Färgning av human hypofys för identifiering av acidofila, basofila, och kromofoba celler.

Transkript

1 Färgning av human hypofys för identifiering av acidofila, basofila, och kromofoba celler. Anna Diec, Jeanette Valcich Lunds universitet, Biomedicinsk analytikerutbildning Nyckelord: hypofys, acidofil, basofil, kromofob, granula, hematoxylin, eosin, pontamine, alcian blue. Abstract

2 Human pituitary gland was stained with Hematoxylin & Eosin, Kerenyi & Taylor s Pontamine Sky Blue and Bromine-Alcian Blue-Orange G-acid fuchsin-green method for histological identification of acidophilic, basophilic and chromophobic cells. With the Hematoxylin & Eosin and the Pontamine Sky Blue method nuclei were stained dark blue; acidophilic and basophilic cells could be separated. Some cells with colorless cytoplasm could also be seen, which are thought to be chromophobic. Several other cells with colorless spots in the cytoplasm could be distinguished and they are thought to be basophilic cells with partly emptied granules. Basophil-S and basophil-r cells could specifically be separated with the Bromine-Alcian Blue-Orange G-acid fuchsin-green method. The basophil-s cells were stained dark green-blue and the basophil-r cells magenta-red. Nuclei were stained dark blue, acidophilic cells brownyellow and chromophobic cells light grey-blue. 2

3 Människans hypofys är cirka 1,5 x 1 x 0,5 cm stor, och väger ungefär 0,65 g (väger lite mindre hos män än kvinnor, eftersom vikten under graviditet ökar och kvarstår högre därefter) (3). Hypofysen finns i hjärnans underdel, kopplad till hypothalamus (5) och styrs genom nerv- och hormonsignaler (5). Hypofysen är indelad i två huvuddelar - neurohypofysen och adenohypofysen. Neurohypofysen består främst av nervvävnad och syntetiserar inga hormoner, men lagrar dock två hormoner oxytocin och arginine vasopressin (7). Adenohypofysen är den främre loben av hypofysen och består huvudsakligen av celler som bildar, lagrar och utsöndrar hormoner. Den är indelad i tre delar - pars distalis, pars tuberalis och pars intermedia (5). Pars distalis består av kromofoba, acidofila, och basofila celler, och utgör ungefär 75% av hypofysen (5). Bindväven i pars distalis består främst av ett nätverk av fibrer, som stödjer endokrina celler och kapillärernas väggar (3). Pars tuberalis omringar nervstjälken, men det är ovisst om pars tuberalis främst består av kromofoba celler (och ett fåtal acidofila och basofila celler) eller basofila celler (3, 5). Pars intermedia består av strängar innehållande svagt basofila celler, som skiljer nedre neurohypofysen från pars distalis (3). Adenohypofysens celler delas histologiskt in i tre grupper efter deras affinitet för färger - kromofoba celler (färgas mycket svagt); acidofila celler (tar upp syrahaltiga färger); och basofila celler (tar upp basiska färger). Olikheten i att ta upp färger beror på granula de innehåller (1, 5). Acidofila celler utgör 40% av antalet celler i adenohypofysen. Dessa celler är runda och är oftast mindre än basofila celler (3). Acidofila celler har cytoplasmatiska granula (1), som färgas starkt röda av eosin (3). Acidofila celler indelas i två olika grupper efter vilka hormon de utsöndrar - somatotropa och mammotropa (5). 3

