Correlations between unexplained infertility and single nucleotide polymorphism in the genes of leukemia inhibitory factor receptor and gp130

Transkript

1 Correlations between unexplained infertility and single nucleotide polymorphism in the genes of leukemia inhibitory factor receptor and gp130 Marwa Malki Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete, 15 högskolepoäng Handledare: Anneli Stavreus-Evers Institutionen för kvinnors och barns hälsa Akademiska sjukhuset, Uppsala

2 Abstract About 30 % of all infertile couples suffer from infertility of an unexplained cause. Leukemia inhibitory factor (LIF) is a glycoprotein produced by the endometrium and is an important cytokine in the implantation process. LIF exerts its biological functions through heterodimerization of its two receptors: LIF receptor (LIFR) and gp130. Point mutations in the LIF gene have been associated with female infertility. The aim of this study was to investigate whether single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes of LIFR and gp130 could cause reduced fertility in women. To this end, 115 samples from women diagnosed with unexplained infertility and 191 samples from fertile women were studied. Three SNPs in the gp130 gene and two SNPs in the LIFR gene were analyzed using real-time PCR. One significant difference and a tendency to difference were detected in the gp130 gene for women with unexplained infertility. There were no differences in the LIFR gene variations. In conclusion, polymorphisms in gp130, and thereby disturbances in the LIF pathway, could be one cause for infertility in women diagnosed with unexplained infertility. Key words: Female infertility, leukemia inhibitory factor, mutation, blastocyst implantation, genotyping.

3 Introduktion Ofrivillig infertilitet drabbar mer än 10 % av alla par (Altmäe et al., 2009). Av dessa par är omkring 30 % infertila av okänd orsak och får därmed diagnosen oförklarad infertilitet (Aghajanova et al., 2009). Kvinnor med oförklarad infertilitet har ingen tydlig orsak till sin ofrivilliga barnlöshet. De har normala ovulationscykler, normala hormonprofiler, inga organpatologier och ingen rubbning i endometriets mognad som kan ge en minskning av implantationsreceptiviteten. Det finns inte heller några belägg för att deras partner orsakar infertiliteten (Altmäe et al., 2010). Två faktorer krävs för att en kvinna ska kunna bli gravid: ett livsdugligt embryo och ett mottagligt endometrium. Hos oförklarat infertila kvinnor har embryon av hög kvalitet återförts men ändå har ingen graviditet inträffat (Aghajanova 2010). Implantation av ett embryo när embryo fäster vid uterusväggen är en kritisk punkt vid graviditeten. Självständigt utvecklade preimplantationsembryon blir då beroende av den moderliga miljön och ett kontrollerat samspel fordras för embryots fortsatta utveckling (Stewart et al., 1992). Viktiga interaktioner mellan embryo och endometrium startar dock redan innan embryot fäster till epitelytan i uterus. Tillväxthormoner och cytokiner produceras aktivt av både blastocyst och endometrium. Samspelet sker dels genom sekretion av flera ligander från embryo till receptorerna leukemia inhibitory factor (LIF), fukosylerade oligosackarider och ghrelin på endometriet. Det sker även genom sekretion av endometriets ligander till receptorer uttryckta på det tidiga embryot såsom LIF, heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) och insulin growth factor. Därefter följer en komplex kaskad av cell-cell och parakrina interaktioner mellan embryot och moderns endometrieyta. Blastocysten fäster till endometriet och decidualiseringen en adaption av uterus för att möjliggöra implantation i endometriet ökar. Detta följs av att trofoblaster tränger in i endometriet för att senare bilda en placenta (Aghajanova 2010, Lindhard et al., 2002). Ett mottagligt endometrium är en väsentlig faktor vid implantation och följer en kvinnas menstruationscykel. Menstruationscykeln delas in i tre perioder efter de förändringar som sker i endometriet: menstruationsfas, proliferationsfas och sekretionsfas. Under menstruationsfasen sker en avstötning av endometriets ytskikt som sedan återuppbyggs i proliferationsfasen. Endometriet förbereds för implantation av ett embryo vid sekretionsfasen och det är endast under en specifik tid i mitten av fasen som en implantation kan inträffa. Denna period kallas

