Så fäster embryot i livmoderslemhinnan Musslor och patogena mikroorganismer Hearing om delegation och legitimering

Transkript

1 Nr 1 februari 2003 Tidskrift för Institutet för biomedicinsk laboratorievetenskap Så fäster embryot i livmoderslemhinnan Musslor och patogena mikroorganismer Hearing om delegation och legitimering

2 Faktorer av betydelse för att ett embryo ska fastna AV ANNELI STAVREUS-EVERS Andelen ofrivilligt barnlösa par uppgår till cirka % av befolkningen. Ofrivillig barnlöshet leder ofta till en existentiell kris för dem som drabbas. Behandlingen är ofta både psykiskt och fysiskt krävande, vilket leder till försämrad livskvalitet och nedsatt arbetsförmåga. Detta leder till stora ekonomiska uppoffringar både för samhället och för de drabbade barnlösa paren. Provrörsbefruktning är den effektivaste metoden för att hjälpa dessa par, och ungefär hälften blir gravida efter behandling. För att öka antalet graviditeter efter provrörsbefruktning behövs större kunskap dels om vilka egenskaper endometriet (livmoderslemhinnan) måste ha för att kunna ta emot det befruktade ägget, och dels om själva implantationsprocessen, d.v.s. den process där det befruktade ägget fäster och tränger in i endometriet. Vi har använt två olika tillvägagångssätt för att öka kunskapen om implantationsprocessen. Det första är att odla små bitar av endometrium, för att kunna studera vad som händer när man exponerar den för ett befruktat ägg. Det andra är att studera vad som händer i livmoderslemhinnan när den gör sig redo att ta emot ett befruktat ägg. Implantationsprocessen Befruktningen av ägget sker vanligtvis i äggledaren, och embryot transporteras till endometriet genom muskelkontraktioner och med hjälp av cilier. Under transporten genomgår det tidiga embryot en serie av förändringar fram till bildande av en blastocyst, när embryot är cirka en vecka gammalt. Utvecklingen av embryot måste vara synkroniserad med utvecklingen av endometriet för att en implantation ska kunna ske. Implantationen sker i flera steg, apposition, adhesion och penetration. Under appositionen kommer blastocysten i nära kontakt med endometriet, och kan signalera sin närvaro med olika tillväxtfaktorer och cytokiner till ytepitelet. Nästa A C 20µm 10µm Figur 1. Läkningsprocessen i det humana endometriet. A: Körtel som har skurits av med kniv. B: Körtel efter 8 timmars odling. Epitelcellerna migrerar ut för att försöka täcka skadan. C: Ytepitel. Cellerna är uppradade på ytan. D: Ytepitel efter 8 timmars odling. Epitelcellerna täcker den skadade kanten. steg är adhesionsfasen när blastocysten sitter tillräckligt fast i endometriet för att inte kunna spolas bort. Under detta steg ökar decidualiseringen, en biokemisk och morfologisk förändring av det underliggande stromat. Decidualiseringens funktioner är att förse embryot med näring och att skydda embryot från att avstötas genom en immunologisk reaktion från modern. Under nästa steg penetrerar trofoblasterna, (de celler som kommer att bilda en placenta), ner i endometriet. Hela embryot kommer att penetrera ner i endometriet varefter en läkningsprocess startar och ytepitelet helt kommer att täcka det invaderade embryot. Våra kunskaper om vad som sker under implantationsprocessen är mycket B D 100µm 10µm begränsade. Av självklara etiska skäl kan man inte studera den humana implantationsprocessen in vivo. Dessutom skiljer sig den humana implantationsprocessen från alla andra arter. Det enda möjliga sättet att studera den humana implantationsprocessen är därför genom att använda olika odlingsmodeller. En möjlig metod är att odla endometrium som cellkultur uppbyggd i flera lager. Det undre lagret består av stromaceller som odlas i matrigel, ovanpå detta ett filter, och överst att lager epitelceller. Detta system är användbart när man vill studera hur olika celltyper i endometriet påverkar varandra, och har även använts för att studera de initiala faserna av implantationsprocessen (1). Nackdelen 10 LABORATORIET 1/2003

