Kompendium i Bakteriologi

Transkript

1 Kompendium i Bakteriologi Karolinska Institutet Institutionen för mikrobiologi, tumör- och cellbiologi Vårterminen 2008

2 1. BAKTERIESYSTEMATIK Taxonomi (kommer från grekiska orden taxos = ordning och nomos = lag) kallas den vetenskap som arbetar med att klassificera och ge namn åt olika organismer. Ett idealiskt klassificeringssystem bör bygga på släktskap mellan organismer som vi ser dem idag, samt också spegla deras evolutionära (fylogenetiska) ursprung. Även om vi idag kan se tydliga spår av bakteriers verksamhet i tidigare tidsåldrar (exempelvis i form av fossila bränslen) så finns det inte några fossila lämningar av bakterieceller som vi kan studera för att bestämma det fylogenetiska ursprunget till olika bakteriegrupper. Därför har bakterietaxonomin varit hänvisad till att klassificera bakterier genom att bestämma egenskaper som nu finns hos bakterierna. Detta kallas ett fenetiskt klassificeringssystem. Fig 1.1 2

3 Bakteriers indelning De encelliga organismerna kan inte hänföras vare sig till växtriket (Plantae) eller djurriket (Animalia), varför de flesta läroböcker hänför de encelliga organismerna till ett eget rike, (Protista). Detta rike indelas i eukaryoter och prokaryoter. Till eukaryoter hör protozoer, alger och svampar. De kännetecknas alla av att kärnan är omsluten av ett kärnmembran, samt att de har olika typer av cellorganeller, t ex mitokondrier. Till prokaryoter, som saknar egentlig kärna och inte har några distinkta cellorganeller, hör bakterier och eventuellt virus. Moderna molekylärbiologiska tekniker har på senare tid visat att bakterier i själva verket består av två helt olika grupper av organismer eubakterier och archaebakterier. Till archaebakterierna, som skiljer sig från eubakterierna i ett flertal fundamentala egenskaper, hör bl a metanogena, termofila och halofila bakterier, medan eubakterierna omfattar alla medicinskt intressanta bakteriegrupper. Det finns 11 huvudgrupper (ordningar) av eubakterier. Huvudgrupperna delas sedan upp i familjer, som i sin tur indelas i genus och slutligen arter. Arterna namnges med genus- och speciesnamn enligt det namnsystem som infördes av Linné. Genusnamnet skrivs med stor första bokstav och species med små bokstäver, exempelvis Staphylococcus aureus. Om samma bakterienamn förekommer många gånger i en text skriver man ofta ut bara första bokstaven i genusnamnet, t ex S. aureus. Tabell 1.1 Indelning av bakterier PROKARYOTER ORDNING ex Eubacteriales FAMILJ ex Enterobacteriaceae GENUS ex Escherichia SPECIES ex E. coli SEROTYP, BIOTYP, FAGTYP etc ex E. coli K1, (med kapseltyp 1) KLON Ex E.coli stam MC1061 3

4 2. BAKTERIERS MORFOLOGI OCH KEMISKA SAMMANSÄTTNING Bakterier är encelliga organismer. Till formen är de flesta stavformiga (raka, böjda eller spiralformade) men det förekommer också sfäriska fbakterier, så kallade kocker ( jfr Staphylococcus, Streptococcus). Bakterier är mycket mindre än växt- och djurceller (s.k. eukaryota celler. De flesta kocker har en diameter på ca 1µm. Diametern på stavformiga bakterier är ofta inte mer än 0,5 µm medan längden kan variera från 1,5 upp till 20µm. De allra minsta bakterierna, Mycoplasma, är inte mer än 0,2-0,3 µm i diameter och utgör de minsta cellulära livsformerna vi känner till. Bakterier, är enklare uppbyggda än eukaryota celler och benämns som prokaryota celler. Deras arvsmassa (kromosom) omges inte av något kärnmembran, och de saknar fleras andra strukturer så som mitokondrier och endoplasmatiskt retikel. Skillnaderna mellan prokaryota och eukaryota celler sammanfattas i Tabell 2.1. Tabell 2.1 prokaryota eukaryota Antal kromosomer 1(2) 3 el fler Kromosom omgiven av kärnmembran - + Histoner associerade med kromosomerna - + Mitokondrier - + Vakuoler för upplagring av näring - + Golgi-apparat - + Endoplasmatiskt retikel - + Bakterier karakteriseras av att de har en mera komplex ytstruktur än t ex animala celler. De omges, med undantag för Mycoplasma, av en rigid cellvägg som är belägen utanför cytoplasmamembranet. Cellväggen ger bakterierna många av deras karakteristiska egenskaper såsom förmåga att överleva i mycket varierande osmotiska miljö och resistens mot mekanisk påverkan. Cellväggen bestämmer också bakteriecellens form och färgbarhet, samt den antigena specificiteten. Dessutom har cellväggens kemiska sammansättning betydelse för bakteriens känslighet för antibiotika och vissa desinfektionsmedel. Cellväggens sammansättning har hos de flesta bakteriearter stor betydelse för deras virulens. Morfologi När man studerar bakterier i vanligt ljusmikroskop ser man inte mycket av deras finstruktur. Begränsningen ligger i mikroskopets upplösningsförmåga som maximalt kan bli ca 0.2µm. Vanligt ljusmikroskop har trots detta stor betydelse inom bakteriologin då klassificering av bakterier i stor utsträckning bygger på skillnader i storlek, form och färgbarhet. Vid diagnostiskt arbete studeras främst färgade bakterier intorkade på ett objektglas. Bakterier färgas bästa med basiska färgämnen. Dubbelfärgning enligt den danske bakteriologen Gram (1884) tillåter indelning av bakterier i Gram-positiva och Gram-negativa. Denna indelning är 4

