Cymarin. Anna Sjösten

Transkript

1 Cymarin Anna Sjösten Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling, HT-2011 Institutionen för läkemedelskemi, avd för farmakognosi Uppsala universitet 1

2 Cymarin är en substans som man finner i växten Apocynum cannabinum (Kupchan S M et al 1964) och i Apocynum venetum (Kaoru I et al 2008). Cymarin har varit känt i västvärlden länge och den är fortfarande mycket intressant inom forskarvärlden. Apocynum cannabinum klassas som giftig och hos människor kan den orsaka arytmi i hjärtat vilket kan leda till döden. Särskilt giftig är den för hundar, därför kallas den också för dogbane (vilket betyder "bort med hunden") (USDA NRCS). Cymarin är en hjärtglykosid men denna mycket potenta substans kanske även har effekter på andra funktioner i kroppen. De senaste åren har studier bland annat gjorts på cymarins förmåga att inhibera tumörtillväxt (Huafeng Z et al 2008) samt dess förmåga att höja hjärtmuskelkontraktioner (Kaoru I et al 2008). Innehållsförteckning Historisk bakgrund Beskrivning av substans Extraktion och isolering Biologisk aktivitet Läkemedelsutveckling 2

3 Historisk bakgrund Apocynum cannabinum har varit känd långt tidigare än västvärlden har känt till den. I Nordamerika har indianerna länge använt växten mot diverse åkommor och därför kallas den ibland Indian hemp. Indianerna torkade eller krossade plantan och drog in det i näsan för att behandla hosta och förkylning. Av roten gjorde man te som hjälpte mot ont i öronen, huvudvärk, nervositet, yrsel, inälvsmask och sinnessjukdom. Teet användes också mot hjärtklappning. De effektiva substanserna i teet fungerar kärl sammandragande, saktar ner hjärtslagen och höjer blodtrycket (USDA NRCS). Apocynum venetum är en annan växt som man finner längs medelhavet och i nordvästra Kina. Växtens blad är ett mycket populärt te hos kineser och i Japan har man nyligen lanserat extrakt från denna växt som en hälsosam dryck (Song C et al 2011). Studier har visat att denna dryck motverkar hjärtkärl sjukdomar (Yokozawa et al 2004). Man vet att båda dessa växter innehåller den potenta substansen cymarin, frågan är om det är just cymarin som är den substans som ger de positiva hälsoeffekterna eller om det är andra biologiskt aktiva substanser som verkar. Dessa positiva hälsoeffekter har ändå gjort att forskare börjat intressera sig för just cymarin. Beskrivning av substans Cymarin är en hjärtglykosid, alla hjärtglykosider fungerar genom att öka muskelkontraktionerna i hjärtat vilket gör att ett svagt hjärta fungerar mer effektivt Hjärtglykosider består av två strukturella grupper, en socker grupp (glukosiden) och en aglykon, steroid grupp (se figur 1) (Illustrerad farmakologi 2). Figur 1. Molekylstrukturen hos Cymarin (Meryer 2008) 3

4 Alla hjärtglykosider har ovanliga deoxysocker i sin molekyl, dessa har färre syreatomer än kolatomer vilket gör att de har en eller fler kol i molekylen och saknar en hydroxylgrupp. Cymarin har sockermolekylen cymaros (se figur 2). Figur 2. Molekylstrukturen hos Cymaros (Chemgaroo) Extraktion Extraktion av blad från Apocynum venetum går till enligt följande. Torkade blad läggs i två omgångar i 70 % etanol i 1 timme. Extraktet torkas först genom evaporering, löses sedan upp i hett vatten och ph justeras till ph 3.0 genom tillförsel av svavelsyra. Extraktet filtreras innan det kromatograferas och elueras ut med vatten och 70 % etanol. Det eluerade extraktet torkas återigen genom evaporering. För ytterligare separation, kontroll av kvaliteten och för rena produkten görs en högupplösande vätskekromatografi (HPLC). Metoden är ett två-fas system med ett analysfilter som innehåller korn med olika polaritet, beroende på vad som ska separeras. De upplösta ämnena i vätskan passerar kolumnen och absorberas eller adsorberas till kornen, med denna teknik kommer ämnen med olika polaritet att bromsas olika mycket i kolonnen och därmed ta olika tid att passera genom kolonnen. En detektor registrerar vad som kommer ut ur kolonnen med hjälp av ultraviolett ljus. Därefter analyseras mätvärdena och "peak-areas" identifieras. Ofta upprepas försöket flera gånger för att få korrekta värden. Isolering av Cymarin K-strophanthoside är den glykosid som utvinns från Strophanthus arter, denna måste gå igenom flera steg för att man ska kunna utvinna cymarin. K-strophanthoside omvandlas genom hydrolys av enzymet alfa glukosidas till K-strophanthoside B eller 4

