LABORATION ISOLERING AV KINAALKALOIDER

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "LABORATION ISOLERING AV KINAALKALOIDER"

Malin Lindberg
för 8 år sedan
Visningar:

1 LABORATIO ISOLERIG AV KIAALKALOIDER Ur barken från träd i släktet Cinchona kan ett antal alkaloider isoleras. Av de uppemot 25 besläktade s.k. kinaalkaloiderna är kinin och kinidin de viktigaste. Kinin har genom århundranden spelat en viktig roll som antimalariamedel. Idag har dock kinaalkaloiderna kommit lite i skymundan, det finns bara ett kininpreparat registrerat på den svenska marknaden, detta med indikation mot två medfödda muskelkrampsjukdomar och som behandlingsalternativ vid svåra fall av klorokinresistent malaria. Kinidin var tidigare registrerat i Sverige med indikation som profylax mot allvarliga hjärtrytmrubbningar där annan läkemedelsbehandling ej haft effekt eller givit oacceptabla biverkningar (avregistrerat 2007). R O R O kinin R= -OC 3 cinkonidin R= - kinidin R= -OC 3 cinkonin R= - Figur 1. De vanligaste kinaalkaloiderna. Utförande Allt arbete skall ske i de på gruppindelningen anvisade labgrupperna och labparen. Förberedelser åt nästa dags laborationsgrupp 1.25 g kalk (CaO) släcks i en mortel genom portionsvis tillsats av 20 ml vatten. Blandningen försätts sedan med 10 ml 2% (vikt/volym) ao, varefter 10 g kinabark rörs i. Blanda väl, och låt sedan torka i värmeskåp över natt. 51

Idag har dock kinaalkaloiderna kommit lite i skymundan, det finns bara ett kininpreparat registrerat på den svenska marknaden, detta med indikation mot två medfödda muskelkrampsjukdomar och som

2 Dag 1 Extraktion Den torra kinabarken extraheras med 200 ml diklormetan med en Soxhlet-uppsättning (se Fig 2) i ett värmebad på 90 C under 90 minuter. Extraktionen sker kontinuerligt så länge lösningsmedlet hålls kokande i rundkolven. Ångan leds till återloppskylaren där den kondenseras och droppar ned i extraktionsmellandelen. är vätskenivån når upp till sifonens överkant töms vätskan i mellandelen automatiskt ner i rundkolven, varvid allt börjar om på nytt. Lösningsmedlet avdunstas därefter på rotationsindunstare. Se nog till att du förstår funktion och princip hos Soxhlet-apparaten! Fig. 2. Soxhletuppsättningen består av rundkolv 1, extraktionsmellandel 2 och kylare 3. I mellandelen placeras materialet i en extraktionshylsa av papp. Rotationsindunstning a ca 50ml aceton i kyldelen och häll försiktigt i max 100ml kolsyreis. Kontrollera att du har vakuumsug vrid kranen neråt till klockan sex. Lyssna efter en visslande ljud eller sätt handen på glasstycket och känn. Sätt dit rundkolven och tryck på klämman. Starta rotationen ca 1 varv/sekund. Sänk ner i badet, värm till 40 C. Låt indunsta tills vätskan är borta ca 5 min. Dra upp ur badet, stäng av rotationen. Vrid försiktigt upp kranen till klockan tolv till trycket är normalt igen (lyssna). Ta bort klämman. Kupa högerhanden och håll under rundkolven, den vänstra tar tag i mellanstycket. Vrid och vicka med högerhanden och ta bort rundkolven, och förslut sedan rundkolven. Sammanfattning: Återupplösning Kylning ok, på med vakuumsug, på med rundkolv och klämma, på med rotation, och sänk ner i 40 C. Upp ur badet, av med rotation, av med vakuumsug och klämma, vicka loss kolven på med kork. Lös upp extraktet i 10ml 0.01M svavelsyra. Använd en spatel för att skrapa ner extraktet från kanterna. För att bli av med de stora partiklarna, använd glasullsfiltrering. Ta en tuss glasull och stoppa ner i en Pasteur-pipett så det blir ett filter. Sug upp extraktet från rundkolven med en ny Pasteur-pipett och filtrera genom glasullen ner i ett provrör. Sonikera vid behov i ultraljudsbad. Invägning Märk och väg sedan in 4 provrör på analysvåg med tre decimalers noggrannhet, anteckna deras vikt i din labjournal. 52

är vätskenivån når upp till sifonens överkant töms vätskan i mellandelen automatiskt ner i rundkolven, varvid allt börjar om på nytt. Lösningsmedlet avdunstas därefter på rotationsindunstare.

