled, med lämpligt valda approximationer, uttryck för (a) förbrukningshastigheten

Kinetik, Föreläsning 1. Patrik Lundström

Kinetik. Föreläsning 2

Fysikalisk kemi KEM040. Clausius-Clapeyronekvationen Bestämning av ångtryck och ångbildningsentalpi för en ren vätska (Lab2)

Bestämning av fluoridhalt i tandkräm

Skrivning i termodynamik och jämvikt, KOO081, KOO041,

Kemiska reaktioner och reaktionshastigheter. Niklas Dahrén

Kinetik. Föreläsning 1

Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området

Laborationsrapport glattmuskel basgrupp 7

EXPERIMENTELLT PROV ONSDAG Provet omfattar en uppgift som redovisas enligt anvisningarna. Provtid: 180 minuter. Hjälpmedel: Miniräknare.

1. a) Markera polära och icke-polära delar i nedanstående molekyl. Vilken typ av ämne är det, och vad heter molekylen? (2p)

SPEKTROFOTOMETRISK BESTÄMNING AV KOPPARHALTEN I MÄSSING

Kemisk reaktionskinetik. (Kap ej i kurs.)

Preparation och spektroskopisk karakterisering av Myoglobin

Kinetik, Föreläsning 2. Patrik Lundström

KEM A02 Allmän- och oorganisk kemi. KINETIK 2(2) A: Kap

Arbete TD5 Bestämning av transporttal

Bestäm koncentrationen av ett ämne med spektrofotometri. Niklas Dahrén

Koncentrationsbestämning med hjälp av spädningsteknik och spektrofotometri

Bestämning av livslängden för singlettexciterad naftalen

Tentamen i Kemisk reaktionsteknik för Kf3, K3 (KKR 100) Fredagen den 22 december 2006 kl 8:30-12:30 i V. Man får svara på svenska eller engelska!

Räkneuppgifter i Vattenreningsteknik - 2

Reaktionskinetik...hur fort går kemiska reaktioner

TENTAMEN I INTRODUKTION TILL BIOMEDICIN FREDAGEN DEN 9 OKTOBER 2009 kl Efternamn: Mappnr: Förnamn: Personnr:

Matematikcentrum 1(4) Matematisk Statistik Lunds Universitet MASB11 HT10. Laboration. Regressionsanalys (Sambandsanalys)

Bestämning av hastighetskonstant och aktiveringsenergi för reaktionen mellan väteperoxid och jodidjon i sur lösning Jodklockan

LAB 11 STUDIER AV TEMPERATUR OCH

Syra/bas och Energi Kurskod 1BA001

Kvantbrunnar -Kvantiserade energier och tillstånd

KEM A02 Allmän- och oorganisk kemi. KINETIK 1(2) A: Kap

Kap 2 Reaktionshastighet. Reaktionshastighet - mängd bildat eller förbrukat ämne per tidsenhet

Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området

Kinetik. Föreläsning 3

Kvantbrunnar Kvantiserade energier och tillstånd

KINETIK 1(2) A: Kap Vad är kinetik? 14.1 Koncentration och reaktionshastighet. KEM A02 Allmän- och oorganisk kemi

c) Hur förskjuts jämvikten av en tryckförändring? Motivera svaret. (2) Jämvikten förskjuts åt vänster om trycket ökar:

Kapitel Kapitel 12. Repetition inför delförhör 2. Kemisk kinetik. 2BrNO 2NO + Br 2

Kapitel Repetition inför delförhör 2

Linköpings universitet 2007 IFM-Kemi. Enzymkinetik. enzymet mättat på substrat. Hastigheten maximal = V max.

Bestäm koncentrationen av ett ämne med UV/Vis-spektrofotometri. Niklas Dahrén

LAB 12. Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli

BASÅRET KEMI B BIOKEMI VT PROTEINER OCH ENZYMER (sid )

Meddelande. Föreläsning 2.5. Repetition Lv 1-4. Kemiska reaktioner. Kemi och biokemi för K, Kf och Bt 2012

Schema Kemins grunder 15hp (KZ2007), VT2015 Institutionen för Material- och Miljökemi

Tentamen i Materia, 7,5 hp, CBGAM0

Sluttentamen Biokemi KE7001p3, 22 mars 2005, Max poäng = 70 p. Preliminär gräns för godkänd = 37 p (53 %).

Konc. i början 0.1M 0 0. Ändring -x +x +x. Konc. i jämvikt 0,10-x +x +x

SPEKTROSKOPI (1) Elektromagnetisk strålning. Synligt ljus. Kemisk mätteknik CSL Analytisk kemi, KTH. Ljus - en vågrörelse

Farmakodynamik och Farmakokinetik

I en utspädd sur lösning faller sackaros sönder enligt följande reaktion: När man följde reaktionen som en funktion av tiden erhölls följande data:

Experiment Swedish (Sweden) Studsande kulor - En modell för fasövergångar och instabiliteter

TENTAMEN för KMB056 - Molekylär Bioteknik

TILLÄMPAD ATOMFYSIK Övningstenta 2

Absorbansmätningar XXXXXX och YYYYYY

Föreläsning 12. Alkener III Kapitel 12 F12

a) 55,8 g/mol b) 183,8 g/mol c) 255,6 g/mol d) 303,7 g/mol 2. Galliumnitrid används i lysdioder. Vilken kemisk formel har galliumnitrid?