5 av grundläggande betydelse för diagnostiken och det föreligger dessutom viktiga biokemiska och fysiologiska skillnader mellan bakterier med olika färgbarhet i gramfärgning. Gramfärgning. För att färga bakterier enligt Gram fixeras de intorkade bakterierna med värme genom att föra in objektglaset i en låga under ca en sekund. Därefter färgas preparatet med kristallviolett (ett basiskt anilinfärgämne) som ger alla bakterier en blåviolett färg. Preparatet behandlas därefter med aceton/etanol varvid en del bakterier avfärgas (Gramnegativa) medan de övriga behåller sin blå färg (Gram-positiva). Slutligen färgas preparatet med fuksin (ett rött basiskt färgämne) som ger avfärgade bakterier en röd färg. Gram-positiva bakterier blir alltså blåvioletta medan Gram-negativa blir röda vid gramfärgning. Mikroskopi. Levande ofärgade bakterier kan studeras med hjälp av faskontrastmikroskop eller mörkfältsmikroskop. För att studera bakteriecellers finstruktur krävs elektronmikroskopi. Bakterier indelas efter sin form i stavar (cylindriska), kocker (sfäriska) och spiralformade (spiriller och spirocheter). Många bakterier har mycket varierande utseende beroende på odlingsbetingelserna. Sådana bakterier brukar kallas pleomorfa eller polymorfa. Vanligen kan man emellertid lätt klassificera en bakterie som tillhörande en av de morfologiska huvudtyper, som visas i Fig 2.1. Fig 2.1 Olika bakteriegruppers mikroskopiska morfologi I Fig. 2.2 visas en schematisk bild av en stavformig bakterie så som den ser ut om man studerar ett snitt i elektronmikroskopet. Den innehåller en kärnekvivalent, cytoplasma med ribosomer och ibland inklusionskroppar, cytoplasmamembran, cellvägg, kapsel, pili och ofta flageller. 5

6 Fig 2.2 Schematisk bild av en stavformig bakteries cellmorfologi Cytoplasmamembranet Bakterier cytoplasmamembran skiljer sig inte från andra biologiska membraner vad beträffar den principiella uppbyggnaden. Cytoplasmamembranet är en semipermeabe barriär som selektivt bestämmer vilka lösliga substanser som skall tas upp respektive utsöndras. Specifika transportsystem för olika näringsämnen (t ex aminosyror, socker) är knutna till membranet liksom enzymer involverade i cellväggssyntesen. Dessutom har cytoplasmamembranet hos bakterier en liknande funktion som mitokondrierna hos eukaryota celler: det är säte för elektrontransport och oxidativ fosforylering. Cellväggen Cellväggen hos bakterier är ett fast skal som ger bakteriecellen dess form. Vissa antibiotika, däribland penicillin, verkar genom att hämma syntesen av specifika cellväggskomponenter. Cellväggen kan försvagas genom odling i närvaro av låga penicillinkoncentrationer, men också genom inverkan av enzymer. Då får man en sfärisk cell omgiven endast av cytoplasmamembranet, eventuellt med små rester av cellväggen kvar. Dessa sfäriska celler fungerar metaboliskt men är osmotiskt fragila, dvs måste ha en lämplig osmotisk miljö (0.5-1 M sackaros) för att hålla, men brister om de suspenderas i en buffer med låg salthalt. Gram-positiva bakterier. Cellväggen hos Gram-positiva bakterier varierar kraftigt i tjocklek: den kan utgöra ända upp till 25 % av bakteriens vikt och vara upp till 80nm, men tjockleken kan också vara betydligt mindre, ca 15nm och utgöra endast 10% av vikten. Den består av två huvudkomponenter, mukopeptiden (peptidoglykan) och teikonsyra, plus andra proteiner och polysackarider beroende på bakteriearten. Den dominerade komponenten i den Gram-positiva cellväggen är mukopeptiden (Fig 2.3), som består av ett nätverk av polysakaridkedjor, sammanbundna med korta peptider. Polysackarid-delen innehåller N- acetylmuraminsyra och N-acetylglukosamin. Polysackariddelen tycks vara gemensam för hittills undersökta bakterier medan sammansättningen av den tetrapeptid som sticker ut från N-acetylmuraminsyran varierar mellan olika species. Tetrapeptiden är hos Staphylococcus aureus sammansatt av, från muraminsyran räknat, L-alamin, D-glutaminsyra. L-lysin och D- alanin. Tvärbryggan består hos samma bakterie av en pentaglycin som sammanbinder den fjärde aminosyran med aminosyra nr tre i en närliggande tetrapeptid. Mukopeptiden hos olika 6

7 bakterier skiljer sig också med avseende på antalet muraminsyramolekyler som är substituerade med en peptidkedja, liksom frekvensen av tetrapeptidkedjor som sammanbundna med varandra. Hos Staphylococcus aureus är praktiskt taget alla muraminsyramolekyler försedda med tetrapeptid och ca 90 % av dessa är sammanbundna med varandra med en pentaglycinkedja. Detta göra att stafylokocker har en ovanligt tät och rigid cellvägg som därigenom har en stor mekanisk hållbarhet. Fig 2.3 Mukopeptiden hos Staphylococcus aureus Hos de Gram-positiva bakterierna finns förutom mukopeptiden en annan cellväggskomponent, teikoinsyra. Denna kan ha olika sammansättning hos olika species och utgör polymerer av antingen glycerolfosfat eller ribitolfosfat, till vilka olika socker, aminosocker och aminosyror är kopplade. Teikoinsyra är kovalent bunden till N- acetylmuraminsyra i mukopeptiden men förekommer också i en form som är förankrad i cytoplasmamembranet med hjälp av fettsyror bundna till teikoinsyran (s.k. lipoteikoinsyra). Teikonsyror finns endas hos Gram-positiva bakterier och utgör ofta dominerande antigen på bakteriens yta. Gram-negativa bakterier. Cellväggen hos Gram-negativa bakterier är som regel tunnare (ca 10nm) än hos de Gram-positiva, men är trots detta mera komplext uppbyggd. Gram-negativa bakterier har liksom de Gram-positiva ett skikt av mukopeptid som står för den mekaniska hållfastheten. Hos de Gram-negativa bakterierna är dock mukopeptidskiktet mycket tunnare än hos de Gram-positiva. Uppbygganden av mukopeptiden är i princip densamma som hos Gram-positiva, men aminosyrasammansättningen är ofta en annan. Utanför mukopeptiden finns hos Gram-negativa bakterier ett yttre membran som består av fosfolipid- 7

8 proteinkomplex. Det yttre membranet är sammanbundet med mukopeptiden genom ett lipoprotein, vars lipiddel sitter i den lipofila delen av det yttre membranet. På utsidan av det yttre membranet finns en lipopolysackarid, vars lipiddel, som kallas lipid A, är förankrad i yttre membranets lipofila del. Lipopolysackariden är toxisk och utgör det så kallade endotoxinet. Fig 2.4 Schematisk bild av den Gram-negativa cellväggens uppbyggnad LPS Lipopolysackariden har stor betydelse för de Gram-negativa bakteriernas patogenitet. Polysackariddelen står för antifagocytära egenskaper samt har de dominerande antigena egenskaperna, medan lipid A står för de toxiska egenskaperna. Lipid A är starkt pyrogen samt har i kombination med andra delar av cellväggen en rad biologiska effekter. Polysackariddelen av LPS utgör ett värmestabilt antigen som kallas för O-antigen. Tillsammans med det flagellära H-antigenet ligger O-antigenet till grund för den serologiska indelningen av många tarmbakterier, t.ex. Salmonella. Tabell 2.4 Egenskaper hos bakterier som har samband med deras Gram-färgbarhet Egenskap Gram-positiva Gram-negativa Känslighet för penicillin G och V + - Tjocklek hos cellväggen 20-80nm ca 10nm Lipidinnehåll i cellväggen 1-3 % 10-20% Teikonsyra i cellväggen + - Förekomst av endotoxin - + Känslighet för lysozym + - Lyseras av komplement (MAC) - + 8

9 Kapsel Alla bakterier omges antagligen yttersta av någon form av mukös substans. I vissa fall bildar detta slem en fast gel med ungefär samma tjocklek runt hela bakterien och man talar då om en kapsel. Kapseln har ingen metabolisk funktion men skyddar bakterien mot kroppens försvarsmekanismer (framförallt fagocytos) och möjliggör därigenom att bakterien överlever i kroppen och ger upphov till sjukdom. Bakterier kan förlora sin kapsel genom mutation och förlorar då i de flesta fall sin virulens. Kapselbildande bakterier har som regel kolonier med slät, glänsande yta och är ofta slemmiga. När den kapselbildande förmågan har gått förlorad blir kolonierna mindre och får en ojämn, rå yta. Förlust av kapselbildande förmåga sker ofta genom selektion vid odling av bakterien i laboratoriet, där kapseln inte utgör någon selektiv fördel. Kapseln består oftast av polysackarid, som varierar i sammansättning mellan olika bakterier. Kapslar av polypeptidnatur förkommer också. Kapselsubstanserna är antigena, vilket ger möjlighet till immunoserologisk identifiering. Så till exempel kan Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) delas upp i mer än 70 olika typer med olika antigen-specificitet. Kapseln kan göras synlig i mikroskopet genom negativ färgning med tusch. Den syns då som en klar zon mellan den tuschfärgade omgivningen (tusch består av kolpartiklar) och den refraktila (eller färgade) bakteriecellen. Flageller Bakterier som har förmåga till aktiv rörlighet drivs av flageller som förankrade i cytoplasmamembranet och som går rakt igenom den utanför liggande cellväggen. Flageller har en diameter på 10-20nm och kan bli 15-20µm långa. Flagellerna är uppbyggda av 3-6 proteinfibriller. Proteinet kallas flagellin. Bakteriers rörelse styrs ofta av yttre kemiska signaler som gör att bakterien rör sig emot eller ifrån en viss kemisk substans (s.k. kemotaxis). Pili (fimbrier) Hos både Gram-negativa och Gram-positiva bakterier förekommer trådlika utskott som kallas pili eller fimbrier. De är kortare och rakare än flageller. De består av protein och utgår liksom flagellerna från cytoplasmamembranet. Längs ut på pili finns ett särskilda proteiner, olika hos olika bakterier, som förmedlar bindning till olika celler och vävnader hos andra organismer (djur och växter). Bindningen sker ofta till olika art- eller organ-specifika sockermolekyler på cellytan och förklarar delvis varför olika bakterier infekterar olika djur eller olika organ. Hos vissa Gramnegativa bakterier förekommer en speciell pilusform som kallas för F-pilus. Med hjälp av dessa sker överföring av DNA mellan bakterier, så kalllad konjungation (se kap. 3). Sporer Bakterier tillhörande Bacillus och Clostridium kan utveckla en mycket specialiserad intracellulär bildning som kallas spor eller endospor. Den är ett violstadium av den vegetativa cellen i vilken den bildas. Sporer kan överleva i årtionden utan tillförsel av näring. Sporbildningen induceras av näringsbrist, framförallt av energikällan. Om sporen placeras i ett näringsmedium kan den gro (germinera) och utvecklar då en vegetativ bakterie som kan tillväxa och dela sig. Närvaro av vatten är en förutsättning för geminering. Sporen är mer 9