3 Fastfasextraktion (SPE) Konditioneringen av fastfas (SPE)-extraktionskolonnen (Fig 3) i MeO har redan gjorts av labassistenterna. Jämvikta kolonnen med 10 ml 0.01 M svavelsyra, låt ej kolonnen gå torr. Samla upp men spara inte detta första eluat. Från och med nu ska kolonnen gå torr mellan varje steg Applicera det filtrerade provet (i svavelsyra) på den konditionerade kolonnen. 2. Eluera med svavelsyran och spara eluatet (det som runnit genom) i rör nr 1 av de invägda rören. 3. Eluera med 4 ml vatten, spara eluatet i rör nr Eluera med 4 ml etanol, spara eluatet i rör nr Eluera med 5 ml diklormetan, spara eluatet i rör nr i ska nu ha fyra invägda provrör vardera med ett eluat. Efter extraktionens slutförande kasseras SPE-kolonnen. Fig. 3. SPE-kolonnen är packad med 500 mg RP-C18 material. Reservoaren rymmer 10 ml, pilen markerar nivån för ca 1 ml. Vid byte av eluent är det viktigt att gå tillväga på samma sätt varje gång. Tunnskiktskromatografi (TLC) För att kontrollera alkaloidinnehållet i de erhållna fraktionerna används tunnskiktskromatografi (TLC). Applicera tre microcap (låt plattan torka mellan applickationerna) från vardera av fraktionerna och referenslösningen innehållande kinin på kiselgelplattan (kiselgel F254). Fig. 4. TLC-platta. Klipp till de undre kanterna och applicera era fyra prover plus kinin som referens. Låt mobilfasen vandra 80% av plattans längd. Undvik att välta plattorna när ni sätter i och tar upp dem ur vannan (glaslådan), och var noggranna med att sätta ned dem rakt i vannan. Använd handskar när ni tar i plattorna. Rita på dem med en trubbig blyertspenna. Eluera plattan med diklormetan:dietylamin i förhållande 9:1 (elueringsmedel finns färdigblandat av handledare). Kontrollera resultatet med UV-ljus vid våglängderna 254 nm och 366 nm. Välj det eller de rör som ni tror innehåller mest alkaloider med ledning av TLC och märk detta och lämna det till handledaren. Röret skall sedan indunstas över natt för analys på PLC nästkommande dag. 53

5. 1. Applicera det filtrerade provet (i svavelsyra) på den konditionerade kolonnen. 2. Eluera med svavelsyran och spara eluatet (det som runnit genom) i rör nr 1 av de invägda rören. 3.