4 window of implantation (WOI) och sker då komplexinteraktioner mellan flera faktorer skapar ett receptivt endometrium för blastocystimplantation. Ett samspel med olika signalsubstanser mellan embryo och moderns uterus är alltså viktigt för en lyckad implantation. Leukemia inhibitory factor (LIF) är ett av de viktigaste och mest studerade ämnena relaterade till en lyckad implantation (Aghajanova et al., 2009, Aghajanova 2010). LIF identifierades och karaktäriserades första gången genom dess förmåga att sätta igång differentiering av myeloiska leukemiceller (Gearing et al., 1987). Sedan dess har LIF visats vara viktigt i flera biologiska aktiviteter, däribland en lyckad implantation av ett embryo. LIF-mRNA och -protein produceras in vivo i mänsklig uterus och uttrycks i livmoderkörtlar under menstruationscykelns sekretionsfas. LIF har detekterats under WOI hos både fertila och infertila kvinnor, dock med betydligt lägre koncentrationer hos oförklarat infertila kvinnor (Laird et al., 1997). LIF är ett glykoprotein tillhörande gruppen interleukin-6 (IL-6). Cytokinerna i gruppen har en liknande struktur och har transmembranproteinet gp130 som gemensam signalreceptor. Växelverkan av LIF sker genom heterodimerisering av leukemia inhibitory factor receptor (LIFR). Dess aktivering sker genom att LIF binder till LIFR som finns på cellytan och är ett transmembranprotein bestående av två subenheter: LIF receptor-β (LIFRβ) och gp130. LIF binder specifikt till LIFRβ med låg affinitet och vid bindning induceras en konformationsändring av komplexet som skapar en heterodimerisering av subenheterna. På så sätt skapas ett receptor-ligandkomplex med hög affinitet. Komplexet kan inducera en signal och därmed aktivera de intracellulära signaleringsvägarna janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT), mitogen-activated protein kinase (MAPK) och phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine protein kinase (PI3K/AKT) (Kimber, 2005, Song et al., 2006, Aghajanova 2010). JAK/STAT spelar en viktig roll i regleringen av bland annat cellapoptos, differentiering och proliferation, MAPK främjar celladhesion, proliferation, migration och överlevnad medan PI3K/AKT reglerar cellmetabolism, proliferation och överlevnad (Dressen et al., 2007). SOCS1-genen kodar för proteinet supressor of cytokine signaling 1 som inhiberar JAK/STAT genom samverkan med dess receptor JAK. SOCS1 inhiberar därmed LIFmedierad signalering och är uttryckt under tidig graviditet i human placenta (Aghajanova et al., 2009). Genom immunofärgning har det visats att endometriet från fertila kvinnor har höga nivåer av LIFR och gp130 jämfört med låga SOCS1-nivåer under menstruationscykelns sekretionsfas. Denna reglering skiljer sig hos kvinnor med oförklarad infertilitet, där istället