3 A B C D E F Figur 2. Förändringar av ytepitelet under sekretionsfas. A: Två dagar efter LH-toppen. De cilierade cellerna ser ut som små buskar. De mikrovillibeklädda cellerna är lite rundade. B: Fem dagar efter LH-toppen ser man hur de mikrovillibeklädda cellerna börjar växa uppåt. C: Sex dagar efter LH-toppen, och man ser hur de mikrovillibeklädda cellerna är ytterligare större. Mikrovillin börjar försvinna. D: Sju dagar efter LH-toppen har de mikrovillibärande cellerna fullt utvecklade pinopoder som är nästan helt släta på ytan. E: Åtta dagar efter LH. Pinopoderna börjar minska i storlek. F: Nio dagar efter LH-toppen. De mikrovillibärande cellerna har nu återtagit sin ursprungliga storlek. med den här typen av cellodlingssystem är att det saknas flera celltyper som t.ex. NK-celler. Dessutom saknas också flera viktiga strukturer som t.ex. körtlar och spiralartärer. Dessa celler är viktiga för en fungerande implantationsprocess. Vi har därför valt att odla endometriet som en vävnadskultur, med alla celler och strukturer intakta. Denna modell har visat sig fungera så bra att det har varit möjligt att få en implantation av ett mänskligt embryo in vitro (2). Detta var emellertid svårt att upprepa, så vi har därför optimerat odlingsmetodiken. Syrekoncentrationen är låg i livmodern så det är bättre att odla endometriet i 5 % syrgas i stället för 20 % som är mera vanligt. Det är också viktigt att man inte tar endometriebiopsin sent i cykeln. Om det inte sker någon implantation kommer livmoderslemhinnan att brytas ner och försvinna i nästa menstruation. Detta inträffar också när livmoderslemhinnan ska odlas. Dessutom är det bra att använda ett medium rikt på näringsämnen och att odla biopsin på Matrigel för att vävnaden ska må bra (3). Hormonella menstruationscykeln Menstruationscykeln kan delas in i proliferationsfas och sekretionsfas. Under proliferationsfasen bryts livmoderslemhinnan först ner genom apoptos och nekros under menstruationen, för att sedan byggas upp igen. Denna läkningsprocess, som sker utan ärrbildning, kan även studeras i vävnadskultur (Figur 1) (3). Proliferationsfasen, som varar från menstruationens första dag till ägglossning, karaktäriseras av tillväxt av livmoderslemhinnan genom hypertrofi, ökad DNA syntes och mitoser. Sekretionsfasen sträcker sig under fjorton dagar efter ägglossning. Implantationsfönstret, den korta tid ett embryo kan fästa vid livmoderslemhinnan, inträffar cirka sju dagar efter ägglossning. Sekretionsfasen domineras av progesteron, som är helt nödvändigt för att endometriet ska utvecklas och kunna ta emot ett embryo. Morfologiska implantationsfönstret Vid tiden för implantation sker stora morfologiska förändringar på endometriets yta. Ytepitelet består av cilierade celler och mikrovillibärande celler. Funktionen hos de cilierade cellerna är som hos alla slemhinnor att förflytta sådant som kan finnas på ytan. De mikrovillibärande cellerna bildar pinopoder, (svampliknande ytstrukturer), på endometriets yta under implantationsfönstret. Det är inte känt vilken funktion dessa pinopoder har, men det finns indikationer att de dels är involverade i kommunikationen mellan embryo och endometrium, dels underlättar vidhäftning av embryot till livmoderslemhinnan och därmed underlättar den fortsatta implantationsprocessen. Dessutom är de stora nog för att täcka cilierna och därmed hindra dessa från att förflytta substanser över ytan. Under ytepitelet finns huvudsakligen stroma och körtelepitel. Dessutom finns olika typer av immunkompetenta celler LABORATORIET 1/

4 LIF-receptor HB-EGF Före pinopoder Pinopoder Efter pinopoder Figur 3. Med immunhistokemi kan man se hur både LIF receptorn och HB-EGF ökar när pinopoder finns utvecklade på endometriets yta. Den bruna färgen visar att proteinet finns närvarande. och en kärlstruktur. Alla dessa genomgår stora morfologiska cykeln. Med hjälp av svepelektronmikroskopi kan man se hur pinopoderna bildas på endometriets yta (Figur 2). Genom att följa förändringar i endometriet under cykeln, kan man se när implantationsfönstret inträffar. Pinopoderna bildas när progesteronnivåerna i serum är som högst under cykeln (4), vilket hos de flesta kvinnor inträffar 7 dagar efter att hypofysen har signalerat med LH (Luteinizing hormone) om att en ägglossning ska inträffa. Pinopoder bildas även om ingen befruktning av ägget har skett. Pinopoderna är möjliga att se också i vanligt ljusmikroskop, förutsatt att endometriet är snittat vinkelrätt mot endometriets yta, men det krävs svepelektronmikroskopi för att datera endometriet med hjälp av ytstrukturen. Biokemiska implantationsfönstret Det befruktade ägget och livmoderslemhinnan måste kunna kommunicera med varandra. Den första signalen från embryot är human chorionic gonadotropin (hcg). Denna signal ändrar cyklisiteten till ett kontinuerligt förlopp. Det är troligt att embryot påverkar utvecklingen av livmoderslemhinnan. Leukemia inhibitory factor (LIF) är en cytokin som behövs för en fungerande implantation. Detta visades först i knockout möss med genen för LIF utslagen. I dessa mushonor implanterade inte musembryot, även om dessa kom från en normal mus (5). Det är också troligt att LIF har betydelse för den humana implantationsprocessen (6). LIF ökar tydligast i endometriets körtelepitel samtidigt som LIF-receptorn ökar i endometriets ytepitel vid tiden för implantation (Figur 3) (7). Det är därför troligt att LIF är viktigt både vid signaleringen Progesteron LIF LIF-receptor LIF Trx ROS? Grx ErbB4 HB-EGF Integrin v 3 Figur 4. Förenklad schematisk bild över den initiala fasen av den humana implantationsprocessen. Progesteron är viktigt för att endometriet ska utvecklas och bli mottagligt för ett embryo. Leukemia inhibitory factor (LIF) syntetiseras både av embryot och endometriet, och antalet LIFreceptorer ökar i ytepitelet vid tiden för implantation. Embryot syntetiserar fria radikaler, och det spekuleras i att detta skulle kunna vara en signal till endometriet. Glutaredoxin (Grx) ökar i pinopoderna vid tiden för implantation medan thioredoxin (Trx) finns närvarande i endometriet under hela cykeln. Grx och Trx har troligen också till uppgift att ta hand om fria radikaler som bildas under implantationsprocessen. Heparin binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) finns i ytepitelet i ökad mängd under implantationsfönstret. HB-EGF syntetiseras av endometriet och binder till receptorer på blastocystens yta. HB-EGF kan också finnas på pinopodernas yta, och kan tillsammans med integrinavb3 bilda ett komplex som kan främja adhesion av blastocysten. 12 LABORATORIET 1/2003

5 mellan blastocysten och endometriet och också under senare skeden av implantationsprocessen (Figur 4). HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor) är en tillväxtfaktor, som dels kan finnas bunden på cellytan eller dels som obunden tillväxtfaktor som signalsubstans mellan celler (8). Vi har använt både vanlig immunhistokemi och konfokalmikroskopi för att visa att HB-EGF ökar i endometriet när pinopoderna finns närvarande, och finns både cytosolärt och som en faktor bunden på pinopodernas yta (Figur 3 och 5) (9). Detta pekar mot att HB-EGF har flera olika funktioner under implantationsprocessen: dels som kommunikationssubstans mellan det befruktade ägget och livmoderslemhinnan, och dels som en faktor som underlättar vidhäftningen av det befruktade ägget till livmoderslemhinnan (Figur 3). Vid biokemiska processer bildas fria radikaler (reaktiva ämnen) som kroppen måste försvara sig emot. Glutaredoxin är ett ämne som används av kroppen som skydd mot fria radikaler. Detta ämne finns rikligt representerat i pinopoderna (10), och fungerar troligen som ett skydd både för embryot och för livmoderslemhinnan under implantationsprocessen. Det är också tänkbart att blastocysten signalerar med hjälp av fria radikaler (Figur 4). Klinisk relevans Som en fortsättning på projektet ska vi studera livmoderslemhinnan från kvinnor som inte kan bli gravida. Det ger en möjlighet att kunna hitta skillnader mellan fertila och icke fertila kvinnor, vilket kan skapa förutsättningar att utveckla en ny typ av behandling vid provrörsbefruktning. Genom att ta biopsier från kvinnor som går igenom provrörsbefruktning, kan man avgöra om livmoderslemhinnan mognar på rätt sätt, och man kan därmed avgöra när man ska göra embryotransfer, och om man i sådana fall behöver ge kvinnorna extra progesteron. Det finns kvinnor som trots återinföring av normala embryon inte blir gravida utan att det går att hitta en orsak till infertiliteten. Det finns då skäl att misstänka att livmoderslemhinnan är defekt och därför inte blir mottaglig för ett embryo. Vi har idag inga diagnostiska markörer för att upptäcka onormala egenskaper hos livmoderslemhinnan. Våra studier kan bidra till att hitta sådana markörer En onormal implantationsprocess kan leda till preeclapsi (havandeskapsförgiftning). Med en ökad kunskap om implantationsprocessen skulle man eventuellt kunna förhindra att dessa fall inträffar i framtiden. En ökad kunskap om implantationsprocessen skulle också på sikt också kunna leda till att nya typer av preventivmedel utvecklas. Referenser 1. Bentin-Ley U., Horn T., Sjögren A., Sorensen S., Falck-Larsen J., Hamberger L. Ultrastructure of human blastocystendometrial interactions in vitro. J Reprod Fertil 120, (2000) 2. Landgren B-M., Johannisson E., Stavreus-Evers A., Hamberger L., Eriksson H. A new method to study the process of implantation of a human blastocyst in vitro. Fertil Steril 65, (1996) 3. Stavreus-Evers A., Hovatta O., Eriksson H., Landgren B-M. Development and characterization of an endometrial tissue culture system. Manuscript (2003) 4. Stavreus-Evers A., Nikas G., Sahlin L., Eriksson H., Landgren B-M. Formation of pinopodes in human endometrium is associated with the concentrations of progesterone and progesterone receptors. Fertil Steril 76, (2001). 5. Stewart C.L., Kaspar P., Brunel L.J., Bhatt H., Gadi I., Kotgen F. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukemia inhibitory factor. Nature 359, (1992) 6. Tsai H-D., Chang C-C., Hsieh Y-Y., Lo H-Y. Leukemia inhibitory factor expression in different endometrial locations between fertile and infertile women throughout different menstrual phases. J Ass Reprod Fertil 17, (2000) 7. Aghajanova L., Stavreus-Evers A., Nikas Y., Hovatta O., Landgren B-M. Co expression of pinopodes and leukemia inhibitory factor, as well as its receptor in human endometrium. Fertil Steril in press Raab G., Klagsbrun M. Heparin binding EGF-like growth factor. Biochim Biophys Acta 1333, F179-F200 (1997) 9. Stavreus-Evers A., Aghajanova L., Brismar H., Eriksson H., Landgren B-M., Hovatta O. Coexistence of heparinbinding epidermal growth factor-like growth factor and pinopodes in the human endometrium at the time of implantation. Mol Hum Reprod 8, (2002a) 10.Stavreus-Evers A., Masironi B., Landgren B-M., Holmgren A., Eriksson H., Sahlin L. Immunohistochemical localization of glutaredoxin and thioredoxin in human endometrium: a possible association with pinopodes. Mol Hum Reprod 8, (2002b) Artikeln beskriver det forskningsområde som Anneli Stavreus-Evers disputerade på hösten Hon är presenterad i Laboratoriet 6/2002. Figur 5. Konfokalmikroskopisk bild som visar att HB-EGF finns i cytoplasman, men också på ytan av pinopoderna. LABORATORIET 1/