Bruksanvisning EULISA CENP-B IgG Avsedd användning Enzymimmunoanalys för detektering av autoantikroppar IgG mot CENP-B Mikrotitrering, 96 brunnar Förvara kitet vid +2-8 C Endast för in vitro-diagnostik. Dokument nr. E-23-0220-01 Januari 2013 EULISA CENP-B IgG SVENSKA 213696 96
Innehåll 1. Introduktion och bakgrund 2. Varningar och försiktighetsåtgärder 3. Testprincip 4. Kitets innehåll 5. Material som krävs men som inte ingår 6. Förvaring av kitet 7. Reagens- och provberedning / provkrav 8. Analysmetod 8.1. Manuell användning 8.2. Dynex DS2 automatiskt ELISA-system 9. Utvärdering och kvalitetskontroll 10. Tolkning av resultat / metodens begränsningar 11. Prestanda 11.1. Standardisering 11.2. Analytisk specificitet 11.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) 11.4. Homogenitet i fast fas 11.5. Linjäritet 11.6. Precision 11.7. Frekvensdistribution av CENP-B-Ab (IgG) 11.8. Manuell drift jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system 12. Garanti 13. Symboler 14. Referenser 15. Sammanfattande flödesschema Den produkt som beskrivs i detta dokument har tillverkats i enlighet med IVDdirektivet 98/79/EG. 1
1. Introduktion och bakgrund Progressiv systemisk skleros (PSS, sklerodermi) är en kronisk inflammatorisk autoimmun-medierad sjukdom som drabbar bindvävnader. Dess huvudsakliga symtom är en förtjockning och förhårdnad av huden, men inre organ och blodkärl kan också drabbas. PSS-patienter har typiska autoantikroppar mot flera olika nukleära proteiner, men nästan alltid endast en specificitet åt gången. Dessa antikroppar är värdefulla indikatorer av olika PSS-subset och överlappningssyndrom med andra systemiska inflammatoriska sjukdomar (1). Anti-Scl-70(sklerodermiassocierad 70 kda-antigen)-riktade autoantikoppar anses utgöra en tillförlitlig markör för PSS med en specificitet > 90 % (2). De indikerar dess allvarliga förlopp (diffus sklerodermi), vanligen involverande lungor, njurar eller hjärta. Däremot bär patienter med CREST-syndrom, den mildare, kutana formen av PSS med ett mer utdraget förlopp, sällan på Scl-70-autoantikroppar (3). För detta syndrom har autoantikroppar som inriktats på antigener för kromosomcentrentromeren (ACA) identifierats som en värdefull diagnostisk markör (4). De känner igen en grupp proteiner som förblir i de eukaryotiska cellernas centromer-region under hela cellcykeln. Bland de viktigaste antigeniska proteinerna (kallas CENP-A, CENP-B och CENP-C) är CENP-B särskilt användbart eftersom nästan allt serum med ACA känner igen ett visst karboxiterminalt fragment av detta protein (4). Den aktuella enzymkopplade immunadsorberande analysen (ELISA) är avsedd för kvantitativ eller kvalitativ bestämning av IgG-antikroppar i humant serum, riktade mot CENP-B. Antigenet som använts är en högrenad preparation av rekombinant humant CENP-B som uttrycks i baculovirus-infekterade insektsceller. Testet är snabbt (inkubationstid 30-30 - 30 minuter) och flexibelt (delbar fast fas, reagenser som är klara att användas). Sex kalibratorer möjliggör kvantitativa mätningar; en negativ och en positiv kontroll kontrollerar analysprestandan, 2. Varningar och försiktighetsåtgärder Testkitet är endast avsett för in vitro diagnostiskt bruk och får inte användas i eller på människor eller djur. Använd inte reagenser efter angivet utgångsdatum. 2