5 nivån av SOCS1 i endometriet är högre kombinerat med lägre halter av LIFR och gp130. Det är därför troligt att signaleringsvägen för LIF är påverkad hos dessa kvinnor och möjligtvis kan vara en förklaring till deras infertilitet (Aghajanova et al., 2009). Mutationer misstänks vara orsak till barnlösheten hos infertila kvinnor, men några underliggande genetiska förändringar har inte kunnat påvisas (Giess et al., 1999). Stewart et al. har i en studie av knock-out möss visat ett samband mellan infertilitet och LIF-gendefekt. Möss med LIF-genen inaktiverad utvecklades normalt och visade inga större fenotypiska förändringar med enda undantaget att honmöss med en homozygot LIF-geninaktivering inte blev gravida. Honorna var fertila blastocyster hittades i deras uterus men dessa kunde varken implanteras eller utvecklas. Uterus visade endast ett mycket litet tecken på decidualisering; den var blek och mindre vaskulär än normalt. Blastocysterna var dock livsdugliga och kunde implanteras samt utvecklas hos en recipient utan LIF-defekt. Vad gäller hanmöss med homozygot inaktivering på LIF-genen har det visats att dessa är fertila och kan få avkomma med både honor utan LIF-defekt och heterozygot-defekta honor (Stewart et al. 1992). Förutom vid preimplantation och implantation har LIF visats vara viktig även vid embryoutveckling och placentation. Möss med en LIFR-mutation visar en störd placentation vilket leder till dålig intrauterin näring hos fostret och postnatal död inom 24 timmar. En homozygot genmutation i gp130 gör dock att fostret dör före födseln, möjligen som konsekvens av dess funktion hos även de andra cytokinerna tillhörande IL-6 gruppen (Lindhard et al., 2002). Undersökningar har gjorts av infertilitet hos människor som konsekvens av mutationer hos LIF-genen. Giess et al. undersökte alla tre kodande exoner på den mänskliga LIF-genen för att påvisa eventuell förekomst av mutationer hos kvinnor med infertilitet av olika orsaker. Det antogs att kvinnor med en homozygot defekt skulle vara helt infertila och att kvinnor med en heterozygot defekt av translationen skulle ha en reducerad biotillgänglighet och/eller strukturella förändringar av produkten av LIF-genen. Heterozygota punktmutationer i LIF hittades hos ett fåtal kvinnor med infertilitet. Motsvarande regioner i LIF-proteinet tror man är mycket viktiga för växelverkan med LIFR och förändringar i dessa borde därför leda till en minskad biologisk aktivitet av LIF-proteinet. Endast en homozygot polymorfism hittades i en icke-kodande region och bland fertila kontroller. Resultaten antyder att en heterozygot form av en LIF-genmutation kan ge upphov till minskad tillgänglighet och/eller biologisk aktivitet av LIF i uterus och leda till infertilitet hos kvinnor (Giess et al., 1999). En senare studie där sambandet mellan mutationer och infertilitet också undersöktes stöder inte hypotesen att LIF-

6 genmutationer kan orsaka implantationsmisslyckanden. I den studien upptäcktes ingen mutation bland infertila kvinnor (Steck et al., 2004). Nyligen gjordes ännu en studie av hur en mutation i LIF-genen kan påverka fertiliteten. Frekvensen av mutationer i LIF-genen visar sig vara förhöjd hos infertila kvinnor i jämförelse med fertila. Studien visar även att mutationerna hos infertila kvinnor kan kompenseras och att en behandling därmed kan lyckas (Novotny et al. 2009). Det gäller även för gendefekta möss där chansen till embryoimplantation ökar vid behandling som ökar nivån av LIF-mRNA (Giess et al., 1999). En människas genom består till 99,9 % av DNA-sekvenser som är identiska mellan olika individer. Resterande 0,1 % representerar främst så kallade single nucleotide polymorphism (SNP) som är den vanligaste formen av genetisk variation hos människan. SNP innebär en substitution av ett enkelt baspar och inträffar med en frekvens av cirka 1 baspar (bp) per 1000 bp. För att mutationen ska kunna betecknas som en SNP ska den minst förekommande genotypen ha en frekvens på minst 1 % hos en befolkning (Johnson et al., 2004). Syftet med min studie var att studera SNP hos kvinnor med diagnosen oförklarad infertilitet och att jämföra dessa med SNP hos fertila kvinnor. Undersökningen gjordes på generna som kodar för receptorerna LIFR och gp130 och hypotesen var att SNP i dessa gener kan vara en bakomliggande orsak till oförklarad infertilitet. Genen som kodar för LIFR har sitt lokus i kromosom 5 och innehåller mer än 70 kilobaspar (kb) med 20 exoner (Tomida et al., 1996). Gp130-genen, som har storleken 51 kb, finns också i kromosom 5 och innehåller 17 exoner (Szalai et al., 2000). Material och metod Provmaterial Försöksmaterialet innefattade 306 prover tagna vid Akademiska sjukhuset, Uppsala, Sverige och Karolinska Institutet i Huddinge, Stockholm, Sverige. Proverna hade samlats sedan 2007 och förvarats vid -20ºC eller -70ºC. Från vissa av proverna hade DNA tidigare renats fram från fryst helblod. Av proverna var 115 från kvinnor med diagnosen oförklarad infertilitet och 191 från kvinnor som blivit gravida på naturligt sätt. Projektet var godkänt av etikprövningsnämnden (Dnr: 2009/498) och var en del av en stor studie där också LIF- samt SOCS1-genen blev analyserade.