5 K-strophanthin B samt en socker molekyl, vidare hydrolyseras K-strophantin B till glukos och cymarin av enzymet strophanthobias. Ytterligare hydrolys av cymarin ger K-strophanthidin och cymaros (se figur 3). Figure 3. Schematisk bild av enzymatisk och syra-hydrolys av K-Strophanthoside (Ain Sham Univ 2011) Glykosiderna är polära ämnen som löser sig bra i etanol och vatten, aglykondelen är däremot neutral och löser sig inte i polära lösningsmedel. Detta kan användas i processen att isolera glykosider. Det som försvårar isoleringen av cymarin är att den första glykosiden omvandlas till en sekundär glykosid genom hydrolys enzymer. Andra svårigheter är att det finns flera likartade glykosider i samma lösning vilket gör det svårt att separera och isolera. Biologisk aktivitet Cymarin är en hjärtglykosid, dessa fungerar genom att öka inströmningen av kalcium i hjärtmuskelceller och ökar därmed hjärtats slagkraft. Detta sker genom hämning av det aktiverade membranbundna Na + /K + ATPaset som då ger en ökning av intracellulärt Ca 2+. Resultatet blir en ökad slagvolym som leder till en effektivare tömning av kammaren, minskat diastoliskt kammartryck och ett minskat venöst återflöde. Den enda hjärtglykosid som används i Sverige idag är Digoxin, den utvinns från Digitalis lanata (fingerborgsblomman). Denna hjärtglykosid har även en negativ kronotop effekt (dess inverkan på hjärtkontraktionernas hastighet) och 5

6 sänker därför hjärtfrekvensen genom stimulans av vagus nerven som i sin tur förlänger ledningstiden i AV-knutan. Indikationer för behandling med hjärtglykosider är hjärtsvikt och förmaksflimmer (FASS). Läkemedelsutveckling I en studie från 2008 undersökte man olika hjärtglykosiders, bland annat cymarin, förmåga att påverka vissa gener i tumörceller (Huafeng et al 2008) I cancerceller uppstår ofta hypoxi vilket försvårar behandlingen och ger en ökad risk till metastaser och död. Cancercellerna anpassar sig dock till detta genom att aktivera HIF-1 (hypoxia-inducible factor) vilket är en transkriptionsfaktor som reglerar uttrycket av hundratals gener, bland annat VEGF (vascular endothelial growth factor) som är med och reglerar angiogenesen, GLUT-1 som kodar för glucosetransporter-1 och HK-1 och HK-2 vilka kodar för ett enzym i glukolytiska pathway. Uttrycket av dessa proteiner ökar syretillförelsen, genom VEGF, eller möjliggör en anpassning av reducerad syre tillgänglighet, HK-1 och 2 samt GLUT-1. HIF-1 kontrollerar också generna som styr cancercellernas förmåga till immortalitet, stamcellernas differentiering, genetisk instabilitet och metastasering av cancerceller. Kombinationen av ökad syntes och minskad nedbrytning av HIF-1 leder till ökade nivåer av proteinet i vissa cancertyper, därför finns det ett stort intresse för att hitta en substans som kan inhibera HIF-1 aktivitet och som kanske kan bromsa tumör tillväxt. I detta försök screenades läkemedel som var godkända av Food and Drug Administration (FDA) eller hade kommit till fas 2 i kliniska försök. Av dessa var det 20 stycken som kunde inhibera det specifika enzymet. 11 stycken av de 20 var hjärtglykosider, cymarin inkluderat. Med denna studie dras slutsatsen att hjärtglykosider är potenta inhibitorer av HIF-1 syntes. I en annan studie (Kaoru et al 2008) använde man extrakt från Apocynum venetum för att se om cymarin kunde öka styrkan på muskelkontraktionerna i hjärtat hos marsvin samt om den effekten kunde orsakas av en inhibition av Phosphodiesterase 3 (PDE3). Marsvinshjärtan dissekerades ut och lades i ett organbad med temperaturen 37 C och med O 2 och CO 2 tillförsel. Man övervakade hjärtats mekaniska aktivitet och hjärtslag. Efter 10 minuter tillsattes hjärtat A.Venetum exstrakt. Den inhibitatoriska effekten av cymarin på PDE3 undersöktes enligt följande. 6

