Nystatin Ett revolutionerande antibiotikum

Transkript

1 Nystatin Ett revolutionerande antibiotikum Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling, 7,5 hp Ht 2010

2 Innehållsförteckning Historisk bakgrund 3 Projektets början.3 Metodbeskrivning för extraktion och isolering av substansen...3 Strukturkemin. 6 Biologisk aktivitet 6 Läkemedelsutveckling.7 Klinisk effekt och användning..7 Referenslista.8 2

3 Historisk bakgrund Nystatin som först benämndes fungicidin, upptäcktes 1950 av Elizabeth Lee Hazen och Rachel Fuller Brown (Hazen och Brown, 1950). Dessa damer utvecklade och patenterade världens första framgångsrika antifungala antibiotikum (Cima, 2010). Detta var den första medlemen utav polyen-makrolid antifungala antibiotika som man fick upp ögonen för (Hazen och Brown, 1950). Svampinfektioner hade varit ett stort problem för soldater i andra världskriget och nya läkemedel så som penicilliner hjälpte inte mot dessa infektioner. Istället dödar dessa kroppens egna bakterier som ingriper vid svampinfektioner. Hazen och Brown ville nu hitta ett nytt läkemedel mot svampinfektioner (Cima, 2010). Hazen arbetade inom New York StateDepartment of Health för att utveckla ett läkemedel som kunde döda olika former utav svamp. Brown befann sig i Albany och hon försåg Hazen med lämpliga bakterier till hennes arbete. Efter månader av kontakt och utbyte av dessa bakterieprover gav arbetet resultat och de fann substansen som slutligen döptes till nystatin efter NY STATe Dept. Of Health. Patent gavs i 25e juni Deras framgång har inspirerat många kvinnor att sträva efter en vetenskaplig karriär (Cima, 2010). Nystatin används fortfarande idag mot olika svampinfektioner hos människan. Den har även använts för att bekämpa Dutch Elm disease hos träd och för att reparera konstverk som förstörts av vatten och lera (Cima, 2010). Projektets början De flesta antibiotika på 1950-talet karakteriserades av en hög bakteriell effekt och liten eller ingen antifungual effekt. Detta uppmärksammade Hazen och Brown. Vid deras projekt för att hitta en substans med antagonistisk effekt för patogen svamp gjordes slutligen en upptäckt då actinomyceter isolerades. En organism som odlades under kontrollerade förhållanden visade sig ge en intracellulär fungual antibiotikisk effekt. Dess egenskaper var både fungistatisk och fungicid och saknade uppenbarligen bakteriell effekt. Organismen hör till familjen Streptomycer och arten Streptomyces noursei och den framtogs först från jord hämtad från en farm i Virginia (Hazen och Brown, 1957). 3

4 Metodbeskrivning för extraktion och isolering av substansen Hazen och Brown beskriver i sin patent-publikation 1957 generellt om hur nystatin kan framhållas vilket beskrivs nedan. Bakterien Streptomycetes nourseri får växa i ett sterilt flytande nutrient-medium innehållande kol och kväve. Nystatinet som skapas erhålls från mycelium. Mycelium är först separerat från den flytande kulturen och sedan extraheras mycelium med ett organiskt lösningsmedel som passar för nystatin, helst en låg alifatisk alkohol. Lösningen av nystatin som erhålls behandlas för vidare rening och koncentrering, alternativt att mycelium medan den befinner sig i flytande cellkultur behandlas, men då måste dock det organiska lösningsmedlet för nystatin vara fettlösligt (Hazen och Brown, 1957). Nedan följer ett exempel på hur nystatin kan framhållas från oförädlat råmaterial av hela grödor vilket beskrivs i ett patent utav Joseph Gerald Renella Det oförädlade koncentratet innehållande nystatin extraheras från en matta av mycelium med flera omgångar metanol. Metanollösningen behandlas med etylacetat och fällning bildas. Fällningen tvättas med 0,85 % natriumklorid-lösning. Därefter återlöses fällningen i metanol och sen tillsätts dietyleter. Låg halt av aktivt kristallint material kan ses från det återstående koncentatet vid fördelning mellan n-butanol och salin och genom tillsats av metanol. Kristallint nystalin av hög renlighet kan observerats genom distribution av partiellt renat nystatin-koncentrat i ett bifasiskt system bestående av n-butanol, metanol, vatten och hexan. Sedan får systemet utsätts för luft tills kristaller uppstår. (Renella, 1970) 4