Vi rekommenderar starkt att protokollet följs. Provbuffert, kalibratorer och kontroller innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Tvättbufferten innehåller bromnitrodioxan och konjugatet innehåller metylisotiazolinon/bromnitrodioxan som konserveringsmedel. Substratet innehåller 3, 3', 5, 5'-tetrametylbenzidin (TMB) och väteperoxid (H2O2). Stopplösningen, 0,5 M svavelsyra (H2SO4), är sur och frätande. Ovan angivna reagenser kan vara giftiga vid förtäring. Iakttag rutinmässiga försiktighetsåtgärder vid hantering av farliga kemikalier. Undvik all kontakt med kroppen, använd handskar och skyddsglasögon. Skölj grundligt med vatten, om någon av reagenserna kommer i kontakt med hud eller slemhinnor. Pipettera aldrig med munnen. Kassera i enlighet med lokala/nationella föreskrifter. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparrör och bilda explosiva metallazider. Spola med stora mängder vatten vid kassering för att undvika ansamling av azider. Kalibratorer och kontroller innehåller komponenter med humant ursprung. De har visat negativa resultat vid tester för humant immunbristvirus (HIV)-ag, hepatit B yt-(hbs)-ag, HIV 1/2-ak samt hepatit C-virus (HCV)-ak, i tester som uppfyller FDA:s krav eller kraven i EU:s direktiv 98/79/EG. Det finns emellertid inga kända tester som kan garantera att produkter som härleds ur humant blod är fria från smittämnen. De måste därför hanteras som om de är smittbärande och kasseras på lämpligt sätt. Läs CDC:s (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andra lokala/nationella riktlinjer beträffande laboratoriesäkerhet och dekontamineringsrutiner. 3. Testprincip Brunnarna i den fasta fasen bestryks med CENP-B. På denna yta kommer följande immunologiska reaktioner att äga rum: 1:a reaktionen: CENP-B-specifika antikroppar i provet binder till det immobiliserade antigenet och bildar ett antigen-antikroppskomplex. Därefter tvättas obundna provkomponenter bort från den fasta fasen. 2:a reaktionen: En andra antikropp, riktad mot humana IgG-anti kroppar och konjugerad med HRP (pepparrotsperoxidas) tillsätts. Detta konjugat binds till komplexet. Därefter tvättas överflödigt konjugat bort från den fasta fasen. 3:e reaktionen: Det enzymmärkta komplexet omvandlar det färglösa substratet till en blå produkt. Graden av färgutveckling reflekterar koncentrationen av CENP-B-antikroppar (IgG) i provet. 3
4. Kitets innehåll a. 1 mikrobrunnsplatta som belagts med CENP-B och förpackats hermetiskt i en folielaminatpåse tillsammans med en påse med torkmedel. Plattan består av 12 remsor som var och en kan delas upp i 8 enskilda brunnar. b. Provbuffert, 100 ml, klar att användas, orange. Innehåller trisbuffrad koksaltlösning (TBS), bovint serumalbumin (BSA), tween och natriumazid. c. Tvättbuffert, 100 ml, 10x-koncentrat, blå. Innehåller TBS, tween och bromnitrodioxan. d. 6 kalibratorer, 2,0 ml vardera, 0-0,60-2,0-6,0-20 och 60 U CENP-Bantikroppar (IgG)/ml, klara att använda, gradvis blåfärgade. Innehåller TBS, BSA, tween och natriumazid. e. Negativ och positiv kontroll, 2,0 ml vardera, klara att använda, grön respektive röd. Innehåller TBS, BSA, tween och natriumazid. f. Anti-humant IgG HRP-konjugat, 14 ml, klart att använda, rött. Buffrad lösning som innehåller stabiliseringsprotein, metylisotiazolinon samt bromnitrodioxan. g. Substratlösning, 14 ml, klar att använda, färglös. Innehåller en buffrad lösning av TMB och H2O2 i en flaska som är ogenomtränglig för ljus. 4