Tentamen i Allmän kemi 7,5 hp 5 november 2014 ( poäng)

Laboration 4 R-versionen

Fysikaliska modeller

Analytisk kemi. Kap 1 sid 15-22, Kap 9 sid

Tentamen i Modern fysik, TFYA11, TENA

UV-reaktor. Katja Eriksson. Handledare: Hannah Heidkamp. Karlstads universitet

Isolering och rening av proteinet tiopurinmetyltransferas

Översikt metodprinciper Allmänkemianalyser. Carl-Eric Jacobson Klinisk kemi Sahlgrenska Universitetssjukhuset

ETT EXEMPEL PÅ PROTEINKRISTALLISERING

Introduktion till laboration Biokemi 1

NUKLEINSYRORNAS UPPBYGGNAD: Två olika nukleinsyror: DNA deoxyribonukleinsyra RNA ribonukleinsyra

Sluttentamen Biokemi BI1032, 14:e januari 2010, Max = 100 p. Preliminära gränser: 3 = 55p; 4 = 70p; 5 = 85p.

Fotoelektriska effekten

Sluttentamen Bke2/KE0003, 29:e Oktober 2003, Max poäng = 94 p. Preliminär gräns för godkänd = 50 p (53 %).

Kemisk jämvikt. Kap 3

Idealgasens begränsningar märks bäst vid högt tryck då molekyler växelverkar mera eller går över i vätskeform.

Exoterma och endoterma reaktioner. Niklas Dahrén

A12. Laserinducerad Fluorescens från Jodmolekyler

Godkänt-del A (uppgift 1 10) Endast svar krävs, svara direkt på provbladet.

Del I: Digitala verktyg är inte tillåtna. Endast svar krävs. Skriv dina svar direkt i provhäftet.

Tentamen i Allmän farmakologi, 2 hp

Schema Kemi för geovetare 15hp (KZ2003), VT 2013 Institutionen för Material och Miljökemi

Halogenlampa Spektrometer Optisk fiber Laserdiod och UV- lysdiod (ficklampa)

Transkript:

Labföreläsning Maria Svärd maria.svard@ki.se Molekylär Strukturbiologi, MBB, KI Introduktion, er och kinetik Första ordningens kinetik Michaelis-Menten-kinetik K M, v max och k cat Lineweaver-Burk-plot Inhibering kompetitiv och icke-kompetitiv Spektrofotometri och Lambert-Beers lag Laborationsgenomgång Enzymet Labmoment Labredogörelsen Säkerhet på lab Introduktion, er Kinetik Enzymer är biologiska katalysatorer som kännetecknas av Katalytisk effektivitet Specificitet Reglerad aktivitet Enzymkatalyserade reaktioner påverkas av Koncentration av och reaktanter Temperatur ph Hämmare/aktivatorer G (fri energi) S P Aktiveringsenergi utan med Kinetik är studier av reaktioners hastigheter Enzymkinetik = reaktionshastighet i atiskt katalyserade reaktioner Bestämning av kinetiska parametrar mått på aktivitet Nollte ordningens kinetik hastigheten oberoende av koncentrationen v=k* 0 Första ordningens kinetik hastigheten proportionell mot koncentrationen v=k* Första ordningens kinetik Michaelis-Menten-kinetik Reaktionshastigheten proportionell mot koncentrationen av Då man studerar atiskt katalyserade reaktioner ser man ofta följande karakteristiska beteende : S k P 0:e ordningens kinetik v oberoende av (mättnad) v d[p] d k dt dt lutning=k [M] :a ordningens kinetik [M]

Michaelis-Menten-kinetik Michaelis-Menten-kinetik Michaelis och Menten (93) ställde upp följande modell för att förklara experimentella data: (Analysen modifierad av Briggs och Haldane 925) k k 4 v =v max K M Michaelis-Mentens ekvation k Två antaganden behöver göras: Tillbakareaktionen k 4 försummas (initiala hastigheten) [ES] är oförändrad steady state k 4 där: v max =. [E tot ] maximala reaktionshastigheten och K M = ( + )/k totala koncentrationen ets omsättningstal=k cat Michaelis konstant om >> så är K M ~ /k = K eq (dissociationskonstanten för E + S ES) dvs ets affinitet för et Michaelis-Menten-kinetik Lineweaver-Burk-plot v =v max K M Om man inverterar Michaelis-Menten-ekvationen får man en ekvation för en rät linje. Vi ser att då = K M så är v=v max /2 (?)v max v v v KM max max y = a + k x v max /2 Plottar man sina uträknade mätdata /v som funktion an / får man en Lineweaver-Burk-plot, ur vilken K M och v max lätt kan bestämmas. 0 =K M 0 [M] Lineweaver-Burk-plot Inhibering av aktivitet [min/mol] v v v v KM max max Kompetitiv Icke kompetitiv K M v max 0 [(M) - ] 2