5 Fig. 1) Isolationsschema för nystatin (Hazen och Brown, 1957). 5

6 Strukturkemin Den steriska strukturen av polyen-makroliden nystatin fastställdes helt Strukturen är uppbyggd av en polyketid bestående av 38 makrolaktonringar med två och fyra konjugerade dubbelbindningar vilka separeras av en mättad bindning. Som alla andra antifungala polyenmakrolider innehåller nystatin mykosamin vilket är bundet till makrolaktonringen på kol 19 med hjälp av en β-glykosidbindning och en karboxygrupp på kol 16. Dessa två grupper tycks även vara viktiga för biologisk akrivitet och toxisitet. Den stökiometriska formeln skrivs C 47 H 75 NO 17 och dess molekylvikt är Da (Nedal, 2007). Fig. 2) Strukturformel för nystatin (Fass.se). Biologisk aktivitet Nystatin produceras av den grampositiva bakterien Streptomyces noursei. Familjen streptomyceter är känd för att producera ett stort antal sekundära metaboliter med olika biologiska aktiviteter. Över 200 av dess genkluster innehar antibiotisk effekt (Volokhan et al,. 2006). Nystatin innehåller tre biologiskt aktiva komponenter, A1, A2 och A3 där A1 är en makrocyklisk lakton. Nystatin verkar genom selektiv bindning till ergosterol i svampars cellmembran (Groll et al,. 2003). I närvaro av ergosterol formar Nystatin hydrofoba kanaler i cellmembranet hos antibiotikakänsliga organismer. Dessa kanaler stör den normala cellulära omgivningen vilket leder till celldöd (Helrich et al,. 2006). Studier har visat att det är kaliumkanaler som formas. Dessa kanaler är permeabla endast för små molekyler, ej större än glukos eller sackaros. Störning i den elektrokemiska gradienten orsakad av ökningen i permeabilitet för joner och små molekyler leder slutligen till lys och celldöd (Coutinho och Prieto, 2003). Nystatin kan också orsaka vesikelbilager fusion. Om det i ett vesikelmembran finns nystatin-kanaler vid fusion av ett fosfolipidlager transporteras dessa kanaler till bilagret. Kanalen vill då producera en plötslig ökning i bilagerkonduktans. Om ingen kolesterol finns närvarande försvinner konduktansen, vesikulärt ergosterol diffunderar in i fosfolipidbilagret och hundratals av små nystatin-kanaler faller sönder. Ergosterodiffusionens hastighet beror på packningen av lipidmembranen där ergosteerol deltar (Helrich et al,. 2006). 6

7 Läkemedelsutveckling Nya formuleringar och manipuleringar för bättre tillgänglighet, effekt och minskade biverkningar av nystatin har varit utav intresse på senare tid i nystatins utveckling. På Karolinska institutet i Stockholm har ett forskningsprojekt kallat Biosergen inriktat sig på att utveckla nya medel mot allvarliga svampinfektioner genom genetisk manipulering av bakterien Streptomyces noursei. Bakterien som framställer nystatin i sin naturliga form och det är generna man vill manipulera för att erhålla svampmedel med bättre effekt och mindre biverkningar (Arwidsson, 2007). En studie 2009 gjordes för att hitta en ny formulering av Nystatin som skulle kunna administreras systemiskt och förhoppningsvis då kunna användas som behandling mot invasiva mykoser. En formulering av nystatin tillsammans med ett kliniskt använt nutritionssupplement, intralipid utvecklades. Formuleringens antifunguala aktivitet och in vitro toxicitet studerades. Fysikaliska egenskaper karakteriserades och stabiliteten vid lagring studerades av preparationen. Kännsligheten för Candida, Aspergillus- och Fusarium-arter bestämdes med LCSI-teknik. In vitro toxicitet av formuleringen bestämdes genom att mäta hemolys av röda blodceller från och lekage av kalium. Resultaten från dessa tester ger oss en ny karakteriserad stabil formulation av nystatin som in vitro aktivitet mot patogen Candida- och Aspergillusarter (Semis et al., 2010). Klinisk effekt och användning Nystatin är ett polyenmakrolid antibiotikum med en potent bredspektrig antifungal effekt. Den har dock en väldigt låg antibakteriell effekt (Coutinho och Prieto, 2003). Nystatin används i mänsklig terapi som behandling mot vissa typer av svampinfektioner (Nedal et al., 2007)såsom oral och intestinal candidasis. Jästliknande svampar hör till de mest känsliga och verkan på Candida albicans är specifik (Fass.se). Vid antibiotikabehandling kan nystatin ges för att förhindra gastrointestinala superinfektioner av Candida. Beroende på koncentrationsnivån som uppnås vid behandling och svampens känslighet har nystatin antingen fungistatisk eller fungicid verkan (Fass.se). Nystatin är ineffektivt vid oral användning och är toxisk vid intravenös administrering, varför den endast används topikalt (Coutinho och Prieto, 2003). Referenslista Arwidsson, H. (2007) En VD svarar. KIbladets näringsliv, s15 Coutinho, A. and Prieto, M. (2003). Cooperative Partition Model of Nystatin Interactionwith Phospholipid Vesicles. Biophysical Journal, 84, Fass.se 7

8 &DocTypeID=3&UserTypeID=0 20/ Groll, A.H., Mickiene, D., Petraitis, V., Petraitiene, R., Alfaro, R., M., King, C., Piscitelli, S.C. and Walsh, T.J. (2003). Comparative Drug Disposition, Urinary Pharmacokinetics, and Renal Effects of Multilamellar Liposomal Nystatin and Amphotericin B Deoxycholate in Rabbits. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, 47:12, Hazen, E. L., and R. Brown. (1950) Two antifungal agents produced by a soil actinomycete. Science, 112, 423. Hazen, E. L., and R. Brown. (1957). Nystatin and methods of producing it. United States Patent Office, patent nr; 2,797,183. Helrich, C.S., Schmucker, J.A. and Woodbury, D.J (2006). Evidence that Nystatin Channels Form at the Boundaries, Not the Interiors of Lipid Domains. Biophysical Journal, 91, Cima, M., Massachusetts Institute of Technology 20/ Nedal, A. (2007). Post-PKS modifications in the biosynthesis of the antifungal antibiotic nystatin. Norwegian University of Science and Technology, Doctoral thesis for the degree of philosophiae doctor (PhD) Nedal, A., Sletta, H., Brautaset, T., Borgos, S.E.F., Sekurova, O.N., Ellingsen, T.E. and B. Zotchev, S.B. (2007). Analysis of the Mycosamine Biosynthesis and Attachment Genes in the Nystatin Biosynthetic Gene Cluster of Streptomyces noursei. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 73:22, Renella, J.G. (1970). Isolation of nystatin. Nited states patent O, patent nr; 3,517,100. Semis, R., Polacheck, I. and Segal, E. (2010) Nystatin-Intralipid Preparation: Characterization and In Vitro Activity Against Yeasts and Molds. Mycopathologia, 169, Volokhan, O., Sletta, H., Ellingsen, T.E, and Zotchev, S.B. (2006). Characterization of the P450 Monooxygenase NysL, Responsible for C-10 Hydroxylation during Biosynthesis of the Polyene Macrolide Antibiotic Nystatin in Streptomyces noursei. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 72: 4,

9 Bilder 1) Hazen, E. L., and R. Brown. (1957). Nystatin and methods of producing it. United States Patent Office, patent nr; 2,797,183. 2) Fass.se &DocTypeID=3&UserTypeID=0 20/