4 Somatotropa är de mest förekommande cellerna i pars distalis (50%) (3). De utsöndrar somatotropin (tillväxthormon) som stimulerar kroppens tillväxt och vissa delar i metabolismen (7). Mammotropa eller lactotropa celler utgör 15 % av pars distalis. Dessa celler utsöndrar hormonet prolactin, som påbörjar mjölkproduktionen i bröstkörtlarna, och ökar i antal under graviditet (3, 7). Basofila celler utgör 10% av den totala populationen. Oftast är de större än acidofila celler och är delade i två grupper baserat på deras färgningsreaktioner, Basofil-S (svavel) och basofil-r (resistens) (1). Basofil-S celler (innehållande svavel) kan färgas med alcian blue efter oxidation. Basofil-R celler är resistenta mot oxidation och efterföljande alcian blue färgning (1). Basofila cellers granula innehåller glykoprotein och färgas av PAS (3). Anilin blå används vanligen för färgning av basofila celler (3). Basofila celler indelas i tre olika grupper efter vilka hormon de utsöndrar - tyrotropa, gonadotropa och kortikotropa celler (5). Tyrotropa celler är basofil-r celler och är oregelbundna till formen. De utgör sällan mer än 10 % av pars distalis (3). Hormonet de utsöndrar kallas tyrotropin (tyroid stimulerande hormon), som reglerar sekretion och andra aktiviteter hos tyroidea (7). Gonadotropa celler är basofila celler som är mer rundade än de tyrotropa och utgör ungefär 10 % av pars distalis. De utsöndrar två gonadotropa hormon - follikel stimulerande hormon och luteiniserande hormon (3). Tillsammans stimulerar dessa hormon sekretion av östrogen och progesteron, mognad av oocyterna i äggstock, sekretion av testosteron, och produktion av sperma i testiklarna (7). Gonadotropa celler utgör sannolikt större delen av pars tuberalis (5). Kortikotropa celler utgör cirka 15-20% av pars distalis, och är kantiga basofil-s celler (3). Dessa celler utsöndrar kortikotropin (adrenokortikotropiskt hormon), som stimulerar binjurebarken att utsöndra glukokortikoider; och melanocytsimulerande hormon, som påverkar pigmentering av huden (7). Cellerna i pars intermedia innehåller små granula, och är i människan sannolikt identiska med de kortikotropa cellerna i pars distalis (3). Kromofoba celler utgör den största populationen, ungefär 50% av adenohypofysen. Dessa celler har små cellkärnor (1), innehåller inga eller få granula, och färgas därför mycket svagt (5). 4

5 I detta projekt färgades snitt av human hypofys. Acidofila, basofila och kromofoba celler i hypofysen färgades med olika färgningsmetoder för en histologisk jämförelse mellan översikts- och speicalfärgningar. En bra översiktsfärgning ska ge en tydlig avgränsning mellan kärnor och cytoplasma och kärnans kromatinstrukturer ska framträda klart medan specialfärgningar ger en mer detaljerad bild av vävnadernas morfologi (6). Material och metod Mayers Hematoxylin & Eosin färgning (H&E) Humant hypofyssnitt (gåva från Patologiska avdelningen på Lunds Universitetssjukhus), 4 µm tjockt snitt på plus glas avparaffinerades, hydrerades, och H&E färgades enligt Carson (2). Färgning i Mayers hematoxylin (Histolab, art. Nr ) utfördes i 30 sek, och i eosin förkortades tiden till 10 sek. Dehydrering enligt Carson (2). Kerenyi & Taylor s Pontamine Sky Blue (PSB) färgning Humant hypofyssnitt, 4 µm tjockt snitt på plus glas avparaffinerades, hydrerades och färgades med PSB färgning enligt Bancroft (1). Färgning i Mayers hematoxylin pågick i 1 min. Tiden för färgningen i pontamine lösningen förlängdes till 4 min (tills celler infärgats), och i eosin till 3 min (tills celler infärgats). Dehydrering enligt Carson (2). Bromine-Alcian Blue-Orange G-acid fuchsin-green (OFG) färgning Humant hypofyssnitt, 4 µm tjocka snitt på plus glas avparaffinerades, hydrerades och färgades med OFG färgning enligt Bancroft (1). Brominvattnet som snitten behandlades med hade koncentrationen 9% vätebromidsyra. Färgning i syrafuchsin pågick i 2 min och 30 sek och i light green 1 min och 30 sek. Vid dehydrering doppades (4-5 dopp) snitten endast i 95% och sattes sedan direkt i absolut alkohol i 3 min. Resultat Snitt av human hypofys färgades med H&E, PSB och OFG färgning för en jämförelse mellan översikts- och speicalfärgningar. 5