7 DNA-extrahering DNA renades fram enligt QIAamp DNA Blood Maxi kit, (QIAGEN, Hilden, Tyskland), med få undantag. All centrifugering gjordes i 20ºC. Överföring till filterkolonn gjordes i två steg med centrifugering vid 1000 x g i 3 min efter varje gång. Tvätt utfördes genom centrifugering vid 1780 x g 2 min med tvättbuffert AW1 och 20 min med tvättbuffert AW2. Eluering av DNA gjordes genom tillsats av 800 µl elueringsbuffert (AE) två gånger med centrifugering vid 1780 x g 2 min efter första och 5 min efter andra tillsatsen. Eluatet samlades upp för att sedan frysas -20ºC/-70ºC. Koncentrationsbestämning Koncentrationsmätning av DNA gjordes enligt Quant-iT dsdna BR Assay Kit, (invitrogen, Eugene, OR USA) med en Qubit fluorometer (invitrogen, Eugene, OR USA). SNP-genotypning med realtids-pcr PCR-maskinen som användes för analysen var StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA USA). Följande SNP-primers användes för genotypningen; TaqMan SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA USA) med Assay ID C_ _10 (rs ), C_ _10 (rs891012), C_ _10 (rs ), C_ _10 (rs ) och C_ _10 (rs ). SNP-primer späddes 1:4 i Tris-EDTA buffert (TE). En stamlösning innehållande primer samt TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA USA) tillreddes. Varje brunn på en PCR-platta med 96 brunnar innehöll 1,25 µl utspädd primer, 12,5 µl Master Mix samt 10,25 µl DNas-fritt vatten. Slutligen tillsattes 1 µl DNA från försöksmaterialet i varje brunn och 1 µl DNas-fritt vatten i tre brunnar för negativa kontroller. Plattan centrifugerades 220 x g i 2 min (4ºC). PCR-analysen innefattade ett initialt steg på 95ºC i 10 min, därefter 45 cykler med 92ºC i 15 sek och 60ºC i 1 min enligt TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol, (Applied Biosystems, Foster City, CA USA).

8 Statistiska analyser Statistiska analyser gjordes med programmet Statistical Package for Social Sciences statistical software (SPSS v. 17,0 for PC; SPSS Inc., Chicago, IL USA). Ett p-värde räknades ut enligt Pearson s Chi Square med samma program och värden 0,05 ansågs som statistiskt signifikanta. Uträkningar av eventuella avvikelser från Hardy-Weinbergs jämviktslag gjordes (Microsoft Office Excel 2007, Microsoft Corporation, Redmond, WA USA) och ett värde mellan 0,05> >3,8 godkändes. Resultat Analysen med fluorometer visade att det erhållna DNA:t var av tillräcklig renhet för en analys med PCR. SNP analyserades i generna för gp130 samt LIFR genom de tag SNP som valts till studien. Polymorfismer i gp130-genen (rs , rs och rs ) visas i tabell 1. Polymorfismer i LIFR-genen (rs och rs ) visas i tabell 2. Gruppen infertila kvinnor separerades från fertila kontroller. Alla resultat var inom jämvikt för Hardy- Weinbergs lag vilket ses i båda tabellerna. I tabellerna ses även frekvensen av homozygota och heterozygota genotypsvariationer samt allelfrekvens hos båda dessa grupper. Signifikanta skillnader i allelfrekvens mellan kontroller och infertila hittades i polymorfismen A/T för rs med en prevalens för A på 89 % respektive 95 % (p=0,015). I övrigt sågs inga signifikanta skillnader mellan grupperna (tabell 1 och 2). Tabell 1: Heterozygot och homozygot polymorfism samt allelfrekvens i genen gp130. Grupperna med fertila kvinnor och kvinnor med diagnosen oförklarad infertilitet har frånskilts. visar Hardy- Weinbergs jämviktstest. P-värdet är enligt Pearson s Chi Square och indikerar statistisk signifikans på skillnaden mellan studiegrupperna. Kontroller n (%) Infertila n (%) p-värde Gp130 AA 161 (80,9) 96 (89,7) rs AT 34 (17,1) 11 (10,3) A/T TT 4 (2,0) 0,180 0 (0,0) 0,575 0,083 p (A) 0,894 0,949 q (T) 0,106 0,051 0,015 Gp130 TT 0 (0,0) 0 (0,0) rs TC 14 (7,0) 14 (13,1) [T/C] CC 185 (93,0) 0, (86,9) 0,469 0,064 p (T) 0,035 0,065 q (C) 0,965 0,935 0,068 Gp130 AA 98 (49,7) 49 (45,8) rs AG 78 (39,6) 46 (43,0) [A/G] GG 21 (10,7) 0, (11,2) 0,809 0,803 p (A) 0,695 0,673 q (G) 0,305 0,327 0,314