Kompetitiv inhibering Kompetitiv inhibering Substratet och hämmaren tävlar om att binda till samma säte på et. Reaktionsschema k +I EI v = vmax + K ' M, K' > K M M Kompetitiv inhibering Icke-kompetitiv (noncompetitive) inhibering Grafiskt: v [min/mol] Substrat och hämmare binder oberoende av varandra till olika säten på et. [M] [(M) - ] KM K M v max oförändrat, K M blir större Icke-kompetitiv inhibering Icke-kompetitiv inhibering Reaktionsschema: Grafiskt: k +I +I EI + S v = v ' max ESI + K M, v ' max < vmax [M] v max K M oförändrat, v max blir mindre v [min/mol] v max [(M) - ] 3

Spektrofotometri Spektrofotometri Hur mäter man hastigheten i kemiska reaktioner? En metod är absorptionsspektroskopi spektrofotometri Olika molekyler har olika absorptionsspektrum Absorption av synligt ljus och UV-ljus i en molekyl uppkommer genom excitation av elektroner till nya (högre) energinivåer i de kemiska bindningarna. Ljus av en viss våglängd/energi absorberas när energin motsvarar skillnaden mellan två energinivåer. Absorbans Våglängd [nm] högre energi Spektrofotometri Spektrofotometri Spektrofotometern Absorberande prov med längd l I 0 I l Transmittans: T = I I 0 Absorbans A = -log(t) = - log I = log I 0 I I 0 Praktiskt: Absorbansområdet man mäter inom är ca 0.-. T : 0 Om för högt: SPÄD och mät igen! Om för lågt: gör om för god noggrannhet. A : 0 Lambert-Beers lag Laborationen Lambert-Beers lag: I = I c 0 0- l = molära absorptionskoefficienten l = provets längd c = provets koncentration I = 0- l c A = lc I0 Enzym: Alkaliskt fosfatas Dimer Finns normalt i tunntarmen Klipper bort fosfatgrupper från organiska molekyler Isolerat från ko, men finns också hos människa http://www.rcsb.org PDB id zed Om vi mäter A och känner och l, så kan vi beräkna koncentrationen (c). 4

Laborationen NO 2 OPO - 2 3 + H 2 O Alkaliskt fosfatas NO 2 OH + PO 3-4 + H + Mål: NFF Studera reaktionen (kinetik) Bestämma K M v max ph-optimum Hämningstyp Förstå fotometrins principer para-nitrofenol Labseminarium/genomgång med amanuenser. Förbered svar på frågorna i kompendiet. Kom i tid! Pipetteringsövning. Bestämning av absorptionsmaximum för paranitrofenol (produkten) Beräkning av den molära absorptionskoefficienten, ε Våglängdsscanning 340-650 nm Absorbans A max 2. Effekten av inkubationstid på mängd bildad produkt X 9 (olika inkubationstid) H 2 O NFF buffert Inkubation vid 40 C (börja med att starta 20 min) Tillsätt stopplösning efter 0.5-20 min Läs absorbans inom 5 min max Våglängd [nm] Bestäm våglängden max då absorptionen är maximal. Beräkna vid denna våglängd. + + vatten Rita graf (mängd bildad produkt mot tid) 3. Bestämning av reaktionshastigheten som funktion av ph X 9 (ökande buffert-ph) H 2 O NFF buffert + + vatten 0 min vid 40 C Tillsätt stopplösning Läs absorbans (produkt) Räkna ut mol produkt bildad/min inkubation. Rita graf. 4. Bestämning av K M och v max för et, samt bestämning av hämningstyp X 6 (ökande ) A B C D A B + hämmare (konc. ) C + hämmare (konc. 2) D blankserie /v [min/mol] 0 [M] Rita M-M- och L-B-kurvor. Bestäm därur K M, v max och hämningstyp. Bestäm även K M och v max m.h.a. icke-linjär regression. / 0 [M - ] 5

Labrapport 5. Räkneuppgift med et alkoholdehydrogenas Bestäm K M, v max och hämningstyp utifrån värden i labkompendiet Lineweaver-Burk Icke-linjär regression Beräkna promillehalt En rapport per grupp Inlämning senast 6.00 måndag 27/9 Rättning klar senast 6.00 fredag /0 Inlämning via e-post till respektive amanuens Skicka mailet till alla i labgruppen Kopia till maria.svard@ki.se Labrapport Säkerhet på lab Labrapporten ska vara kortfattad och innehålla följande: Titelsida med sammanfattning Introduktion Resultat (se labkompendium) Diskussion Bilagor med originaldata Ange de samband ni har använt vid beräkningarna, visa räkneexempel. Glöm ej att ange enheter i era uträkningar och på axlarna i era grafer. Labrock (skyddsglasögon, handskar) Ej äta eller dricka på lab Munpipettering är förbjuden! Förebygg olyckor Var väl förberedd Arbeta lugnt När man lämnar lab Tvätta händerna Tag av labrocken Använd ditt omdöme! Vi ses på labbet! 6