h. Stopplösning (0,5 M H2SO4), 14 ml, färglös, klar att användas. Varning: Svavelsyra är frätande. i. Bruksanvisning j. Lot-specifikt analyscertifikat 5. Material som krävs men som inte ingår a. Avjoniserat eller destillerat vatten b. Graderad cylinder, 1 000 ml c. Rör för provspädning (överföringsrör i mikrobrunnsplattans format rekommenderas) d. Pipetter för 10, 100 och 1 000 µl (pipetter med 1 och 8 kanaler rekommenderas) e. Tvätt för mikrobrunnsplatta (tillval) f. Fotometer för mikrobrunnsplatta, försedd med ett 450 nm filter g. ELISA utvärderingsprogram (rekommenderas) 6. Förvaring av kitet Förvara kitet vid 2-8 C. Det är stabilt fram till det utgångsdatum som anges på kartongens etikett. Använd inte kitet efter utgångsdatumet. 7. Reagens- och provberedning / provkrav Komponenter från olika kit får inte bytas ut mot varandra eller slås samman, på grund av eventuella varierande frakt- eller lagringsförhållanden. 5
a. Innan påsen med mikrotiterplattan öppnas måste den ha uppnått rumstemperatur. Ta ut de mikrobrunnar som inte behövs ur ramen och lägg omedelbart tillbaka dem i påsen, tillsammans med påsen med torkmedel. Återförsegla påsen hermetiskt och förvara den i kylen för framtida användning. b. Späd ut tvättbufferten (10x-koncentrat [100 ml, blå]) med 900 ml avjoniserat vatten. Blanda noga. Den utspädda bufferten är stabil i flera veckor vid förvaring i kylskåp (2-8 C). c. Beredning av proverna: Hantera patientproverna som om de kan överföra smittämnen. Förbered sera med vedertagna laboratoriemetoder och späd 1/100, t.ex. 10 µl serum + 990 µl provbuffert. Blanda noga. För snabb dispensering under analysen rekommenderas att kalibratorer, kontroller och prover förbereds i överföringsrör för mikrobrunn. Detta möjliggör användning av en pipett med 8 kanaler under analysen. Om proverna inte analyseras omedelbart ska de förvaras vid 2-8 C och analyseras inom 3 dagar. Vid längre förvaring rekommenderas en temperatur på -20 C eller lägre. Upprepad frysning och upptining av sera bör undvikas. Upptinade prover måste blandas före spädning. Provkrav: Sera med hög fetthalt eller sera som är hemolyserat eller mikrobiellt kontaminerat kan ge felaktiga resultat och bör undvikas. 8. Analysmetod 8.1. Manuell användning Innan analysen påbörjas måste alla komponenter i kitet ha uppnått rumstemperatur (23 ± 3 C). För bästa resultat, d.v.s. maximalt förhållande mellan specifik signal och bakgrundssignal, är noggrann tvätt avgörande (steg a, c och e). Det är av yttersta vikt att tvättlösningen avlägsnas helt och hållet. För detta ändamål torka ordentligt plattan mot flera lager av absorberande papper. Automatiska tvättar måste verifieras mot resultat som uppnås med manuell tvätt. a. Precis före användning ska den fasta fasen tvättas en gång: fyll brunnarna med 350 µl tvättbuffert i varje, vänta i cirka 10 sekunder och avlägsna. 6
b. Dispensera kalibratorerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gradvis blå), kontrollerna (2,0 ml i varje, klara att användas, grön och röd) samt de utspädda proverna snabbt i mikrobrunnarna; 100 µl per brunn. Mätningar i duplikat rekommenderas. Inkubera plattan i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). c. Tvätta brunnarna 4 gånger som i steg a. d. Dispensera konjugatet (14 ml, klart att användas, rött) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. e. Upprepa tvättmomentet i steg c. f. Dispensera substratlösningen (14 ml, klar att användas, färglös, svart flaska) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. Eftersom substratet är ljuskänsligt bör exponering för intensivt ljus undvikas (t.ex. direkt solljus) under inkubationen. g. Dispensera stopplösningen (14 ml, klar att användas, färglös. Varning: frätande!) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Använd samma sekvens som för substratet. Färgen ändras från blå till gul. Skaka plattan, företrädesvis på en orbital skakapparat i cirka 10 sekunder. h. Läs omedelbart av absorbansen i mikrobrunnsplattans fotometer vid 450 nm. Förvara kvarstående reagenser i kyl (2-8 C) om de ska användas igen. 8.2 Dynex DS2 automatiskt ELISA-system Denna produkt har validerats för användning med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system. En lämplig programfil för genomförande och utvärdering av analys tillhandahålls på begäran. Parametrarna i detta program är endast ett förslag och kan behöva anpassas av användaren till kraven i den faktiska analysen. Vi har generellt försökt att hålla oss så mycket som möjligt till protokollet vid en manuell användning, enligt ovan. Emellertid, på grund av en högre temperatur inuti DS2 bör inkubationstiden för substratet förkortas. Paragraf 11.8. innehåller en prestationsjämförelse mellan manuell analys och DS2 ELISA-systemet. 7
9. Utvärdering och kvalitetskontroll Kvantitativ utvärdering: De data som erhålls utvärderas kvantitativt mot standardkurvan enligt nedan. Den kurva som visas är endast en modell. Den kan inte ersätta mätning av kalibratorer, tillsammans med kontroller och faktiska prov. Kurvan har konstruerats med ett konventionellt ELISA utvärderingsprogram, som använder 4 parameters funktion. Splineapproximering är också lämpligt. 3000 2500 Dynex DS2 --x----x-- manual op. --o----o-- 2000 mod 450nm 1500 1000 500 0 0,1 1 10 100 U CENP-B Ab/ ml 0911FE00.FED/StdKurveV1410J Om ingen datorstödd utvärdering är möjlig kan standardkurvan ritas för hand. Den möjliggör omvandling av absorbansvärdet i ett prov till dess koncentration, d.v.s. i U CENP-B -antikroppar (IgG) per ml serum. Kvalitativ utvärdering: Testet kan även utvärderas kvalitativt. Detta kräver mätning av den endast positiva kontrollen. Mätning och undersökning av den negativa kontrollen rekommenderas dock (se nedan: kvalitetskontroll). Vid kvalitativ testutvärdering jämförs absorbansen hos proverna med gränsabsorbansen (= cut-off). Den fastställs enligt följande formel: absorbansgränsvärde = absorbanspositiv kontroll x faktor 8
Faktorn beror på kit-loten och anges i det lotspecifika analyscertifikatet som medföljer varje testkit. Exempel: absorbanspositiv kontroll = 1 250 mod faktor = 0,35 absorbansgränsvärde = 1 250 mod x 0,35 = 438 mod För att få en uppskattning av hur positivt ett visst prov är för CENP-B Ab (IgG), kan man beräkna kvoten, enligt följande formel: kvot = absorbansprov / absorbansgräns Exempel: Absorbansgräns = 438 mod absorbansprov = 1 480 mod kvot = 1 480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontroll: Den positiva och negativa kontrollen kontrollerar analysens prestanda. Deras auktoriserade värden respektive godkända intervall anges i det lotspecifika analyscertifikatet. Kontrollernas värden måste falla inom de angivna intervallen, annars är analysresultaten ogiltiga. 