9 Tabell 2: Heterozygot och homozygot polymorfism och allelfrekvens i genen LIFR. Grupperna med fertila kvinnor och kvinnor med diagnosen oförklarad infertilitet har frånskilts. visar Hardy- Weinbergs jämviktstest. P-värdet är enligt Pearson s Chi Square och indikerar statistisk signifikans på skillnaden mellan studiegrupperna. Kontroller n (%) Infertila n (%) p-värde LIFR GG 6 (3,0) 7 (6,5) rs GA 67 (33,7) 31 (29,0) [G/A] AA 126 (63,3) 0, (64,5) 0,187 0,282 p (G) 0,198 0,210 q (A) 0,802 0,790 0,403 LIFR TT 0 (0,0) 0 (0,0) rs TC 21 (10,6) 7 (6,6) [T/C] CC 177 (89,4) 0, (93,4) 0,725 0,174 p (T) 0,053 0,033 q (C) 0,947 0,967 0,180 Diskussion Genvariationer har visats spela en stor roll för människors benägenhet till olika sjukdomar (Johnson et al., 2004). Frågeställningen i min studie var om genvariationer även har en betydelse i reproduktionsförmågan hos kvinnor. För detta ändamål studerades generna för LIFR och gp130, de två receptorer som behövs för LIF-aktivering. LIF är en viktig cytokin i samspelet mellan endometrium och embryo vid implantation (Aghajanova 2010). De SNP i gp130-genen som valts för studien finns på genens intron: rs på intron 15, rs på intron 14 och rs på intron 5. Introner kodar inte för aminosyrasyntes vid translation och därför sker inget direkt utbyte av aminosyror i samband med polymorfism. Man har visat att polymorfism i introner kan påverka splitsning av mrna och/eller transkription i en gen och därmed ändra kvaliteten och/eller kvantiteten på mrna- och proteinuttrycket (Suzuki et al., 2004). Ingen av de SNP som analyserades i den här studien har tidigare undersökts i relation till fertilitet och reproduktion. SNP i rs och rs (gp130-genen) har studerats där en association till metabolt syndrom hittats (Gottardo et al., 2008). Polymorfism i gp130 i övrigt har även associerats till risk för myelom (Birmann et al., 2009), kardiovaskulära sjukdomar (Benrick et al., 2008), typ-2 diabetes (Wang et al., 2005) och fetma (Wolford et al., 2003). Polymorfism i rs i gp130-genen visade sig skilja grupperna infertila samt fertila kvinnor i min studie. Dessutom hade fertila kvinnor en högre frekvens av minor allele och homozygota mutationer i denna SNP än infertila kvinnor. Frågan blir därför om homozygota

10 mutationer och högre frekvens av minor allele är fördelaktig för kvinnors reproduktionsförmåga. Liknande resultat visades i en studie där oförklarad infertilitet associerades med polymorfism i en gen inblandad i folatmetabolism. I den studien hittades en högre frekvens av homozygota mutationer i solute carrier family -genen hos fertila kontroller än hos infertila kvinnor (Altmäe et al., 2009). I övrigt visade polymorfism i rs (gp130-genen) en tendens att skilja grupperna åt (p=0,064). Studien innefattade sammanlagt 306 prover varav 115 var från oförklarat infertila kvinnor, vilket är en stor omfattning för en sådan studiegrupp. Ännu fler personer skulle därför antagligen inte ha gett en statistisk signifikans på rs De SNP som undersökts i LIFR-genen är båda på icke-kodande nedströmsregioner. Här hittades inga skillnader i polymorfism mellan de två grupperna. Man kan dock inte veta om detta gäller hela LIFR-genen eller om det bara var dessa icke-kodande regioner som inte visade intressanta resultat. Ingen slutsats kan därför dras vad gäller LIFR-genen. I denna studie användes TaqMan realtids-pcr för analys av SNP. PCR-metoden använder två specifika prober där varje probe är komplementär till var sin allel-variant i en polymorfism. Genom fluorescens går det att mäta vilka prober som kunnat binda till DNA-strängen och på så sätt få ett svar på genotypen. Metoden är robust, felnivån i genotypning är mycket låg och metoden går att automatisera, vilket minskar risken för laborativa felkällor. Resultaten erhålls enkelt och direkt genom mätning av fluorescensen (Seeb et al., 2009). Tidigare har metoder baserade på restriction fragment length polymorphism (RFLP) använts mycket för att detektera SNP. Restriktionsenzymer (endonukleaser) klyver regionerna av polymorfism på DNA-strängen och genom användning av gel-elekrofores separeras fragmenten. Antal och storlek på fragmenten anger polymorfismen. I jämförelse med realtids- PCR är denna metod dyrare, samt mer arbets- och tidskrävande. Dessutom kräver den manuell avläsning vilket inkluderar felkällor på den mänskliga faktorn. Avläsningen kan också lätt bli felaktig på grund av ofullständig enzymklyvning av endonukleaset (Johnson et al., 2004). Pyrosekvensering är en annan DNA-sekvenseringsmetod där komplementära strängar till en DNA-sträng syntetiseras enzymatiskt. Bindning av nukleotider till en DNA-mall får pyrofosfat (PPi) att lösgöras och ATP att bildas. Genom en enzymreaktion leder detta till att ljus att genereras, vilket blir ett mått på DNA. Metoden är enkel och använder sig av varken märkta primers, märkta nukleotider eller gel-elektrofores. Pyrosekvensering är en alternativ metod till realtids-pcr. Precisionen, felnivån och tidsåtgången är ungefär desamma för de två

11 metoderna. Med pyrosekvensering erhålls också enkelt ett resultat som är tillförlitligt (Nordfors et al., 2002). Kvinnor med oförklarad infertilitet är en ovanlig studiegrupp eftersom den inte anses vara homogen. Dessutom kan vissa av kvinnorna ha blivit felaktigt diagnosticerade som oförklarat infertila när den egentliga orsaken är endometrios. Endometrios är en kronisk inflammatorisk sjukdom som kan leda till infertilitet hos kvinnor. Den kännetecknas av en extrauterin tillväxt av endometriets körtlar och stroma (Novotny et al., 2009). Sjukdomen kan endast säkerställas med laparoskopi och i de fall då detta inte gjorts och en kvinna inte visat några kliniska tecken till sjukdomen kan hon ha fått en felaktig diagnos (Altmäe et al., 2009). Sammanfattningsvis visar min studie att polymorfism i gp130-genen kan bidra till problem med bindning av LIF och andra interleukiner och därmed orsaka reproduktionsproblem hos vissa kvinnor med oförklarad infertilitet. Detta kan vara en delförklaring till försämrad fertilitet hos kvinnor. Analys av fler SNP skulle dock ha kunnat ge en större kunskap om hur genetiska variationer påverkar fertiliteten. Homozygota mutationer i gp130-genen och en högre frekvens av minor allele har visat sig vara bättre för fertilitet, eftersom frekvensen av dessa var högre hos fertila än hos infertila kvinnor i min studie. Polymorfism i LIFR-genen som orsak till infertilitet kunde inte påvisas.

12 Acknowledgement Ett stort tack till Anneli Stavreus-Evers för en mycket bra handledning i mitt projekt. Jag vill även tacka Theodora Kallak för all hjälp med experiment, uträkningar och tolkningar och ett tack till Signe Altmäe för hjälp med informationssökning och skrivarbete. Referenser Aghajanova L. Update on the role of leukemia inhibitory factor in assisted reproduction. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology 2010; 22: Aghajanova L, Altmäe S, Bjuresten K, et al. Disturbances in the LIF pathway in the endometrium among women with unexplained infertility. Fertility and Sterility 2009; 91: Altmäe S, Martínez-Conejero JA, Salumets A, et al. Endometrial gene expression analysis of the time embryo implantation in women with unexplained infertility. Molecular Human Reproduction 2010; 16: Altmäe S, Stavreus-Evers A, Ruiz JR, et al. Variations in folate pathway genes are associated with unexplained infertility. Fertilty and Sterility 2009; Epub ahead of print. Benrick A, Jirholt P, Wernstedt I, et al. A non-conservative polymorphism in the IL-6 signal transducer (IL6ST)/gp130 is associated with myocardial infarction in a hypertensive population. Regulatory Peptides 2008; 146: Birmann BM, Tamimi RM, Giovannucci E, et al. Insulin-like growth factor-1- and interleukin-6-related gene variation and risk of multiple myeloma. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 2009; 18: Dressen O, Brivanlou AH. Signaling pathways in cancer and embryonic stem cells. Stem Cell Reviews 2007; 3:7-17. Gearing DP, Goughl NM, King JA, et al. Molecular cloning and expression of cdna encoding a murine myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF). The EMBO Journal 1987; 6: Giess R, Tanasescu I, Steck T, et al. Leukemia inhibitory factor gene mutations in infertile women. Molecular Human Reproduction 1999; 5: Gottardo L, De Cosmo S, Zhang YY, et al. A polymorphism at the IL6ST (gp130) locus is associated with traits of the metabolic syndrome. Obesity 2008; 16: Johnson VJ, Yucesoy B, Luster MI. Genotyping of single nucleotide polymorphisms in cytokine genes using real-time PCR allelic discrimination technology. Cytokine 2004; 27:

13 Kimber SJ. Leukemia inhibitory factor in implantation and uterine biology. Reproduction 2005; 130: Laird SM, Tuckerman EM, Dalton CF, et al. The production of leukemia inhibitory factor by human endometrium: presence in uterine flushings and production by cells in culture. Human Reproduction 1997; 12: Lindhard A, Bentin-Ley U, Ravn V, et al. Biochemical evaluation of endometrial function at the time of implantation. Fertility and Sterility 2002; 78: Nordfors L, Jansson M, Sandberg G, et al. Large-scale genotyping of single nucleotide polymorphisms by pyrosequencing and validation against the 5 nuclease (TaqMan ) assay. Human Mutation 2002; 19: Novotny Z, Krizan J, Sima R, et al. Leukemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women diagnosed with unexplained infertility and endometriosis have a negative impact on the IVF outcome. A pilot study. Folia Biologica (Praha) 2009; 55: Seeb JE, Pascal CE, Ramakrishnan R, et al. SNP genotyping by the 5 -nuclease reaction: advances in high-throughput genotyping with nonmodel organisms. Methods in Molecular Biology 2009; 578: Song H, Lim H. Evidence for heterodimeric association of leukemia inhibitory factor (LIF) receptor and gp130 in the mouse uterus for LIF signaling during blastocyst implantation. Reproduction 2006; 131: Steck T, Giess R, Suetterlin MW, et al. Leukemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women with unexplained infertility and recurrent failure of implantation after IVF and embryo transfer. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 2004; 112: Stewart CL, Kaspar P, Brunet LJ, et al. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukemia inhibitory factor. Nature 1992; 359: Suzuki A, Ji G, Numabe Y, et al. Single nucleotide polymorphisms associated with aggressive periodontitis and severe chronic periodontitis in Japanese. Biochemical and Biophysical Research Communications 2004; 317: Szalai C, Toth S, Falus A. Exon-intron organization of the human gp130 gene. Gene 2000; 243: Tomida M, Gotoh O. Structure of the Gene Encoding the Human Differentiation-Stimulating Factor/Leukemia Inhibitory Factor Receptor. Journal of Biochemistry 1996; 120: Wang H, Zhang Z, Chu W, et al. Molecular screening and association analyses of the interleukin 6 receptor gene variants with type 2 diabetes, diabetic nephropathy, and insulin sensitivity. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2005; 90: Wolford JK, Colligan PB, Gruber JD, et al. Variants in the interleukin 6 receptor gene are associated with obesity in Pima Indians. Molecular Genetics and Metabolism 2003; 80: