Analysera gifter, droger och läkemedel med gaskromatografi (GC) Niklas Dahrén

Transkript

1 Analysera gifter, droger och läkemedel med gaskromatografi (GC) Niklas Dahrén

2 Både GC och HPLC är vanliga analysmetoder GC= gas chromatography eller på svenska gaskromatografi. HPLC= high performance liquid chromatography eller på svenska högupplösande vätskekromatografi. HPLC är en avancerad form av vätskekromatografi. Det finns även andra enklare och mer begränsade former av vätskekromatografi, t.ex. papperskromatografi, tunnskiktskromatografi, jonbyteskromatografi och gelfiltrering. Namnet kromatografi kommer av det grekiska ordet chroma som betyder färg. I början användes kromatografiska metoder endast för färgade ämnen men nu används dessa även till ofärgade ämnen så namnet är därför lite missvisande.

3 Vad används GC och HPLC till? 1. Separera (rena) olika ämnen som finns i ett prov: Vi kanske har ett prov som innehåller ett stort antal olika ämnen, men vi är enbart intresserade av ett av dessa ämnen. Vi kan då använda GC eller HPLC för att separera ämnena från varandra och därmed isolera det ämne vi är ute efter. 2. Undersöka vilka okända ämnen som finns i ett prov: Vi kan identifiera okända ämnen (t.ex. gifter, droger, dopingpreparat, miljögifter eller läkemedel) med dessa metoder. Om vi dessutom kopplar vår GC eller HPLC till en masspektrometer (en speciell detektor) får vi ett mycket kraftfullt verktyg för att identifiera okända ämnen. 3. Bestämma koncentrationen av olika ämnen som finns i ett prov: GC och HPLC kan också användas kvantitativt för att mäta koncentrationen av de ämnen som finns i ett prov. 4. Renhetstester: Vi kan undersöka om ett prov är förorenat med andra ämnen som inte bör finnas där (t.ex. renhetstester av läkemedel eller livsmedel).

4 3 saker är gemensamt för både GC och HPLC Prov: I både GC och HPLC tillsätts ett prov innehållande olika ämnen som ska analyseras. Mobil fas: I både GC och HPLC finns en s.k. mobil fas (rörlig fas). Den mobila fasen i GC består av en gas (helium, kvävgas eller vätgas) medan den i HPLC består av en vätska (en blandning av olika ämnen). Syftet med den mobila fasen är att transportera provet genom gas- eller vätskekromatografen, alltså genom den maskin som ska utföra själva analysen. Stationär fas: I både GC och HPLC finns en kolonn (ett ihåligt rör) som på insidan är beklädd med en stationär fas (stillastående fas) som består av olika molekyler. Den stationära fasen kan vara i fast form eller bestå av en trögflytande vätska. Molekylernas uppgift i den stationära fasen är att binda till de olika ämnena i provet så att dessa ämnen bromsas upp inuti kolonnen. Vissa ämnen kan binda mycket starkare till molekylerna i den stationära fasen och tar därför längre tid på sig genom kolonnen.

5 Principen bakom GC I injektorn tillsätts provet. Injektor Detektorn gör ett kromatogram där varje topp motsvarar ett ämne i provet. Mobil fas Gasbehållare med den mobila fasen (gas). En ugn förgasar ämnena i provet. Temperaturen är över ämnenas kokpunkter. Ugn Temperaturen i kolonnen är vanligtvis lägre än ämnenas kokpunkter vilket innebär att ämnena kondenserar i början på kolonnen. Temperaturen höjs sedan gradvis inuti kolonnen enligt ett förprogrammerat schema. Detektor Detektorn känner av när molekylerna av ett ämne passerar och registrerar ämnets retentionstid och signalstyrkan (hur mycket det finns av ämnet). Kolonn med stationär fas I kolonnen separeras ämnena i provet från varandra eftersom olika ämnen har olika kokpunkter och övergår i gasform olika lätt (vid olika temperaturer). De binder också olika lätt/olika starkt till den stationära fasen i kolonnen (detta gäller främst vid polär kolonn). Ämnena kommer därför ut vid olika tidpunkter. Den stationära fasen är ofta en trögflytande vätska som täcker insidan på kolonnen.