7 Extrakt av Apocynum venetum torkades och späddes med 50 % etanol till en koncentration av 1 mg/ml, därefter filtrerades extraktet och genomgick LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry). Denna metod är en kombination av HPLC och masspektrometri. Inhiberingen av PDE3 testades i en in vitro assay med humana trombocyter. PDE aktiviteten undersöktes genom att mäta mängden [ 3 H]-adenosin efter en 20 minuters inkubationstid med 1,01 µm ([ 3 H]-cAMP+cAMP) som substrat i 50 mm Tris-Hcl i temperaturen 25 C. Experimenten visade att A.Venetum extraktet inducerade en högre kontraktionskraft i det isolerade hjärtat, både styrkan på kontraktionskraften och pulsen ökade, men den effekten var ganska svag. PDE3 experimentet visade att extraktet signifikant inhiberade PDE3 aktivitet. Dessa resultat tolkar de som att den ökade kontraktionskraften i hjärtmuskeln kan bero på PDE3 inhibition. Deras slutsats är att cymarin kan orsaka en ökad kontraktionskraft av hjärtmuskeln hos marsvin. Om cymarin kommer att kunna användas i ett läkemedel får framtiden avgöra men substansen är bevisat mycket potent med hög biologisk aktivitet. Speciellt intressant är den antitumör effekt den uppvisat. Idag har vi mycket avancerade tekniker för att isolera och analysera naturliga substanser så det enda som krävs är att vi hittar dessa substanser bland jordens alla organismer, såväl terrestra som marina. 7

8 Referenser: Heart Rhythm Society, HRS. Washington USA. Kaoru, I., Takashiro, S., Ippei, T., Jun-ichiro, N., Maiko, K., Toshiyuki, H. (2008). Cardiotonic effect of Apocynum venetum L. extracts on isolated guinea pig atrium. J Nat Med 63: Kupchan, SM., Hemingway, RJ., Doskotch, RW. (1964). Tumor inhibitors. IV. Apocannoside and cymarin, the cytotoxic principles of Apocynum Cannabinum L. J Med Chem.7: Läkemedelsindustriföreningen, LIF. FASS (2011) Simonsen, T., Aarbakke, J., Hasselström, J. (2003). Illustrerad farmakologi 2 Song,C., Zhang, C., LI, G., Zhang, X., Chen, G., You, J. (2011). Highly selective and sensitive determination of free and total amino acids in Apocynum venetum L. (Luobuma tea) by a developed HPLC-FLD method coupled with pre-column fluorescent labelling. You J. Int J Food Sci Nutr. USDA NRCS, United States Department of Agriculture Natural Resources Conservation Service. (2011). Indian Hemp Apocynum cannabinum L. Xiang, J,. Tang, Y,. Zhou, Z,. Wu, P,. Wang, Z,. Mori, M,. Cai, D. (2010). Apocynum venetum leaf extract protects rat cortical neurons from injury induced by oxygen and glucose deprivation in vitro. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology Yokozawa, T,. Nakagawa, T. (2004). Inhibitory effects of Luobuma tea and its components against glucose-mediated protein damage. Food and Chemical Toxicology Vol 42 Issue 6 p