10. Tolkning av resultat / metodens begränsningar Med utgångspunkt från mätning av en blodgivare och ett urval positiva sera (se nedan), föreslår vi för analys av patientsera: kvantitativ utvärdering kvalitativ utvärdering U CENP-B Ab (IgG) kvot per ml serum normalt (negativt) intervall < 3,2 < 0,84 cut-off 4,0 1,00 obestämbart intervall 3,2 5,0 0,84-1,20 positivt intervall > 5,0 > 1,20 Dessa specifikationer anges endast som en indikation. För att kontrollera exaktheten bör varje analys inkludera parallella prover av normala sera. Ett negativt testresultat indikerar att patienten inte har förhöjda nivåer av IgGantikroppar mot CENP-B. Därför är CREST syndrom inte troligt men ändå inte kan uteslutas. Om PSS mistänks bör Scl-70 autoantikroppar bestämmas. 9
På grund av den höga diagnostiska specificiteten hos CENP-B antikropparna, bör ett positivt resultat tolkas som indikation på CREST syndrom. Dock kan ACA förekomma även under andra vilkor utöver CREST syndrom, inklusive reumatoid artrit, systemisk lupus erythematosus, primärt Sjögrens syndrom och primär biliär cirros (4). Prover som visar resultat mellan ovan angivna gränser bör anses vara obestämbara och rapporteras som sådana. Vi rekommenderar att ytterligare ett prov tages två veckor senare och körs parallellt med det första provet för att dokumentera eventuell förändring i antikroppstitern. I likhet med alla serologiska analyser bör resultaten tolkas mot beaktande av patientens symtom och andra diagnostiska kriterier. 11. Prestanda 11.1. Standardisering Testet är standardiserat med en renad serumberedning som innehåller IgGantikroppar som är specifikt inriktade mot CENP-B. Denna beredning har kalibrerats mot en uppsättning gradvis positiva sera enbart reserverade för detta ändamål. Graden av reaktivitet i provet mäts i arbiträra enheter (U/mL) eftersom ingen internationell standard finns tillgänglig. 11.2. Analytisk specificitet Testet medger specifik bestämning av humana IgG-antikroppar, riktade mot CENP-B. Det har validerats (bland andra parametrar) med hjälp av kommersiellt tillgängliga humana referensserum från "Center of Disease Control" (CDC, Atlanta, USA). Följande resultat är typiska: serum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CDC- ds- SS-B -- U1- Sm -- SS-A -- Scl- Joresultat DNA /La RNP /Ro 70 1 immun- homo- speck- speck- -- -- nuc- -- centro- -- -- fluorescens gen / led led leolar mere rim ELISA (U/mL) 0,7 0,3 0,5 0,3 1,6 0,3 0,5 38 0,6 0,3 11.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) 10
Detektionsgränsen definieras som den koncentration av analytet som motsvarar genomsnittlig absorbans av provbuffert plus 3-faldig standardavvikelse (s). Det fastställdes som < 0,2 U CENP-B Ab (IgG) per ml serum (n = 24). Rekommenderat mätintervall: 0,5-60 U CENP-B Ab (IgG) per ml serum 11.4. Homogenitet i fast fas Mätning av homogenitet i fast fas är en normal del av kvalitetskontrollen av varje produktionslot. Det bestäms genom 288-falding mätning av ett IgG-positivt prov som inte är saturerande på 3 valda plattor. Kriterium för godkännande: mod-variationskoefficient (cv) över plattorna < 8 %. Bilden nedan visar ett typiskt utdrag (fast fas lotnr. 1903G) av en sådan analys. plate early (n/10) late (9n/10) mean cv% row 1 2 6 7 11 12 1 2 6 7 11 12 line a 1219 1215 1210 1208 1216 1221 1225 1246 1249 1241 1243 1282 1231 1,8 line b 1227 1220 1234 1225 1237 1244 1238 1246 1252 1257 1253 1286 1243 1,4 line c 1175 1202 1218 1207 1222 1219 1184 1233 1247 1238 1232 1278 1221 2,3 line d 1207 1223 1241 1179 1205 1230 1214 1254 1257 1221 1216 1277 1227 2,2 line e 1223 1202 1195 1225 1231 1256 1227 1221 1241 1258 1254 1281 1235 2,0 line f 1216 1192 1207 1219 1233 1247 1250 1229 1232 1249 1250 1241 1230 1,5 line g 1216 1229 1226 1190 1232 1270 1252 1239 1251 1235 1229 1287 1238 2,0 line h 1203 1191 1210 1240 1238 1252 1259 1262 1280 1272 1247 1314 1247 2,8 mean 1211 1209 1218 1212 1227 1242 1231 1241 1251 1246 1241 1281 1234 cv% 1,4 1,2 1,3 1,6 0,9 1,4 2,0 1,1 1,1 1,3 1,1 1,6 2,1 0911FE00.FED/FphHomV1410J line a line b line c line d line e line f line g line h 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 mod 450nm 11
U CENP-B Ab / ml mod 450nm 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1 2 6 7 11 12 1 2 6 7 11 12 early / late plate, row no. 11.5. Linjäritet För att bedöma testets dos-responsförhållande, mättes positiva sera i seriell 2- faldig spädning. Kriterium för godkännande: linjär regression av fyra spädningar efter varandra måste ge en korrelationsfaktor > 0,98. Ett typiskt resultat visas nedan. 40 30 20 serum 1 serum 2 serum 3 lin.regr.1 lin.regr.2 lin.regr.3 10 0 0 20 40 60 80 100 nl serum / well 0911FE00.FED/LinearV1410J 12
11.6. Precision För att bedöma testets precision fastställdes resultatens variabilitet under följande förhållanden: a. inom 1 analys och mellan 3 analyser, b. mellan 3 operatörer och c. mellan 2 kit-loter. a. Variabilitet inom analys och mellan analyser (n = 24 respektive 72) prov medelvärde variabilitet (cv %) U/mL inom analys mellan analyser 1 5,7 1,7 2,1 2 10 3,6 4,7 3 28 3,2 4,3 b. Variabilitet mellan operatörer (n = 12) prov medelvärde variabilitet U/mL (cv %) 1 6,0 2,4 2 11 3,1 3 29 1,7 c. Variabilitet mellan 2 kit-loter (n = 6) prov medelvärde variabilitet U/mL (cv %) 1 6,2 5,0 2 11 8,6 3 30 6,8 11.7. Frekvensdistribution av CENP-B Ab (IgG) Detta analyserades i sera från blodgivare, jämnt fördelat mellan kön och ålder och från sera som befunnits positiva för CENP-B Ab (IgG) i CE-godkänt referens-elisa eller definierats kliniskt. Följande fördelning av analyt observerades: 13
<0,5 0,604-0,73 0,882-1,07 1,29-1,56 1,88-2,27 2,75-3,32 4,01-4,84 5,85-7,07 8,54-10,3 12,5-15,1 18,2-22 26,6-32,1 38,8-46,9 56,7-68,5 82,8-100 relative frequency (%) <0,5 0,604-0,73 0,882-1,07 1,29-1,56 1,88-2,27 2,75-3,32 4,01-4,84 5,85-7,07 8,54-10,3 12,5-15,1 18,2-22 26,6-32,1 38,8-46,9 56,7-68,5 82,8-100 relative frequency (%) blood donor sera 40 30 20 cut-off 10 0 U CENP-B Ab/mL positive sera 40 30 20 cut-off 10 0 U CENP-B Ab/mL 0911FE00.FED/HäufgPlotV1410J 14
Dynex DS2 (U/mL) bloodgivarsera positiva sera n: 160 n: 11 medelvärde: 1,0 U/mL medelvärde: 88 U/mL medelvärde + s: 1,7 U/mL medelvärde - s: 15 U/mL medelvärde + 2s: 2,4 U/mL medelvärde - 2s: < 0 U/mL median: 0,8 U/mL median: 66 U/mL 95 th percentilen: 2,1 U/mL 5 th percentilen: 18 U/mL ROC-analys av dessa data användes för att bestämma gränsvärdet som 4,0 U/mL (5). De data som presenteras här visar en diagnostisk specificitet och sensitivitet hos denna ELISA på cirka 99 respektive nästan 100 %. Dessa värden gäller endast analyserade sera; andra typer av provsamlingar kan ge andra resultat. 11.8. Manuell förfarande jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system Standardkurva: visas i paragraf 9 Korrelation: 25 20 y = 0,873 x r = 0,992 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 manual operation (U/mL) 0911FE00.FED/KorrDynexDS2-V1410J 15
Variabilitet: Genom att använda prover från en och samma kit-lot, jämfördes analysresultatens variabilitet mellan manuell användning och Dynex DS2 automatiskt ELISA-system: manuell användning Dynex DS2 variabilitet inom analys medelvärde cv = 2,5 % medelvärde cv = 3,4 % (n = 16) variabilitet mellan analyser medelvärde cv = 6,2 % medelvärde cv = 7,1 % (n = 48) 12. Garanti Euro Diagnostica AB garanterar att levererad produkt har testats grundligt för att säkerställa att de egenskaper som specificeras här har uppfyllts. Inga ytterligare garantier lämnas. De prestationsdata som presenteras här erhölls med användning av angiven metod. Eventuell modifikation av metoden kan påverka resultaten varvid Euro Diagnostica AB friskriver sig från alla garantier, såväl uttryckliga som underförstådda eller lagstiftade. Euro Diagnostica AB bär inte heller något ansvar för eventuella skador, vare sig direkta, indirekta eller efterföljande som uppstår till följd av felaktig användning eller förvaring av produkten. 13. Symboler Katalognummer Satsnummer Innehåller tillräcklig mängd för <n> tester 16
Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik Conformité Européenne Skyddas från solljus Temperaturgränser Hållbar till Varning Biologiska risker Tillverkare 17
14. Referenser 1. Mierau, R., Genth, E.: Autoantikörper bei systemischer Sklerose und verwandten Erkrankungen. In: Thomas, L. (Ed.): Labor und Diagnose (5th ed., 1998), 843-848, TH-Books Verlagsges. MbH, Frankfurt/Main 2. Aeschlimann, A., et al.: Anti-Scl-70 antibodies detected by immunoblotting in progressive systemic sclerosis: specificity and clinical correlations. Ann Rheum Dis 48 (1989), 992-997 3. Von Mühlen, C. A., Tan, E. M.: Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 24 (1995), 323-358 4. McHugh, N. J.: Centromere autoantibodies. In: Shoenfeld, Y., et al. (eds): Autoantibodies (2007), 151-157, Elsevier B. V., Amsterdam 5. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), 86-92 18
15. Sammanfattande flödesschema a. Späd sera i 1/100 i provbuffert (100 ml, klar att användas, orange) och blanda. b. Späd tvättbufferten (10x-koncentrat [100 ml, blå]) med vatten och blanda. c. Tvätta brunnarna en gång med 350 ul tvättbuffert vardera. Dispensera 100 ul av kalibratorerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gradvis blå), kontrollerna (2,0 ml i varje, klara att användas, grön och röd) samt de utspädda proverna i den fasta fasens brunnar. Mätningar i duplikat rekommenderas. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). d. Tvätta brunnarna 4 gånger med 350 ul tvättbuffert vardera. e. Dispensera 100 µl av konjugatet (14 ml, klart att använda, rött) i brunnarna. Inkubera som i steg c. f. Upprepa tvättmomentet i steg d. g. Dispensera 100 µl av substratlösningen (14 ml, klar att använda, svart flaska) per brunn. Inkubera som i steg c och tillsätt därefter 100 µl stopplösning (14 ml, klar att använda, färglös) per brunn och skaka plattan en kort stund. h. Mät omedelbart absorbansen vid 450 nm. i. Kvantitativ utvärdering: Bestäm standardkurvan och omvandla provernas absorbans, med användning av denna kurva, till deras respektive antikroppskoncentration (U CENP-B Ab (IgG)/mL). j. Kvalitativ utvärdering: Bestäm gränsabsorbansen genom att multiplicera absorbansen i den positiva kontrollen med den faktor som anges i analyscertifikatet. Beräkna därefter provernas kvot genom att dela deras absorbans med gränsabsorbansen. 19