10 refraktil än bakterien i övrigt och kan därför ses i ljusmikroskop inuti bakterier som har bildat en spor. Den färdiga sporen är svårare att färga än den vegetativa bakterien och den ses därför som en ofärgad oval i den i övrigt färgade bakterien. Sporer karakteriseras av en mycket låg metabolisk aktivitet, stor resistens mot värme, uttorkning och toxiska kemikalier. Därigenom kan smitta med sporbildande bakterier, till exempel stelkrampsbakterien, spridas med förorenad jord där sporerna kan ha överlevt i åratal. Det är den rikliga förekomsten av sporer i vår omgivning som gör det nödvändigt att autoklavera vätskor (d v s upphetta till C i ånga) eller sterilisera fasta material vid temperaturer upp till 180 C. 10

11 3. BAKTERIEGENETIK Kromosomen Den genetiska informationen hos bakterier är liksom hos alla högre organismer lagrad i DNA, vilket innebär att de i stort sett följer samma genetiska lagar som allt annat levande.. Det följande kapitlet kommer därför endast att ta upp sådant som skiljer bakterier från andra organismer och som är av särskild betydelse för förståelsen av bakterier som sjukdomsalstrare. Genomet är den totala mängden genetisk information hos en organism. Hos Bakterier, som är haploida, består genomet som regel en enda ringsluten kromosom, bestående av dubbeltrådigt DNA. Hos vissa bakteriearter, t.ex. Vibrio cholerae, är genomet fördelat på två kromosomer. Kromosomen ligger fri i cytoplasman och är inte omgiven av något kärnmembran. Kromosomen är bunden till cytoplasmamembranet, sannolikt till de s.k. mesosomerna, vilket är av betydelse för distributionen av en kopia av kromosomen till vardera dottercellen i samband med celldelningen. Till skillnad från eukaryota celler tycks bakteriens kromosom inte vara organiserad i nukleosomer. Två olika histonliknande proteiner är dock bundna till DNAt, som är organiserat som en rosett av hårt tvinnade (super-coil) loopar. Antalet gener varierar från 500 till ca 6000 mellan olika arter. Bakterie-DNA saknar introner, vilket innebär att varje gen transkriberas direkt till ett mrna som sedan translateras till ett eller flera proteiner. Extrakromosomalt DNA Flertalet bakterier innehåller förutom kromosomen en eller flera plasmider som alltså är en del av genomet. Plasmider replikeras oberoende av kromosomens replikering och föreligger oftast i flera (10-100) kopior per cell. Dessa extrakromosomala DNA-molekyler är också dubbeltrådiga och ringslutna, men innehåller i allmänhet inte mer än något tiotal gener. Dessa gener kodar för proteiner som behövs för plasmidens replikering och fortbestånd (s.k. maintenance genes). Ibland finns också gener som gör att plasmiden kan överföras mellan olika bakterier genom konjugation (tra-transver genes). Många plasmider innehåller också gener som kodar för antibiotikaresistens, olika virulensfaktorer, eller bakteriociner som hämmar tillväxten hos bakterier tillhörande samma eller andra arter. Plasmider som har förmågan att överföras till andra bakterier kallas för konjugerande plasmider eller F-faktorer, medan sådana som kodar för antibiotikaresistens kallas R-faktorer. Många F-faktorer är också R-faktorer vilket innebär att antibiotikaresistens kan överföras mellan bakterier med hög frekvens (se kap. 9). Bakteriofager (fager) är bakteriespecifika virus. Liksom bland växt- och djurvirus förekommer både DNA- och RNA-fager samt kubisk och helikal symmetri. Liksom andra virus är fager beroende av specifik receptormedierad adsorption till värdcellen för att kunna infektera denna. Fagerna är därför i allmänhet genus- eller artspecifika. Känsligheten för olika 11

12 fager kan också variera inom en art, beroende på förekomsten av olika fagrereceptorer på bakteriens yta. Detta kan utnyttjas för indelning eller typning av bakterier, s.k. fagtypning. Lysogeni. En lysogen bakterie innehåller ett integrerat fag-genom (pro-fag) i sin kromosom alltså en form av latens. Endast DNA-fager kan ge upphov till lysogeni. Lysogena bakterier är immuna mot infektion med samma fag. Det händer också att förekomsten av en progag förändrar värdbakteriens fenotyp, genom att integreringen skett på sådant sätt att det ändrar uttrycket av någon bakteriell gen. Vissa fager bär också på gener som ger helt nya funktioner åt värdbakterien, t ex produktion av toxiner (difteritoxin hos Corynebacterium diphtheriae och erytrogent (pyrogent) toxin hos Streptococcus pyogenes) eller förändring av ytantigen hos vissa Salmonella. Fenomenet kallas lysogen omvandling och skiljer sig från transduktion (se nedan). Transposoner Transposoner är DNA-fragment som karaktäriseras av att de kan integreras på många olika ställen i kromosomen eller i plasmider. Transposoner är till skillnad från plasmider inga replikon pga. att de saknar startpunkt för replikering (origin of replication). Trots detta dupliceras de ofta i samband med att de förflyttas, vilket innebär att deras antal ökar i bakterien. Ett speciellt enzym, transposas, som kodas av transposonet, interagerar med transposonets ändar och med specifika målsekvenser i mottagar-dnat. Olika transposaser känner igen olika målsekvenser som förekommer med olika frekvens i mottagar- DNAt. Den enklaste formen av transposibla element är endast baspar långa och kallas för insertionssekvenser (IS). IS har baspar långa omvända repetitioner i ändarna. Egentliga transposoner är större och innehåller förutom genen för transposas också gener som kodar för resistens mot lika toxiska substanser, t ex antibiotika. Så kallad klass I transposoner består av en eller flera resistensgener som omges av två IS-fragment (som också kan förflyttas separat). Överföring av DNA mellan bakterier Överföring av genetiskt material mellan bakterier kan ske på tre olika sätt: konjugation, transduktion och transformation. Konjugation innebär överföring av DNA genom cell- till cellkontakt, t ex via F-pili. Konjugation med hjälp av F-pili förekommer bara hos gram-negativa bakterier. Hos grampositiva bakterier förekommer speciella adhesionsproteiner på ytan av cellväggen som göra att de kan aggregera med mottagarbakterier. Även denna typ av konjugation bestäms av plasmider. Hos vissa streptokocker utsöndrar mottagarbakterien små peptider, sexferomoner, (mol vikt ca 1000) som krävs för att konjugation ska ske. Transduktion innebär överföring av DNA från en bakterie till en annan via bakteriofager. Vid generaliserad transduktion plockar fager slumpmässigt upp fragment av kromosomalt DNA som packas i fag-huvudet i stället för i fag-genomet. Fragment motsvarande 1 % av bakteriogenomet kan plockas upp. Detta DNA kan sedan injiceras i en ny bakterie varefter det kan integreras i värdbakteriens kromosom genom homolog rekombination. Eftersom inget fag-dna finns närvarande sker ingen produktion av fagpartiklar. Även hela plasmider kan överföras genom transduktion. Resistensplasmider hos stafylokocker överförs f a genom transduktion. 12