4 Förberedelser inför dag 2 Anteckna Er tid från schemat för PLC-körningen dag 2. Städa er laborationsplats för nästa laborationsgrupp. antering av avfall Lösningsmedel ska slängas i en av tre märkta flaskor: De icke-halogeniserade lösningsmedlen metanol, etanol, ao och svavelsyra i samma flaska. Diklormetan i en flaska. Mobilfas för TLC (diklormetan + trietylamin) i en flaska. Pipetter ska slängas i vita plastdunkar. Trasiga glasvaror i papperskorgar med blå rand. andskar, pappershanddukar och plast i vanliga papperskorgar. ur ska det städas i dragskåpet? Diska all utrustning ni använt och häng upp på tork. Rundkolven diskas lämpligen med 5 ml diklormetan, 5 ml aceton och sist med vatten och diskmedel. Använda papphylsor ska läggas på tork på en pappershandduk och sedan slängas i en vanlig papperskorg. Ställ i ordning övrig utrustning. Torka rent bänken, var noga med att plocka bort eventuella mikrokapillärer från TLCn. Säg till lärarna innan du går. Efter att du lämnat laboratoriet... Inför PLC-körningen kan det vara nyttigt att fundera över de olika aspekter som kommer att vara viktiga för separationen av de erhållna alkaloiderna. En nyckel till förståelsen av detta ligger i alkaloidernas tredimensionella struktur. Använd din molekylmodell och bygg de fyra huvudalkaloiderna stereokemiskt korrekt och jämför dem. Det finns också några utmärkta kemometriska resurser att tillgå på internet, där vi kan rekommendera exempelvis: Korrekta SMILES validerade mot ChemDraw (delvis ofullständiga i t.ex. ChemSpider) för de fyra huvudalkaloiderna är: kinin: cinkonidin: kinidin: cinkonin: O[C@@]([C@]1[@]2CC[C@]([C@@](C=C)C2)C1)C3=CC=C4=C3C=C(OC)C=C4 O[C@@]([C@]1[@]2CC[C@]([C@@](C=C)C2)C1)C3=CC=C4=C3C=CC=C4 C=C[C@@]1[C@@]2C[C@]([C@](C3=CC=C4=C3C=C(OC)C=C4)O)[@@](CC2)C1 C=C[C@@]1[C@@]2C[C@@]([@](C1)CC2)[C@@](O)C3=CC=C4=C3C=CC=C4 Vidare, läs hela det tillämpliga avsnittet ur kursboken kring kinaalkaloiderna och deras ursprung! 54

Mobilfas för TLC (diklormetan + trietylamin) i en flaska. Pipetter ska slängas i vita plastdunkar. Trasiga glasvaror i papperskorgar med blå rand.

5 Dag 2 Väg det rör ni valt för indunstning med kristallerna för att kunna göra beräkning av extraktionsutbytet, och lös sedan upp dem i 2 ml av eluenten. Om inte allt går i lösning, centrifugera ned det olösta materialet. Vid beräkning av extraktionsutbytet skall hänsyn tagas till det teoretiska utbytet. Kvalitativ analys av kristallerna görs med hjälp av reversed phase PLC (C18, 150*4.6 mm). Som eluent används vatten:acetonitril (91:9, volym/volym) med 1% trietylamin justerad till p 2,5 med o-fosforsyra. Flödeshastigheten sätts till 1 ml/min. Detektion görs med UV-absorbans vid 280 nm. Att köra PLC Kontrollera att datorn är påslagen och läser av Er PLC, sätt på pumpen (1 ml/min). Skölj injektionssprutan med eluent minst 3 gånger. Skölj därefter loopen via injektionsventilen med eluent (minst 10 ggr loopvolymen). Ventilen skall då stå i läge Load. Fyll loopen med provet (se till så att ni inga luftbubblor kommer in i loopen). Injicera genom att vrida ventilen till Inject. Kontrollera att datorn samlar data från PLCn när detta görs! Kör först referensblandningen (med de fyra huvudalkaloiderna cinkonin, cinkonidin, kinidin, kinin) för att kontrollera PLC systemets funktion. Identifiera topparna med hjälp av det vid systemet anslagna kromatogrammet. Kör sedan provet (den klara supernatanten). Jämför ert referenskromatogram med kromatogrammet från ert prov, och identifiera topparna. Ta med er utskrifter av såväl referenskörningen som ert prov ni behöver dem vid redovisningen! Redovisning Sker muntligt enligt särskilt schema och instruktion. Lycka till! Reviderad av Anders Backlund. 55

Kvalitativ analys av kristallerna görs med hjälp av reversed phase PLC (C18, 150*4.6 mm).

Relevanta dokument

Namn: student x & student y Kurs: FAGBH0 Utförd: 090526

Laboration: Isolering av kinin Namn: student x & student y Kurs: FAGBH0 Utförd: 090526 Handledare: Patrik Holm 1 Innehållsförteckning Innehållsförteckning... 2 Sammanfattning... 3 Inledning... 3 Utförande...