6 H&E färgning I fig. 1 kan mörkblå kärnor urskiljas i alla celler med en tydlig avgränsning från cytoplasman. Ljusblå granula i basofila celler, röda erytrocyter, eosinofila granula i acidofila celler och celler med tillsynes färglös cytoplasma, samt rosalila bindvävsceller kan även urskiljas. Bindvävsstråk som indelar hypofysen i olika delar syns också tydligt. PSB färgning I alla celler kan mörkblå cellkärnor urskiljas med en tydlig avgränsning från cytoplasman (fig. 2). Bleklila basofila celler, blekrosa acidofila celler, och celler med tillsynes färglös cytoplasma kan även urskiljas. Ett fåtal celler med färglösa hålrum i cytoplasman kan ses. Ljust lilablå bindvävsstråk kan även urskiljas tydligt. OFG färgning Acidofila cellers mörkblå kärnor ger tydlig kontrast till deras gulbruna cytoplasma (fig. 4). Gulbruna erytrocyter kan även urskiljas. Kromofoba celler har en tydlig mörkblå cellkärna och olika nyanser av ljusgråblå cytoplasma (fig. 4). En mörk grönblå basofil-s cell kan urskiljas i fig. 3. Ytterligare några basofil-s celler kan urskiljas i det OFG färgade hypofyssnittet, dock kan alla kärnor i alla basofil-s celler inte tydligt urskiljas. Basofil-R celler med mörkblå cellkärnor med magentaröd cytoplasma (fig. 4) och grönblå bindvävsceller (fig. 3) kan urskiljas. Bindvävstråk som indelar hypofysen i olika delar kan ses tydligt. Diskussion Snitt av human hypofys färgades med H&E, PSB och OFG färgning för en histologisk jämförelse. Till hematoxylin används oftast bakgrundsfärgen eosin, som är en anjonfärg. Eosin förekommer i tre nyanser: eosin G (gelbich) eller Y (yellow), B (blue), och erytrosin. Oftast används G/Y och den ger finare kontrast till hematoxylinets blåa kärnfärg (se fig. 1) (6). Strukturer färgade av eosin blir rosa till röda, exempelvis färgas cytoplasmatiska granula i acidofila celler starkt röda (1, 3) (se fig. 1). Cellerna med tillsynes färglös cytoplasma (fig. 1) är sannolikt kromofoba celler, eftersom cytoplasma inte färgas av H & E. 6

7 Eosin G/Y förekommer både som vatten- och alkohollöslig, därför kan en del av färgen gå förlorad vid dehydrering (framför allt i 70%-ig och 90%-ig alkohol) (6). Detta kan ha varit orsaken till de bleka färgerna hos de PSB färgade cellerna (se nedan). Hematoxylin är inte användbar förrän den oxiderats till hematein. Hematein är en anjonfärg som ger ospecifika och brunaktiga färgningsresultat. Genom tillsats av betmedel erhålles positivt laddade hemateinkomplex som kommer att förenas med nukleinsyrornas fosfatgrupper i kromatinet. Cellkärnorna färgas då till nyanser av blåviolett till blått eller brunsvart (6). Basofila cellers granula färgas svagt av hematoxylin (3) (se fig. 1). Hematoxylin enligt både Harries och Mayers innehåller kalialun (kalium-aluminium-sulfat) som betmedel (6). Med PSB metoden kan de acidofila, basofila och kromofoba cellerna i hypofysen urskiljas (1). PSBs histokemiska egenskaper är ännu okända. Den injiceras ofta i försöksdjur för att verka som en markör (4). Det finns en teori som menar att kromofoba celler är acidofila eller basofila celler, som tömt sina granula (3). De celler med färglösa hålrum i cytoplasman (fig. 2) är därför sannolikt basofila celler som delvis tömt sina granula. Om basofila celler tömt sina granula ännu mer, hade de kunnat tolkas som kromofoba celler. Med PSB metoden färgades inga celler ljusrosa. Denna metod har sannolikt inte haft en optimal verkan, eftersom alla celler färgades blekt. Därför kan celler med färglös cytoplasma (fig. 2) antas vara kromofoba celler. En del av eosinfärgen kan gå förlorad vid dehydrering (6), därför kan för lång dehydreringstid orsakat den bleka nyansen på acidofiler och ingen färg på kromofoba celler. De förlängda färgningstiderna i PSB metoden borde dock ha uppvägt den för långa dehydreringstiden. OFG färgningen kan särskilja R och S-basofila celler. Denna färgning har utarbetats från permyrsyra-alcian blue-pas-orange G färgning, där permyrsyran bytts ut mot bromsyra (1). I basofil-s celler finns svavelinnehållande aminosyror, som kan oxideras av bromsyra, och därefter kan färgas med alcian blue. Basofil-R celler är däremot resistenta mot oxidation och efterföljande alcian blue färgning (1). Alcian blue är en katjonfärg och färgar sura slemsubstanser (mucopolysackarider) i exokrina körtlar, bindväv, mastcells granula, brosk och tumörer (6). Alcian blue färgar blått pga. sitt koppar innehåll, och tros bilda saltbryggor med sura grupper på muciner (2). I en 7