6 Ett exempel på temperaturprogrammering i en GC Injektorns temperatur: I injektorn är temperaturen 180 grader. Denna temperatur är över kokpunkten för de ämnen som ingår i provet (i just det här exemplet). Kolonnens temperatur: I kolonnen är temperaturen initialt 110 grader i 2 minuter, därefter sker en o kning med 14 grader/min upp till 200 grader. Denna sluttemperatur hålls sedan i ytterligare 2 minuter för att vi ska vara säker på att alla ämnen tar sig igenom systemet ut till detektorn. Detektorns temperatur: I detektorn är temperaturen 230 grader för att säkerställa att inga ämnen blir kvar.

7 En gaskromatograf (GC)

8 Exempel på ett kromatogram Retentionstiden: Retentionstiden är specifik för varje ämne i ett givet system och därför kan vi använda retentionstiden för att identifiera olika ämnen (kvalitativ analys). Toppens area: Detektorn mäter intensiteten (signalstyrkan) av varje ämne som passerar, vilket motsvarar hur många molekyler av ämnet som passerar detektorn. Utifrån det ritas en topp ut i kromatogrammet där arean av toppen motsvarar hur hög koncentration vi har ämnet (kvantitativ analys). Intensiteten (signalstyrkan) Retentionstiden Bildkälla: "Hplc-perfume-chromatogram" by Lukke - Own work. Licensed under CC BY-SA 3.0 via Commons -

9 Retentionstiden i en GC bestäms av 2 faktorer: Ämnenas kokpunkter Ämnenas polaritet

10 Kokpunkten hos ett ämne bestäms av 3 faktorer: Molekylernas polaritet Molekylernas storlek Molekylernas geometriska form

11 Molekylernas storlek har betydelse för kokpunkten Om vi jämför kolvätet pentan med kolvätet metan ser vi att det är stor skillnad på deras kokpunkter. Vi ser även att det är stor skillnad på deras molekylmassor. Pentan har en betydligt högre molekylmassa (72,15 u) jämfört med metan (16,04 u). Ingen av ämnena kan bilda vätebindningar eller dipol-dipolbindningar utan skillnaden i kokpunkt beror på styrkan av van der Waalsbindningarna (antalet van der Waalsbindningar). I de flesta fall gäller följande: Molekylmassa van der Waalsbindningar Kokpunkt Namn: Pentan Summaformel: C 5 H 12 Kokpunkt: 36,1 C Molekylmassa: 72,15 u Namn: Metan Summaformel: CH 4 Kokpunkt: -161,6 C Molekylmassa: 16,04 u

12 Ämnen med stora molekyler kan skapa fler van der Waalsbindningar och får därmed högre kokpunkt Pentan Metan Pentan består av stora molekyler med många atomer och många bindningar där det kan uppstå en ojämn elektronfördelning (det kan alltså uppstå många små dipoler/dipolmoment) i samma molekyl). Det finns alltså många atomer med partiella laddningar som kan komma i kontakt med varandra och skapa van der Waalsbindningar mellan molekylerna. Metan består av små molekyler med få atomer och få bindningar där det kan uppstå en ojämn elektronfördelning. Det finns alltså få atomer med partiella laddningar som kan komma i kontakt med varandra och skapa van der Waalsbindningar mellan molekylerna.

13 Molekylernas geometriska form har också betydelse för kokpunkten 2-metylbutan (isopentan) Pentan (normalpentan) Summaformel: C 5 H 12 Kokpunkt: 27,8 C Molekylmassa: 72,15 u Summaformel: C 5 H 12 Kokpunkt: 36,1 C Molekylmassa: 72,15 u

14 Mer avlånga molekyler kan skapa fler van der Waalsbindningar mellan varandra 2-metylbutan (27,8 C) Pentan (36,1 C) Pentanmolekylerna kan skapa en något större kontaktyta mellan varandra, tack vare den mer avlånga strukturen, vilket möjliggör fler van der Waalsbindningar. Pentan har därför en något högre kokpunkt.

15 Kokpunkten för kolväten av olika storlek Kolväten: Molekylformel: Kokpunkt ( o C): metan CH etan C 2 H 6-89 propan C 3 H 8-42 butan C 4 H pentan C 5 H hexan C 6 H heptan C 7 H oktan C 8 H nonan C 9 H dekan C 10 H undekan C 11 H dodekan C 12 H eikosan C 20 H triakontan C 30 H Varje enskild van der Waalsbindning är svag men i ämnen som är uppbyggda av stora och avlånga molekyler (t.ex. stora och avlånga kolväten) förekommer det väldigt många van der Waalsbindningar mellan molekylerna vilket innebär att den totala styrkan blir väldigt stor och därmed också kokpunkten. Ämnen med enbart van der Waalsbindningar kan därför ha en högre kokpunkt än ämnen med vätebindningar. Många små är starkare än få stora!

16 Polära ämnen och polaritet Polära molekyler/ämnen: Polära molekyler är molekyler som har en sida/del av molekylen som är partiellt positivt laddad och en sida/del som är partiellt negativt laddad. Polära molekyler och dipoler är i princip samma sak. Polära molekyler kan skapa vätebindningar eller vanliga dipol-dipolbindningar (och van der Waalsbindningar som alla molekyler kan skapa). Opolära molekyler kan enbart skapa van der Waalsbindningar. Metanol Vatten Dietyleter δ+ δ+ δ+ δ- δ- δ-

17 Polära ämnen och polaritet Polaritet: Molekyler kan vara polära eller opolära. Denna indelning är dock inte svart eller vit utan vissa molekyler är mer polära än andra. Desto mer polära molekylerna är desto högre polaritet säger man att dessa har. Polariteten bestäms bl.a. av hur många och hur starka vätebindningar molekylen kan skapa, hur lång kolvätekedja molekylen har (lång= lägre polaritet) och av hur tydligt dipolmomentet är (avståndet mellan laddningarna och storleken av de partiella laddningarna). Polära molekyler kan lösa sig i vatten: Polära molekyler, som kan skapa vätebindningar, kan lösa sig bra i vatten. Vattenmolekyler har själv vätebindningar mellan sina molekyler och trivs därför med andra ämnen som också kan erbjuda starka vätebindningar. Polära ämnen som enbart kan erbjuda vanliga dipoldipolbindningar med vatten har mycket mindre löslighet. Opolära ämnen löser sig dock inte alls i vatten. Metanol är ett polärt ämne eftersom den p.g.a. OHgruppen har en sida/del som är partiellt positivt laddad och en sida/del som är partiellt negativt laddad. OHgruppen möjliggör också för metanol att skapa vätebindningar till andra metanolmolekyler eller till andra molekyler som också kan skapa vätebindningar, t.ex. till vattenmolekyler. Metanol har hög löslighet i vatten eftersom metanol kan skapa vätebindningar med vatten. Metanolmolekyl δ- δ+ δ- Vätebindning δ+ Vattenmolekyl

18 Molekylernas polaritet har betydelse för kokpunkten Om vi jämför de 3 ämnena här nedanför så ser vi att det är stor skillnad på kokpunkten trots att molekylstorleken/ molekylvikten är likvärdig (de har alltså ungefär lika många van der Waalsbindningar). Förklaringen till skillnaden i kokpunkt är istället polariteten och förmågan att skapa vätebindningar. Ämnen med OH-grupper har ofta en hög polaritet: Molekyler med OH-grupper har ofta hög polaritet och kan skapa vätebindningar mellan varandra eftersom ett partiellt positivt väte på den ena molekylen kan binda till ett partiellt negativt syre och ett av dess fria elektronpar på den andra molekylen (Hydro-FON-regeln är uppfylld). Desto fler OHgrupper, desto fler vätebindningar kan molekylen skapa. Hög polaritet Medelhög polaritet Ingen polaritet (opolär) 1,2-butandiol: Molekylvikt: 90,1 u Kokpunkt: 194 C Pentanol: Molekylvikt: 88,1 u Kokpunkt: 138 C Heptan: Molekylvikt: 100,2 u Kokpunkt: 98,4 C

19 GC-analyser kan utföras på 2 olika sätt 1. Opolär kolonn (kokpunkten avgör): Detta är den vanligaste metoden, används alltid när det är enbart opolära ämnen i provet. De ämnen som har lägst kokpunkt övergår lättast i gasform och åker därför fortast genom kolonnen. Dessa ämnen får därför kortast retentionstid. Opolär kolonn (kokpunkten avgör) Mobil fas (t.ex. kvävgas) Opolär stationär fas (kolväten, t.ex. C18) Molekyler med låg kokpunkt åker ut först 2. Polär kolonn (kokpunkten + polariteten avgör): Används ofta när man vet eller misstänker att det finns polära ämnen i provet. Opolära ämnen som även har låg kokpunkt kommer få kortast retentionstid eftersom dessa övergår i fasform lättast och även binder svagast till den polära stationära fasen i kolonnen. Polär kolonn (kokpunkten och polaritet avgör) Mobil fas (t.ex. kvävgas) Polär stationär fas (OH-grupper) Molekyler som är opolära och har låg kokpunkt åker ut först

20 Separationen beror på kokpunkt vid opolär kolonn Molekyler med hög kokpunkt (stora, avlånga och/eller polära) kommer få längst retentionstid om det är en opolär kolonn. Dessa molekyler kommer kondensera i början av kolonnen och kommer sedan kräva en hög temperatur för att övergå i gasform och börja vandra igenom kolonnen. Dessa molekyler har alltså svårare att befinna sig i gasform p.g.a. de starka intermolekylära bindningarna. Molekyler med låg kokpunkt (små, runda och opolära) har däremot mycket lättare att övergå i gasform. De kommer därför inte stanna som vätska i början av kolonnen särskilt länge. Dessa molekyler har alltså lättare att övergå i gasform p.g.a. de svaga intermolekylära bindningarna. Molekyler med låg kokpunkt får därför kortast retentionstid. Ämnena binder inte i särskilt hög grad till den opolära stationära fasen i kolonnen: När temperaturen har blivit tillräckligt hög i kolonnen så att ett ämne har övergått i gasform så kommer ämnets molekyler att åka igenom den opolära kolonnen utan att integrera särskilt mycket med kolonnen. Mobil fas (t.ex. kvävgas) Mycket hög kokpunkt Mycket stor, avlång och polär molekyl Hög kokpunkt Stor, avlång och opolär molekyl Hög kokpunkt Liten polär molekyl Låg kokpunkt Liten opolär molekyl Mot detektorn Opolär stationär fas (kolväten, t.ex. C18)

21 Separationen beror på kokpunkt och polaritet vid polär kolonn Kokpunkten har betydelse även när vi använder oss av en polär kolonn. Polariteten påverkar som sagt kokpunkten, men nu har även polariteten stor betydelse som enskild faktor. Skillnaden med en polär kolonn är att polära ämnen kommer fastna mycket mer på sin väg genom kolonnen (oavsett kokpunkt) eftersom polära ämnen kan skapa starka vätebindningar med de ämnen som finns i kolonnen. Även om temperaturen har gjort att ämnets molekyler har övergått i gasform så kommer polära molekyler kunna haka fast i kolonnen på sin väg igenom (skapa vätebindningar med molekyler i den stationära fasen). Små polära ämnen får därför ofta en längre retentionstid än stora, opolära ämnen om kokpunkterna inte skiljer alltför mycket. Mobil fas (t.ex. kvävgas) Mycket hög kokpunkt Polär molekyl Hög kokpunkt Polär molekyl Hög kokpunkt Opolär molekyl Låg kokpunkt Opolär molekyl Mot detektorn Polär stationär fas (OH-grupper)

22 Exempel på hur en GC-analys fungerar Opolär stationär fas Provet kondenserar i början på kolonnen, temp. höjs sedan gradvis vilket får de olika ämnena i provet att förångas i olika ordning. C CCC C16 C16 C8C8 C8 Mobil fas Opolär stationär fas Ämne Retentionstid (min) 4,5 7,0 9,5 Detektorn

23 De 3 ämnena får olika retentionstid beroende på deras kokpunkt (opolär kolonn) Ämne: Retentionstid (min): Kokpunkt: C 5 C8 C16 4,5 Låg 7,0 Medelhög 9,5 Hög Retentionstiden: Den tid det tar för ämnet att passera igenom kolonnen och fram till detektorn. Retentionstiden är specifik för varje ämne i ett givet system och vi kan därför använda retentionstiden för att identifiera de ämnen vi har i vårt prov.

24 Ett kromatogram visar retentionstiden för de 3 ämnena Intensiteten (signalstyrkan) Ämne 1 Ämne 2 Ämne ,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9, ,5 11 Retentionstiden Retentionstiden är specifik för varje ämne och visar därför vilket ämnet är (kvalitativ analys). Toppens area avslöjar däremot hur stor koncentration vi har av ämnet (kvantitativ analys).

25 Vi kan förbättra separationen i kolonnen genom att ändra olika faktorer Ibland blir upplösningen inte tillräckligt bra. I kromatogrammet kan det det vara så att topparna från 2 olika ämnen sammanfaller vilket innebär att det är svårt att veta vilken topp som är från vilket ämne och det är svårt att göra en koncentrationsbestämning av ämnena. Åtgärder för att förbättra separationen och få en bättre upplösning i kromatogrammet: 1. Använda en kolonn med en annan storlek: I en längre och/eller smalare kolonn kommer de olika ämnena i provet binda fler gånger till den stationära fasen och därmed separeras från varandra i högre utsträckning. 2. Sänka hastigheten av den mobila fasen: Om vi sänker den mobila fasens hastighet så kommer ämnena i provet ha längre tid på sig inuti kolonnen och de kommer hinna binda i större utsträckning till den stationära fasen. Det leder till en bättre separation. 3. Ändra kolonnens polaritet: Om vi får en dålig separation på en opolär kolonn så kan vi testa med att byta ut den mot en polär kolonn (eller tvärtom). 4. Ändra den mobila fasens polaritet (HPLC): I HPLC kan vi öka eller minska polariteten av den mobila fasen genom att påverka sammansättningen av de ämnen som ingår. 5. Ändra temperaturen (GC): I GC kan vi sänka temperaturen vilket innebär att ämnena kommer ha lättare att binda till den stationära fasen (övergår inte i gasform lika lätt). Det leder till totalt sätt fler interaktioner mellan ämnena och den stationära fasen och därmed en bättre separation.

26 Uppgift 1: Ett prov som innehåller cyklohexan (80,7 C), pentan (36,1 C) och etanol (78,4 C) analyseras i en GC som har en opolär kolonn. Vilket ämne får längst retentionstid? Cyklohexan Pentan Etanol Lösning: I en GC med en opolär kolonn är det enbart kokpunkten som avgör retentionstiden. Cyklohexan är det ämne som har högst kokpunkt vilket innebär att cyklohexanmolekylerna har svårast att övergå i gasform. Cyklohexanmolekylerna kommer därför ta längst tid på sig genom kolonnen och fram till detektorn (det är dock inte så stor skillnad mellan cyklohexan och etanol) och får därmed längst retentionstid.

27 Uppgift 2: Ett prov som innehåller cyklohexan (80,7 C), pentan (36,1 C) och etanol (78,4 C) analyseras i en GC som har en polär kolonn. Vilket ämne får längst retentionstid? Cyklohexan Pentan Etanol Lösning: I en GC med en polär kolonn är det kombinationen av kokpunkt och polaritet som avgör retentionstiden. Pentan utesluter vi p.g.a. den låga kokpunkten. Cyklohexan och etanol har likartad kokpunkt vilket innebär att det är deras polaritet som kommer vara avgörande i det här fallet. Etanol är ett polärt ämne tack vare OH-gruppen som medför att etanol kan skapa vätebindningar med den polära stationära fasen i kolonnen. Cyklohexan däremot är ett opolärt ämne som ej kan skapa vätebindningar med den stationära fasen i kolonnen. Etanol har därför längst retentionstid.

28 Uppgift 3: Ett prov med okända ämnen analyseras med hjälp av GC (polär kolonn). Tre retentionstider erhålls; 2,5, 7,7 och 12,3. Kemisterna identifierar nedanstående tre ämnen i provet. Men vilken retentionstid tillhör vilket ämne? Butan Glycerol Butanol Lösning: I en GC med en polär kolonn är det kombinationen av kokpunkt och polaritet som avgör retentionstiden. Alla 3 ämnen har likartad storlek/molekylmassa och geometrisk form. Deras polaritet skiljer sig dock åt. Polariteten påverkar både deras kokpunkt och deras förmåga att binda till den polära kolonnen. Vi analyserar varje ämne: Butan: Opolärt ämne p.g.a. enbart koloch väteatomer, låg kokpunkt, kan ej bilda vätebindningar eller dipoldipolbindningar med den polära kolonnen. Har retentionstiden; 2,5. Glycerol: Glycerol är ett polärt ämne p.g.a. 3 OH-grupper och kan därför skapa många vätebindningar. Glycerol får därför hög kokpunkt och kan även binda starkt till den polära kolonnen. Har retentionstiden; 12,3. Butanol: Polärt ämne p.g.a. 1 OH-grupp. Relativt hög kokpunkt och kan bilda vätebindningar med den polära kolonnen. Dock färre vätebindningar jämfört med glycerol. Har retentionstiden; 7,7.

