MALDI-TOF. paradigmskifte inom bakteriologi

Transkript

1 MALDI-TOF paradigmskifte inom bakteriologi

2 Traditionell mikrobiologi Biokemiska tester Agglutinationer Detektivarbete 16S rrna

3 Hur började det? 80-talet Nobelpristagarna (Fenn, Tanaka) (Hillenkampf) - Jonisering av stora molekyler Början av 90-talet Pionjärerna - Whole cell MALDI (Cain 1994, Holland 1996) Slutet av 90-talet Utvecklarna - Fokus på provpreparation, extraktion, applicering av prov (Wang 1998, Fenslau-Dimirev 2001) Början av 2000-talet De första databaserna (Jarman 2000, Bright 2002) Betydelse av odlingsförhållanden (Valentine 2005) Bra review: Šedo et al Mass Spectrometry reviews 2011

4 Vad är aktuellt för mikrobiologi? Microflex + Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics) VitekMS (BioMerieux)

5 Hur funkar det?

6 Vad gör mass-spektrometern? Laser bombarderar provpunkterna (Laser Desorption) Excitation av matrix (Matrix Assisted) jonisering av proteiner, proteinfragment (Ionization) Separation i vacuum (flygrör) Detektion av energi i en detektor och uträkning av flygtid (Time Of Flight) ger ett så kallat m/z kvot som kan översättas med molekylvikt (Da)

7

8 Hur skiljer man olika bakterier? N.gonorrhoeae N.meningitidis Ilina et al. Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 11, No. 1, January 2009

9 Hur fungerar databasen?

10 Hur rapporteras svaret BioMerieux (IVD) % sannolikhet för viss art T.ex Escherichia coli 99% I studier anges >90% som säker genus >98% som säker species Bruker (Biotyper) Score value (0-3) på de två bästa träffarna T.ex. Escherichia coli ATCC 25922: kan expanderas till de 10 bästa träffarna Det vanligaste som används är >1.7 säker genus >2.0 säker species

11 Begränsningar Streptococcus mitis kan bli rapporterade som S.pneumoniae Hjälp på väg? (Werno JCM 2012, Ikriyinakova CMI 2012) Shigella spp rapporteras som E.coli Med varning på alla Några mindre grupper av Enterobacteriaceae kommer vara svåra att säkert få ut till speciesnivå. Men hur säkra är vi med de gamla metoderna?

12 ID direkt från blododlingar Positivt larm lysering extraktionsprocedur med många centrifugeringar och pipetteringar applikation av supernatant på MALDI-platta analys Flera metoder beskrivna. Jämförelse (Chen et al JCM Mars 2013) BACTEC (BD) Sepsityper (Bruker) Egen extraktionsmetod (något sämre men 1$ jmfrt 15$)

13 Direkt ID från blododling (n=202) Vitek MS (IVD) 21 polymikrobiella I alla rapporterades den dominerande 181 monomikrobiella 41% Gram pos 167 species ID (92.3%) MicroflexLT Biotyper 3.0 (Blood culture mode) 21 polymikrobiella I 16 rapporterades bara den dominerande I 5 rapporterades båda med score > monomikrobiella 41% Gram pos 177 species ID (97.8%) Chen et al JCM 2013

14 Direkt ID Utmaning: Whole cell MALDI-TOF behöver bakterier per punkt för att ge bra resultat Urin (Ferreira JCM 2011, Wang JMM 2013) CSF, case report (Nyvang Hartmeyer SJID 2011) Synovial fluid? Ascites? CAPD?

15 Typning Utmaning: Fenotyp genotyp Fylotypning av P.acnes (Nagy Anaerobe 2013) C.difficile (Reil EJCMID 2011, Rizzardi 2013) Invasiva vs icke invasiva GAS (Moura FEMS 2008) S.aureus 197 of 224 isolat blev korrekt identifierade som USA-300 (Boggs JMM 2012) Epidemiologisk typning möjlig och uppdelning i CC (Josten JCM April 2013)

16 Detektion av resistens Utmaning: Resistensdetektion Känslighetstest Påvisa subtyper associerade med resistens Diff between cfia-neg and cfia-pos B.fragilis (Wybo JCM 2011, Nagy J. Med. Microbiology 2011) Påvisa toppar associerade med resistens E.coli, m/z peak of (Camara Anal Bioanal Chem 2007) F.nucleatum m/z peak of (Al-Haroni Oral Microbiol. Immunol. 2008) OmpK36 porin loss in Klebsiella spp. (Cai JCM 2012) Specifika toppar associerade med olika SSCMec i S.aureus (Ultraflex) (Lu Anal Chem 2012) Påvisa hydrolys Betalaktamaser (Sparbier JCM 2012) Karbapenemaser (Brukhardt JCM 2012, Sparbier JCM 2012, Hrabak JCM 2011, 2012, Kempf PLoS One 2012)

17 Hydrolys av Ertapenem ERTAPENEM KPC 15 min (hämmas av APBA) NDM och VIM 2h (hämmas av DPA) ERT + KPC 15 min ERT + KPC + APBA ERT + KPC 15 min Men! OXA-ofullständig hydrolys på 5h (24h) 3 Pseudomonas aeruginosa stammar med VIM hydrolyserar inte alls Sannolikt beroende på samtidig porinförlust. ERT + KPC + APBA Å Johansson et al. manuscript

18

19 Andra funktioner (publikationer) Vitek MS Plus ID från pos blododling (1) ID direkt från Urin (Ja på ECCMID) Karbapenemaser (Ja på ECCMID?) Andra resistensmekanismer (poster MSACL) MicroflexLT Biotyper ID från pos blododling (flera) ID direkt från Urin (flera) Karbapenemaser? (flera) Andra resistensmekanismer (några)

20 Framtida utveckling Bättre algoritmer för att detektera blandflora Ännu bättre databaser Fler specifika toppar som kan associeras med resistens, virulens, typ och sedan integreras i rutindatabas. Fler färdiga metoder från företagen Vissa patent på gång från Bruker. Proteinmönster i infekterade vätskor Fler företag på marknaden? Utveckling av andra joniseringsmetoder?