8 kombination av Alcian blue och PAS teknik, färgas sura muciner med Alcian blue, och kan därefter reagera med efterföljande PAS (1). Basofila cellers granula innehåller glykoprotein och färgas därför av PAS (3). I Mayers och Harries hematoxylin används kalialun som betmedel (se ovan), medan Weigerts järnhematoxylin har järn som betmedel (2). Weigerts järnhematoxylin färgar cellkärnor brunsvarta eller blåsvarta (6). Orange G är ett anjonfärgämne som färgar acidofila celler. Orange G färgar cytoplasma och används mest i kombination med fosfowolframsyra (6). Syrafuchsin är ett anjonfärgämne som huvudsakligen färgar cytoplasma röd, men kan även färga cellkärnor. Light green är liksom syrafuchsin en progressiv anjonfärg och färgar bakterier och kollagen bindväv grönt (6). R och S basofiler kunde urskiljas med OFG färgningen till skillnad från H & E och PSB färgningarna. För framhävande av basofil-s celler krävdes oxidation som möjliggjorde efterföljande infärgning med Alcian blue. För ytterligare framhävande användes light green. Basofil-R cellers resistens mot oxidation, motverkade infärgning med Alcian blue. Dessa celler färgades av syrafuchsin, som däremot inte togs upp av basofil-s celler. Acidofila celler färgades av orange G. Oxidation med bromsyra möjliggjorde infärgning av basofil-s cellers cytoplasma med Alcian blue. Alcian blue kan ha hindrat intensiv kärnfärgning av Weigerts järnhematoxylin hos basofil-s celler. Alla andra cellkärnor färgades skarpt av Weigerts järnhematoxylin. De tre färgningarna gav cellkärnorna liknande färger. I de större cellkärnorna kunde ljusare partier ses, i vilka kromatinet är mindre packat. Till skillnad från de större cellkärnorna var de mindre cellkärnor i regel mörkare, vilket tyder på tätare packat kromatin. Varken H & E och PSB färgningarna kunde urskilja cytoplasma i de kromofoba cellerna (fig. 1, 2). Däremot kunde olika gråblå nyanser av cytoplasma i de kromofoba cellerna urskiljas med OFG färgningen (fig. 3). Bindväv kunde urskiljas i alla tre färgningarna. Tydligast framhävdes bindvävsceller med OFG färgningen, där de färgades grönblå (fig. 3). Distinkta bindvävstråk runt snittens yttre delar, och den bindväv som indelar hypofysen i neurohypofysen, pars intermedia och pars distalis (pars tuberalis förekommer inte i snittet) kunde tydligt urskiljas med alla tre färgningarna. 8

9 Referenser 1. Bancroft John D., Histological techniques and their diagnostic application Longman Group UK Limited 1995, s 74-79, Carson Freida L., Histotechnology 2:nd ed., ASCP Press Chicago, 1997, s 94-96, Geneser Finn, Textbook of histology, AiO Tryck as, Munksgaard 1986, s 552, , 557, Irie K, Fujii E, Ishida H, Wada K, Suganuma T, Nishikori T, Yoshioka T, Muraki T. Inhibitory effects of cyclic AMP elevating agents on lipopolysaccharide (LPS)-induced microvascular permeability change in mouse skin. British journal of pharmacology, 2001:133(2): Jungquiera L.C., Carneiro J., Kelley R.D., Basic histology 6:th ed., Appleton & Lange, Rio de Janiero 1989, s , Moewis Gertraude, Histopatologisk teknik, Almqvist & Wiksell Förlag AB Stockholm 1978, s 91, , , 155, Tortora/Grabowski, principles of anatomy and physiology 9:th ed., John Wiley & Sons, Inc. 2000, s

10 Fig. 1 H & E färgning av 4 µm tjockt humant hypofyssnitt. Basofila celler (B), acidofila celler (A), celler med enbart synlig cellkärna (K) och bindvävsceller (b) kan urskiljas. Skalstreck: 14 µm. Fig. 2 10

11 PSB färgning av 4 µm tjockt humant hypofyssnitt. Basofila celler (B), acidofila celler (A),och celler med enbart synlig cellkärna (K) kan urskiljas. Celler med färglösa hålrum (Bb) i cytoplasman kan ses. Skalstreck: 14 µm. Fig. 3 OFG färgning av 4 µm tjockt humant hypofyssnitt. En basofil-s cell (S), kromofoba celler (K) och bindvävsceller (Bv) kan urskiljas. Skalstreck: 14 µm. Fig. 4 11

12 OFG färgning av 4 µm tjockt humant hypofyssnitt. Basofil-R cell (R) och acidofila celler (A). Skalstreck: 14 µm. 12