13 Transformation innebär att bakterier tar upp fragment av DNA från omgivningen. Förmågan att ta upp DNA kallas kompetens och varierar beroende på tillväxtbetingelserna. Hos vissa bakterier tycks kompetensen vara naturlig och beroende av specifika proteiner (hos Bacillus subtilis, pneumokocker, Haemophilus m fl) medan andra måste specialbehandlas på laboratoriet för att de ska kunna transformeras ( t ex E. coli). Genetisk variation I samband med replikeringen av DNA uppstår spontana mutationer med en frekvens av ca per baspar. Då en genomsnittlig gen omfattar ca 1000 baspar innebär det att muationsfrekvensen per gen är ca 10-7, d.v.s. en mutation i en viss gen inträffar bara ca en gång per 10 miljoner celldelningar. På grund av att generationstiden i allmänhet är så extremt kort (20-30 minuter vid växt i rika näringsmedier) nås koncentrationer av över 10 9 bakterier/ml efter ca 16 timmars odling i buljong. I en sådan bakteriekultur där det alltså skett mer än 10 9 replikeringar av DNAt kan man således räkna med att finna bakterier per ml med en mutation i gen A, lika många med en mutation i gen B, gen C o s v. De flesta mutationer leder inte till någon märkbar förändring av genprodukten pga att de inte ändrar aminosyrasammansättnigen leder tillberoende på selektionstrycket kommer dessa olika mutanter antingen att selekteras bort eller anrikas. En antibiotikaresistent mutant t ex överlever och anrikas bara om kulturen utsätts för medlet i fråga. Mutanter med förändrade antigena egenskaper klarar sig bättre i värdindivider som bildat antikroppar mot det ursprungliga antigenet. Mutationer som leder till förlust av virulensfaktorer innebär som regel en sämre överlevnad in vivo. Vid växt in vitro har emellertid dessa faktorer ingen betydelse. Förlust av förmågan att bilda kapselpolysackarid eller O-antigen kan till och med leda till att bakterien växer bättre in vitro (se S-R variation kapitel 2). Även vidhäftningsorgan (t ex fimbrier) och olika toxiner kan förloras då bakterier odlas under lång tid på laboratoriet. Genom överföring av kromosomalt DNA via transformation, konjugation eller transduktion och efterföljande rekombination kan nya kombinationer av egenskaper uppstå. Egenskaper som kodas av gener på plasmider eller transposoner som lätt integreras i plasmider, överförs med hög frekvens mellan olika bakterier och bidrar till den stora genetiska variationen inom en bakterieart. 13

14 4. ODLING AV BAKTERIER Substrat Vid odling av bakterier i laboratoriet för att utföra experiment eller för diagnostik har man två huvudtyper av näringssubstrat att välja mellan: dels definierade substrat vars beståndsdelar är kända både kvalitativt och kvantitativt, dels icke definierade substrat. De definierade substraten innehåller vanligen glukos eller någon annan sockerart som kol- och energikälla, ett ammoniumsalt eller en blandning av aminosyror som kvävekälla och slutligen oorganiska salter. Basen i de odefinierade substraten utgörs av hydrolyserade proteiner (nötkött eller kasein); detta substrat kan berikas ytterligare genom tillsats av serum eller blod, jästextrakt och olika sockerarter. Allmänt gäller att ju mer anpassad en bakterieart är till ett parasitärt levnadssätt dess rikare substrat kräver den. Agar Både definierade och odefinierade substrat kan användas i flytande eller fast form. För att erhålla fasta substrat tillsätts agar, en polysackarid som utvinns ur alger. Under upphettning till 100 o C löser sig agar i vatten (substratet). Om man gör en 1,5 % lösning av agar och låter den svalna stelnar den till ett gel vid o C. Koloni I flytande lösningar växer bakterier diffust och ger upphov till en grumling. På fasta medier (t ex agarplattor) växer bakterierna som regel i form av runda bildningar (kolonier), som efter växt i timmar är i storleksordningen 1-5 mm i diameter. Optimala tillväxtbetingelser För optimal tillväxt av en bakterie måste inte bara näringssubstratet utan även den fysikaliska miljön vara anpassad efter dess behov. Några väsentliga faktorer är temperatur, ph, syre- och koldioxidhalt. Temperatur Arter som växer bäst vid o C kallas mesofila; hit hör de flesta humanpatogena bakterierna. I naturen fritt levande bakterier har i regel ett lägre temperaturoptimum, o C och kallas psykrofila. Termofila bakterier har sitt temperaturoptimum vid o C, de kan isoleras i varma källor eller i jord som är upphettad genom vulkanisk aktivitet. Observera att kyla inte är någon desinfektionsmetod. Även om tillväxten av humanpatogena bakterier är optimal endast vid ett ganska snävt område kring 37 o C, kan bakterieceller bevaras intakta i fruset tillstånd under mycket lång tid och åter börja föröka sig om temperaturen höjs. Surhetsgrad Flertalet humanpatogena bakterier har ett optimum inom ett ganska smalt intervall omkring ph 7. Ett undantag utgör Vibrio cholerae som har sitt optimum vid ph 8.2 och kan växa vid ph upp till 10. Detta kan man utnyttja vid diagnostiken genom att odla faecesproven från misstänkta kolerafall på substrat med alkaliskt ph varigenom växten av andra bakterier än V. cholerae hämmas. 14

15 Bakteriell tillväxt Bakterier förökar sig genom enkel delning. Då tiden mellan två celldelningar (generationstiden) är konstant i en optimal näringsmiljö sker alltså en fördubbling av antalet bakterier under ett visst tidsintervall. Bakterieantalet ökar således logaritmiskt med tiden. Om man studerar tillväxten av en bakterie i ett slutet system, t ex i en kolv med näringsmedium, finner man att en exponentiell förökning bara äger rum under en begränsad period (Fig 5.1). Fig 4.1 Bakteriers tillväxt i ett slutet system: tillväxtkurvan Lag-fas När bakterier ympas (tillförs) i ett näringsmedium tar det som regel en viss tid innan tillväxten kommer igång beroende på att baktereierna måste adaptera sig till den nya miljön. Denna första fas kallas för lag-fasen och varierar i längd beroende på bakteriearten samt hur stor miljöförändring den utsatts för. Log-fas När bakterierna har adapterat sig till den nya miljön börjar de att dela sig. Eftersom ökningen är exponentiell, d v s logaritmen för cellantalet ökar lineärt med tiden, kallas denna period för log-fasen, eller exponentiella fasen. Generationstiden (tiden mellan två celldelningar) varierar från art till art och är beroende av vilket näringsmedium som används. Escherichia coli kan i ett rikt näringsmedium dela sig var 20:e minut vid 37 o C, medan generationstiden i ett fattigt medium (glukos + salter) är minuter. Stationärfas, deklinationsfas Log-fasen följs av en stationärfas och därefter en deklinationsfas beroende på att allt fler bakterieceller slutar dela sig och så småningom dör. Observera dock att enskilda bakterieceller kan vara viabla under mycket lång tid (veckor, månader; sporbildande bakterier kan överleva i decennier). Orsaken till att den exponentiella tillväxten hejdas och att kulturen övergår i stationärfas är dels att det ansamlas metaboliter som har toxisk effekt (t ex syror som bildas vid jäsning) dels att bakterierna har en begränsad mängd näring till sitt förfogande. För aeroba bakterier utgör syre ofta en begränsande faktor. Tillväxt av bakterier i kroppen Bakteriers tillväxthastigheten är som regel lägre i människokropppen än i laboratoriet. En humanpatogen bakterie som i ett näringsrikt medium har generationstid på 30 minuter, kan i en infektionshärd ha en generationstid på flera timmar. Ett extremt exempel på detta är en infektion med abscessbildning (orsakad av t ex stafylokocker). I abscessen ackumuleras 15

16 organiska syror och andra jäsningsprodukter samtidigt som tillgången på näringsämnen minskar, vilket leder till relativt långsam bakterietillväxt. Å andra sidan finns exempel på bakterier som växer betydligt snabbare i kroppen än utanför denna (t.ex. Streptococcus pyogenessom orsakar halsfluss), och sådana som inte alls kan tillväxa utanför kroppen (t.ex. leprabacillen, Mycobakterium leprae) En helt annan miljö för bakteriell tillväxt finner man i tarmen. Ny näring tillförs här med jämna intervall medan avfallsprodukter liksom ett stort antal mikroorganismer utsöndras. Förhållandena i tarmen liknar dem vid s.k. kontinuerlig odling där man kontinuerligt tillför näringsämnen och håller faktorer som ph och redoxpotential relativt konstanta. Detta medverkar till selektion av en för varje individ mycket konstant tarmflora (se kap. 11). I sin naturliga miljö tillväxer många bakterier fästa till en yta som är omgiven av vätska som innehåller de näringsämnen som bakterierna behöver. Genom att bakterierna också binder till varandra med hjälp av polysackarider och proteiner som de utsöndrar bildas ett tjockt lager av bakterier som kallas för biofilm. En del sjukdomsalstrande bakterier växer som biofilm i kroppen och är därigenom skyddade från angrepp av vårt immunsystem och från antibiotika. 16

17 5. ANTIBIOTIKA Antibiotika är substanser som direkt hämmar mikroorganismers tillväxt i koncentrationer som är oskadliga för värdorganismen. Idén om selektiv toxicitet utvecklades i slutet av talet av Ehrlich, som syntetiserade och testade en mängd olika substanser, men med liten framgång. I början av 1930-talet lyckades Domagk syntetisera en substans, Prontosil, som visade sig ha god effekt på infektioner orsakade av Streptokocker. Prontosil visade sig dock vara utan effekt mot denna bakterie vid test in vitro. Denna paradox löstes snart, då det visade sig att personer som behandlades med Prontosil utsöndrade sulfanilamid i urinen, och att denna substans var aktiv mot Streptokocker både in vivo och in vitro. I början av 40-talet lyckades Florey och Chain, med utgångspunk från 20 år gamla iakttagelser av Flemming, att framställa penicillin i ren form från odlingar av Penicillium svamp. Dessa upptäckter blev inledningen på den moderna kemoterapin som inneburit lindring och bot för milliarder och som räddat livet på milliontals människor. De flesta antibiotika isoleras från olika bakterier (Streptomyceus-arter) och svampar (Penicillium, Cephalosporum). Man gjorde tidigare skillnad mellan kemoterapeutika, som är syntetiska substanser, och antibiotika som bildas av olika svampar och bakterier. I dag används ofta de båda begreppen synonymt, bl a beroende på att vissa "antibiotika" kan syntetiseras samt att många antibiotika som framställts genom odling av svampar och bakterier senare modifieras genom kemisk syntes (s k semisyntetiska antibiotika). För att kunna välja lämpligt antibiotikum och dosering för behandling av olika bakteriella infektioner måste man mäta bakteriens skänslighet för antibiotika. Den mest exakta metoden att bestämma bakteriers antibiotika-känslighet är den s k spädnings-metoden,vilken innebär att man gör en spädningsserie av antibiotika i något lämpligt odlingsmedium varefter man ympar en konstant mängd bakterier till varje spädningsrör. Rören inkuberas därefter under förhållanden som är lämpliga för tillväxt av bakterierna. Den lägsta antibiotikakoncentration som fullständigt hämmar tillväxten ( minimum inhibitory concentration= MIC) ger ett mått på bakteriernas antibiotika-känslighet och uttrycks i g/ml. Vissa antibiotika är baktericida, dvs de dödar bakterierna, medan andra substanser är bakteriostatiska, vilket innebär att de bara hämmar tillväxten. Då man använder sig av ett bakteriostatiskt medel för behandling så krävs det att patienten har ett fungerande immunförsvar för att man slutgiltigt skall bli av med infektionen. Hos patienter med vissa typer av immundefekter, t ex dåligt fungernade neutrofila granulocyter, kan det vara viktigt att välja ett antibiotikum med baktericid effekt. För rutinmässig bestämning av antibiotikakänsligheten används som regel inte spädningsmetoden utan i stället den s k agar diffusionsmetoden där små filtrerpapperslappar indränkta med en exakt mängd antibiotikum lägges på ytan av en agarplatta, på vilken man ympat en tät matta av bakterier. Plattan inkuberas sedan så att bakterierna kan växa ut och bildar en sammanhängande matta av kolonier. Under denna tid diffunderar antibiotikum från lappen ut i agarmediet och bildar en koncentrationsgradient som gör att man får en hämningszon runt lappen vars storlek är proportionell mot bakteriens känslighet för substansen i fråga. 17

18 Gemensamt för de flesta antibiotika är att de på olika sätt hämmar bakteriernas metabolism så att de slutar tillväxa eller dör. Ett antibiotikum måste alltså hämma någon livsviktig funktion hos bakterien, t ex syntesen av cellvägg, proteiner eller nukleinsyror. Här nedan följer en kort beskrivning av några vanliga antibiotika och deras verkningsmekanismer. Sulfonamider och närstående antibiotika Sulfa hämmar syntesen av folsyra. Till skillnad mot bakterier syntetiserar människan inte folsyra utan denna måste tillföras med födan ; vilket förklarar att sulfa hämmar bakterier men int människans celler. Sulfonamiderna har en bakteriostatisk effekt mot både Gram-positiva och Gram-negativa bakterier. Resistens är dock inte ovanlig på grund av specifika resistensgener (se nedan). Pseudomonas aeruginosa är alltid resistent. Cellväggsynteshämmare. Penicilliner och cefalosporiner är kemiskt nära besläktade men bildas av två olika svamparter. De innehåller båda en s k beta-laktamring som är essentiell för deras aktivitet och brukar därför gemensamt kallas för beta-laktamantibiotikum. Betalaktamantibiotikum hämmar syntesen av cellvägg genom att de binder sig till enzymer som sätter ihop mukopeptiden. Hos de flesta bakterier finns mellan 5 och 10 olika enzymer som är inblandade i denna mycket komplicerade och dynamiska process och som binder olika betalaktamantibiotika med olika affinitet. Dessa enzymer är delvis artspecifika vilket innebär att känsligheten för olika beta-laktam-antibiotika varierar mellan olika bakterier. Hämningen av mukopeptidsyntesen leder till aktivering av autolysiner( mureinhydrolaser) som bryter ner den befintliga mukopeptiden vilket leder till lys av bakterien. Beta-laktamantibiotika är således baktericida. Benzylpenicillin, eller penicillin G är den ursprungliga formen av penicillin. PcG är mycket aktivt mot Gram-positiva bakterier t ex Streptokocker och Stafykocker. En nackdel med PcG är att det är mycket syrakänsligt och kan därför ej tas per oralt utan måste injiceras. Genom att ändra lite på PcG kunde man få fram en form som kan tas per oralt, nämligen fenoxymetylpenicillin, eller PcV. PcG och PcV har två nackdelar, dels verkar i huvudsak på Gram-positiva bakterier, dels är de känsliga för beta-laktamas (penicillinas), ett enzym som produceras av många bakterier och som inaktiverar penicillin. Genom att koppla olika sidogrupper till penicillin-molekylen har man fått fram en lång rad penicilliner med olika egenskaper; t.ex sådana som även hämmar Gram-negativa bakterier eller sådana som inte inaktiveras av beta-laktamas. På liknande sätt har man framställt olika Cephalosporiner med effekt mot olika typer av bakterier. Förutom att vissa människor kan utveckla allergi ger denna grupp av läkemedel inga biverkningar. Proteinsynteshämmare. Makrolider, av vilka Erythromycin är den mest använda, binder till bakteriens ribosomer och hämmar därmed proteinsyntesen Erythromycin är bakteriostatiskt och är liksom penicillin mest aktivt mot Gram-positiva bakterier, men har också god effekt mot Clamydia och Mycoplasma. Används som alternativ till Pc, fr.a. hos Pc-allergiska personer 18

19 (Clindamycin och Lincomycin är kemiskt skilda från makroliderna men har likartad verkningsmekanism och ungefär samma antibakteriella spektrum. Clindamycin är dessutom mycket aktivt mot Bacteroides och andra anaeroba bakterier.) Tetracyklinerna hämmar också proteinsyntesen. Tetracyklin, Oxitetracyklin, Doxycyklin och Metacyklin är bakteriostatiska och har alla ett brett antibakteriellt spektrum. De används ofta för behandling av bronchit och atypiska pneumonier orsakade av Mycoplasma, Clamydia m fl. Tetracykliner lagras upp i benvävnad och tänder och får därför ej ges till gravida kvinnor och till barn. Kloramfenikol är en annan proteinsynteshämmare som har ett mycket brett antibakteriellt spektrum. På grund av sin toxicitet ( anemi ) används det dock bara vid direkt livshotande infektioner t.ex meningit och typhoidfeber. Det används också för lokalbehandling, t ex i ögonsalvor, där dosen blir mycket liten och ej orsakar några biverkningar. Fusidinsyra som också hämmar proteinsyntesen används i stort sätt bara för lokal behandling av infektioner orsakade av Staphylococcus aureus, t ex i ögonen. Nukleinsyrasynteshämmare. Nitrofurantoin är en syntetisk substans som hämmar DNAsyntesen hos många bakterier. På grund av att det metaboliseras mycket snabbt och utsöndras med urinen kan det endast användas för behandling av urinvägs-infektioner. Kinoloner som också är syntetiska substanser hämmar enzymer som behövs vid DNAsyntesen. De har ett brett antibakteriellt spektrum och är i allmänhet mera aktiva mot Gramnegativa än mot Gram-positiva bakterier. Ciprofloxacin och andra kinoloner används numera ofta mot urinvägsinfektioner och prostatit samt ibland mot okomplicerad gonorré. Rifamycin är ett "riktigt" antibiotikum som produceras av en svamp. Det binder sig mycket effektivt till bakteriernas RNA-polymeras och hämmar därigenom transkriptionen. Trots god effekt på ett stort antal både Gram-positiva och Gram-negativa bakterier används det nästan uteslutande för behandling av tuberkulos. Nya antibiotika med bättre antibakteriella och farmakologiska egenskaper utvecklas ständigt. Ett särskilt motiv till att finna nya substanser är att bakterier snabbt utvecklar resistens mot de medel som används flitigt. Antibiotikaresistens Utvecklingen av antibiotikaresisten är ett stort kliniskt problem. Frekvensen, med vilket detta sker, varierar beroende på både bakterie och antibiotikum. Vissa bakteriearter, t ex coliforma och S.aureus, utvecklar resistens mycket snabbare än andra.. Resistens utvecklas relativt lätt mot penicilliner, tetracyklin och streptomycin, men nästan aldrig mot metronidazol. Antibiotikaresistens kan uppkomma på två olika sätt. 1. Genom spontana kromosomala mutationer. 2. Genom upptag av resistensgener. 19

20 Skillnaden mellan dessa två mekanismer kan illustreras med streptomycin-resistens som kan uppkomma på båda sätten. En enstaka mutation kan leda till en förändring av bakteriens ribosomer så att streptomycin inte längre binder sig. Denna förändring leder till resistens mot streptomycin, men innebär också att ribosomen fungerar något sämre. Detta innebär att i en antibiotikafri miljö växer den resistenta mutanten sämre. I närvaro av streptomycin kommer däremot endast den resistenta mutanten att kunna föröka sig och man får en anrikning av resistenta bakterier ( en resistent stam). Bakterier kan också bli resistenta mot streptomycin genom att de tar upp en resistensgen från en annan bakterie. Resistensgener är gener som kodar för specifika proteiner som inaktiverar antibiotika,eller på annat sätt motverkar deras effekt på bakterien. Resistens mot streptomycin beror på ett enzym som inaktiverar streptomycinet. En sådan gen kan inte uppstå genom en enstaka mutation utan har sannolikt utvecklats under en mycket lång tid som skydd mot naturligt förekommande antibiotikum. Resistensgener är ofta lokaliserade till plasmider som kan överföras mellan bakterier genom konjugation,transduktion eller transformation. Överföringen kan ibland ske över artgränserna. Många individer har t ex i sin normala tarmfloran stammar av E.coli och andra enterobakterier som innehåller resistensgener som kan överföras till patogena bakterier så som Salmonella och Shigella. Samma plasmid kan innehålla flera olika resistensgener ( upp till 9 st),vilket innebär att en bakterie kan bli resistent mot flera olika antibiotikum samtidigt. Exempel på resistensgener Antibiotikum Penicilliner och Cefalosporin Tetracykliner Kloramfenikol Erythromycin Resistensgen, kodar för: Beta-laktamas; enzym som spjälkar ß-laktam-ringen Proteiner som transporterar ut tetracyklin ur bakterien Enzym som acetylerar kloram-fenikol som därigenom blir inaktivt Enzym som metylerar 23S-RNA, Lincomycin leder till minskad bindning av Clindamycin antibiotika till ribosomen 20