29 Uppgift 4: Ett prov med okända ämnen analyseras med hjälp av GC (opolär kolonn). Tre retentionstider erhålls; 2,5, 7,7 och 12,3. Kemisterna identifierar nedanstående tre ämnen i provet. Men vilken retentionstid tillhör vilket ämne? Pentan 2-metylbutan Butanol Lösning: I en GC med en opolär kolonn är det kokpunkten som fäller avgörandet, men polariteten är dock en faktor som har stor inverkan på kokpunkten. Kokpunkten bestäms även av molekylstorleken och den geometriska formen. Alla ämnen har likvärdig molekylstorlek så det är deras polaritet och geometriska form som framförallt förklarar skillnaden i kokpunkt. Vi analyserar varje ämne: Pentan: Opolär molekyl eftersom den enbart innehåller kol och väte, men avlång struktur vilket möjliggör fler van der Waalsbindningar i jämförelse med 2- metylbutan. Har retentionstiden; 7,7. 2-metylbutan: Opolärt ämne med en mer sfärsisk/rund form i jämförelse med pentan. Detta innebär att antalet van der Waalsbindningar blir färre. Har retentionstiden; 2,5. Butanol: Polär molekyl (OH-grupp) vilket möjliggör starka vätebindningar och därmed en jämförelsevis hög kokpunkt. Avlång struktur vilket ger lika många van der Waalsbindningar som hos pentan. Har retentionstiden; 12,3.

30 För den bästa kvalitativa analysen krävs dock en masspektrometer som detektor Många prover är komplexa och innehåller ett stort antal ämnen med likartade retentionstider. Dessa är därför svåra att identifiera med enbart GC eller HPLC kopplad till en vanlig detektor. Om vi däremot kopplar vår GC eller HPLC till en detektor som heter masspektrometer (MS) så kommer vi få ett mycket kraftfullt verktyg. Dessa analysmetoder kallas för GC-MS resp. HPLC-MS. Med hjälp av en masspektrometer kan massan av de olika ämnena i provet bestämmas. Masspektrometern kan även lista ut vilka delar som finns i de olika ämnenas molekyler eftersom molekylerna slås sönder i mindre beståndsdelar och sedan vägs varje beståndsdel. Varje beståndsdel i molekylen kan då identifieras och vi kan göra en strukturbestämning av hela molekylen. Masspektrometern skapar på detta sätt ett kemiskt fingeravtryck för varje ämne. Därmed kan vi identifiera helt nya ämnen (t.ex. helt nya droger).

31 Vad är de viktigaste skillnaderna mellan GC och HPLC? Olika mobila faser: I gaskromatografi används en gas som mobil fas (helium, kvävgas eller vätgas) medan en vätska (en blandning av olika ämnen) används vid HPLC. HPLC kan användas för fler ämnen: GC kan enbart separera och analysera ämnen som är flyktiga (kan övergå i gasform relativt lätt) och som är värmetåliga. Gaser och lättflyktiga vätskor kan analyseras med GC medan de flesta vanliga vätskor ej kan analyseras. Det är enbart ämnen som har en lägre kokpunkt än 350 grader som kan analyseras med GC, vilket motsvarar ca % av alla kända ämnen. HPLC kan däremot användas även för icke flyktiga ämnen och för ämnen som är värmekänsliga och har därför ett större användningsområde (t.ex. används HPLC för kolhydrater, fetter och proteiner och har därför stor betydelse inom biokemi, medicin etc.). Fördelen med GC framför HPLC är framförallt att det är en snabbare och lite enklare metod att genomföra.

32 Se gärna fler filmer av Niklas Dahrén: