Determining cross-reactivity between human and mouse tissue using mono-specific antibodies Avin Monazzami

Examensarbete 10 poäng C-nivå Vt 2007 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Determining cross-reactivity between human and mouse tissue using mono-specific antibodies Avin Monazzami Handledare: Kenneth Wester & Dijana Cerjan Institutionen för genetik och patologi Rudbecklaboratoriet, Uppsala 1

ABSTRACT The Swedish Human Proteome Resource (HPR) is a project about mapping of human genes and proteins. It aims to describe the function and distribution of all human genes and corresponding proteins, using in-house produced antibodies and tissue microarrays (TMA) for enzyme based immunohistochemistry. The mono-specific antibodies are used for immunostaining of human tissue. Specific predicted antigens named Protein Epitope Signature Tag (PrEST) are needed to produce mono-specific antibodies. PrEST are produced using recombinant technology from predicted genes and used as immunogens to produce (mono-specific) antibodies in rabbits. In this study, 84 mono-specific antibodies with known specificity to human proteins were used for immunohistochemical analysis of mouse tissues to determine the cross reactivity between mouse and human. For 6 of the 84 antibodies the results differed between mouse and human tissue. A comparison between the PrEST used with the mouse proteome using database search programs showed homologies that were less than 100% in these six cases. Thus, future studies on cross reactivity will focus on how to increase the accuracy in its prediction at the in silico stage of the experiment. Key words: TMA, immunohistochemistry, mouse, PrEST, mono-specific antiboies. 2

INTRODUKTION The Swedish Human Proteome Resource (HPR) är ett projekt som syftar till att utifrån HUGO-projektet (Human Genome Organistion), beskriva funktion och distribution för alla humana proteiner. Genom att utnyttja den genetiska informationen framställs proteiner och sedan antikroppar mot dessa. Det initiala målet var att kartlägga alla proteiner som kodas av gener på kromosom nr 21 [1]. I HPR- projektet analyseras formalinfixerad och paraffininbäddad tumörvävnad och normalvävnad från patologens arkiv. Karakteriseringen sker genom immunhistokemisk färgning av dessa vävnader som samlats i egentillverkade TMA-klotsar [2]. Senare utvärderas färgningen avseende lokalisation av proteiner i vävnad och celler. Nästan 60% av proteomet är redan känt på gennivå och resterande är okänt (se figur 1).Resultatet av analyserna blir en publik webbaserad databas [3]. Fig1. Ett diagram av kända och okända humana proteiner. En av kroppens viktigaste byggstenar är proteiner. Proteiner är komplexa organiska ämnen med hög molekylvikt som består av aminosyror och är sammanhållna med peptidbindningar. Det finns hundratals aminosyror men endast 20 stycken förekommer i 3

de humana cellernas proteiner. Funktionen för varje protein bestäms av en eller en grupp gener i arvsmassan. Proteinernas betydelse för de levande organismerna beror framförallt på deras komplexa tredimensionella form och därmed varierande funktion. Proteiner har en mängd olika viktiga och nödvändiga funktioner och grupperas ofta efter dessa, till exempel enzymer, transportproteiner, hormoner, och antikroppar. Hos människa och mus har troligen mer än 80% av proteinerna likartade funktioner och det skapar förutsättningar för ett effektivt sökande efter ny kunskap om människan hos musen. Man kan även jämföra de enskilda generna hos mus och människa. Vad man då jämför är DNAsekvensen, som beskriver en specifik gens uppbyggnad. Utvecklingen inom immunhistokemisk analys går snabbt. Immunhistokemi är en antikroppsbaserad metod, som användes för att studera var utvalda proteiner finns i olika vävnader i kroppen. Resultatet används ofta för att dra slutsatser om proteinets funktion och distribution. Immunhistokemi är ett viktigt redskap för visualisering av proteiner i vävnad och celler. Denna metod har hög specificitet på grund av antikroppens egenskaper att specifikt binda till antigen i vävnader och celler. Immunhistokemisk färgning kan utföras på olika sätt: med s.k. direkt metod där antikroppen som binder sitt antigen är märkt med enzym eller kromogen eller med indirekt metod- en tvåstegsreaktion där den primära antikroppen är omärkt medan den sekundära antikroppen är märkt för visualisering av antigenet. En annan immunhistokemisk färgnings metod är kedjepolymerkonjugerad teknologi (LabVision, DAKO) som är baserad i princip på en indirekt tvåstegsmetod. Den primära antikroppen binder specifikt till antigenet medan den sekundära antikroppen är polyklonal. Ofta används LabVision som sekundär antikroppp, 4

vilket innebär att flera sekundära antikroppar är konjugerade till en dextranmolekyl. Vid en indirekt tvåstegsmetod är den sekundära antikroppen ofta konjugerad med ett enzym som peroxidas (HRP) som oxiderar många substanser. Kromogena substrat ger efter tillsats en färgad produkt som kan ses i ljusmikroskop [5]. Fixering av vävnadsprover måste ske omedelbart eftersom många proteiner förändras snabbt via proteaser och bakteriell nedbrytning. Det mest använda fixativet är formaldehyd (10% formalin). Vävnaderna tål formalinbehandlingen väl och formalinet har god genomtränglighet. Många epitoper har bra immunreaktivitet efter fixeringen men vissa epitoper maskeras eller förändras vid formalinfixeringen. Nu finns metoder som återaktiverar dessa epitoper s.k. antigen retrival. Det finns flera olika former av antigen retrival, men vanligast är värmebaserad eller proteasbaserad. I den proteasbaserade metoden kan olika enzymer användas. Pepsin och trypsin är de vanligaste. Enzymerna gör de gömda epitoperna tillgängliga genom att bryta peptidbindningar [4]. I detta arbete användes den värmebaserade metoden Heat Induced Epitope Retrieval (HIER). Denna leder till att vissa (reversibla) korsbildningar som bildats vid fixeringen bryts och antigenet återfår sin ursprungliga form. Immunhistokemi går ut på att man utnyttjar antikropparnas egenskap att binda specifikt till en given epitop. För att utföra immunhistokemisk färgning finns olika typer av antikroppar. Polyklonala antikroppar produceras oftast i djur som kanin och get. Till var och en av antigenets epitoper kommer en antikropp att produceras, som kan binda till olika epitoper på och i cellerna [6]. Monoklonala antikroppar produceras av klonade 5

B-celler från immunisering av möss. De riktar sig mot endast en epitop i antigenet. Human Proteome Resource använder mono-specifika antikroppar som framställs från polyklonala antikroppar, vilka renats med affinitetsrening [7]. För att framställa monospecifika antikroppar behövs en immunogen epitopstruktur som utgör en representativ del av proteinet. För detta behövs en gensekvens motsvarande 100-150 aminosyror som kallas PrEST (Protein Epitope Signature Tag). Designen av PrEST utgår ifrån de delar av det humana genomet, som bedöms vara gener utifrån den kunskap vi har om gemensamma start-och stoppsekvenser för en gen. I vissa experimentella sammanhang kallas denna EST (expressed sequence tags). Den bit av genen, som väljs för proteinuttryck, ska uppvisa minsta homologi med övriga humana proteiner, vilket leder till ökad specificitet hos antikroppen. Gensekvenser som kodar för signalpeptid och transmembran region undviks. Ett specifik primerpar designas för varje PrEST och amplifiering sker med hjälp av RT-PCR. Här används mrna från olika humanvävnader. Det amplifierade genfragmentet klonas i vektor med dubbel affinitetstag bestående av en hexahistidyltag (His) och ett albuminbindande protein (ABP) i E-coli. E-coli växer i ett flytande medium, som lyseras senare i närvaro av guanidiniumklorid. Rening av lystatet görs med hjälp av IMAC (Immobilized metal affinity chromatography) med nickelinnehållande matris [1]. Renade PrEST används senare som immunogen i kaniner för att framställa antikroppar. En semiautomatiserad affinitetskromatografisk metod används för att rena PrEST-antikropparna från kaninserum. Först tas alla antikroppar som har bildats mot albuminbindande protein och hexahistadin bort genom ett s.k. depletion steg. Sedan binds PrEST-specifika antikroppar till en ny kolonn där samma PrEST som 6

vid immuniseringen används, här som ligand. Western blot och PrEST-array används för kvalitetssäkring innan de mono-specifika antikropparna används [8]. I denna studie användes monospecifika antikroppar för immunhistokemisk färgning av humanvävnad och motsvarande musvävnad för att verifiera eventuella korsreaktioner mellan människa och mus. För att kunna använda antikropparna i immunhistokemisk färgning måste rätt spädning av antikropparna bestämmas. Därför utfördes initialt en antikroppstitrering. Titreringen måste alltid göras på grund av att en antikropp med hög affinitet binder snabbare och ger intensivare färgning än en med låg affinitet vid samma koncentration. Man söker maximal, specifik färgning med minsta mängd ospecifikt bindning i omgivande vävnad, dvs. en hög signal-to-noice ratio. Bakgrundfärgning är ett av de problem som förknippas med immunhistokemi. Vid fixering i aldehyder som formalin ökar både hydrofoba och elektrostatiska krafter. Den mest förekommande bakgrundfärgningen orsakas av hydrofoba interaktioner och elektrostatiska interaktioner med proteiner som är både hydrofoba och laddade, det kan vara negativt eller positivt i fysiologiskt ph. Makrofager och granulocyter kan ge till bakgrundsfärgning på grund av att de har Fc-receptorer som antikroppen kan binda till [4]. Korsreaktioner kan ske vid immunfärgning på grund av likhet mellan epitoper, representerade i många proteiner. Vi använde mono-specifika antikroppar, vilket minskar benägenheten till korsreaktion. Syftet med detta projekt var att studera i vilken grad korsreaktivitet finns mellan mus-och humanvävnad vid användning av mono-specifika antikroppar. Arbetet bestod i att tillverka 7

TMA-klotsar av formalinfixerade och paraffininbäddade musvävnader, snittning och immunhistokemisk färgning av musvävnad med mono-specifika antikroppar och mikroskopisk undersöka eventuell korsreaktivitet för respektive antikropp i de valda vävnaderna. Blastsökning i NCBIs databas för de PrEST som gav avvikande resultat utgjorde sista delen av projektet. MATERIAL OCH METOD Provmaterial 21 formalinfixerade och paraffininbäddade musvävnadsklotsar med lever, njure, pankreas, hud, hjärta, urinblåsa, tunntarm, tjocktarm, testis, mjälte, magsäck, lunga, thyroidea, och hjärna. Musstammen heter NMRI och kommer från Möllegård (Danmark). Djuren var ca 10 veckor vid avlivning. I arbetet användes 84 HPR-antikroppar, samtliga monospecifika från KTH i Stockholm Innan TMA-framställning Innan framställning av TMA-klotsar, snittades de ursprungliga vävnadklotsarna, som i vårt fall var formalinfixerad och paraffininbäddad musvävnad. För detta arbete användes en vattenfallsmikrotom, Mikrom HM 355 S. Snitten placerades på objektglas (Super frost Menzel GmbH & Co). Därefter inkuberades de vid 50ºC över natt och avparaffinering av glasen gjordes i xylen 2 5 min. Sedan följde rehydrering i absolut etanol 2 5 min, 95% etanol 2 5min, 80% etanol 5 min, och slutligen vatten i 1 min. Färgningen av glasen gjordes i hematoxylin 3 min, kranvatten 10 min, eosin 30 sek, 2 80% etanol (endast snabba dopp), 3 95% etanol (endast snabba dopp), 2 absolut etanol totalt ca 5 min. Därefter förvarades glasen i xylen för att minska uttorkningen innan monteringen. Lite 8

monteringmedel (Pertex) togs med träpinne och stryktes på ett täckglas som placerades på glaset. Eventuella luftbublor pressades ut mot kanterna vid appliceringen av glaset. De monterade glasen placerades sedan på brickor som lades på tork övernatt i rumstemperatur. Vid mikroskopering kontrollerades att snittet var bra och att färgningen var rätt utförd. Representativa delar av snitten markerades för senare framställning av TMA. Tissue Microarray (TMA) Små 1mm stansbiopsier togs från representativt område i respektive vävnadsprov. Det kan vara tumör eller normalvävnad beroende av TMA-klots. TMA-produktionen började med att ett litet hål gjordes i mottagarblocket och en cylindrisk biopsi togs sedan från varje vävnadsprov och placerades i mottagarblocket. Detta gjordes med hjälp av en MTA-1 manual tissue arrayer från Beecher Instrument. För att utföra denna process behövdes en mall som visade position för varje enskild vävnadsbiopsi i TMA-klotsen. Man behöver två biopsier som orienteringskontroll vid snittning och placering av TMAsnittet på objektglaset. Från 21 olika normala musvävnader togs två stansar och placerades i TMA-klotsen. Efter detta moment lades TMA-klotsen i ugnen cirka 1 timme och på ett isblock 15 min innan snittning. TMA-snittning På ett preparat för ljusfältmikroskopiska undersökningar ställs speciella krav. Det ska vara mycket tunt, för att släppa igenom ljus och ge en detaljerad och skarp bild av vävnaden. TMA-snitt ska vara 4µm tunna, vilket ställdes in på vattenfallmikrotomen. Snitten lades sedan på 37 C vattenbad, och två snitt, en human och en musvävnad 9

placerades sedan på ett märkt objektglas. Därefter inkuberades varje snitt i 50 C över natt. Avparaffinering och rehydrering Avparaffinering av glasen gjordes i xylen 2 5 min, sedan följde rehydrering i absolut etanol 2 5 min, 5 min i H 2 O 2 (0,03% H 2 O 2 i 100% etanol) för blockering av endogent peroxidas, 95% etanol 2 5 min, 80% alkohol 5 min, destillerat vatten 1 min. Denna process gjordes för att överföra snitten till vattenfas, en förutsättning för den immunhitokemiska färgningen, där alla reagenser är vattenbaserade. Antigen retrieval Här användes den värmebaserade metoden, HIER (Heat Induced Epitope Retrieval), med hjälp av tryckkokare från Biocare Medical. Instruktioner för retrieval-proceduren är beskriven i tillverkarens specifikationsblad, som följdes i detta försök. De färdigsnittade TMA placerades i tryckkokare med tillsats av TRS (target retrieval solution citratbuffert ph 6) och värmdes till 125 C under 4 min. Senare kyldes glasen under rinnande vatten och placerades därefter i tvättbuffert med 0,1% Tween innan immunhistokemisk färgning. Immunhistokemisk färgning Ett automatiserat instrument (Autostainer Dako Cytomation) användes för immunhistokemi färgningen och det gick att färga 48 objektglas samtidigt. Vävnadssnitten inkuberades med primära antikroppar, som i vårt fall är monospecifika, 30 min i rumstemperatur. Senare sköljdes glasen i tvättbuffert. HRPmärkt get-anti- kanin- 10

dextranpolymer (LabVision) tillsattes och glasen inkuberades 30 min i rumstemperatur, varefter sköljningen upprepades. Som kromogent substrat användes diaminobenzidin ChemMate DAB, Dako. Slutligen sköljdes proverna och glasen placerades i destillerat vatten. Motfärgning gjordes i Mayers Hematoxylin (Histolab) i 10 min. Efter sköljning i kranvatten avlägsnades överflödig färg genom att glasen doppades 10 sek i litiumkarbonat (MERCK). Färgen oxiderades sedan i kranvatten i ca10 min. Dehydrering och montering Snitten dehydrerades i stigande etanolkoncentration från 80% etanol till absolut etanol och placerade därefter i xylen. Slutligen monterades glasen med Pertex, ett xylenbaserat monteringmedel. Mikroskopering Mikroskopering av de immunhistokemisk färgade TMA-snitten gjordes i ljusfältmikroskop (BH-2, Olympus). Preparaten från human och musvävnad granskades för att urskilja strukturer, upptäcka eventuella artefakter och för tolkning av resultatet. RESULTAT Efter immunhistokemisk färgning och mikroskopering av mus-och humanvävnad med mono-specifika antikroppar samlades resultatet i en tabell (Tabell 1). I denna anges vävnadspositivitet för de utvalda proteinerna i både mus-och humanvävnad. 11

Tabell 1. Resultatet av immunhistokemisk färgning av mus och humanvävnad vid användning av monospecifika antikroppar. HPR nr (HPRK) Product name Stomach Small intestine Large intestine Pancreas Liver Lung Kidney Urinary bladder Prostate Seminal vesicle Testis Epididymis Thyroid gland Salivary gland Cerebellum Cerebrum Spleen Skeletal muscle Heart Smooth muscle Skin PrEST homology med musprotein 140019 Anti-VRK1 -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 90% 140038 Anti-MTHFD1 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- +/+ +/+ 87% 140043 Anti-AMN +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 69% 140044 Anti-NPC2 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 81% 140045 Anti-KIAA0586 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 22% 140097 Anti-PSMA3 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 98% 140106 Anti-PSMA3 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 76% 140133 Anti-PSMA3 +/+ +/+ +/+ +/- +/- +/- +/- -/- +/- +/ +/- +/- +/- +/- +/- -/- +/+ -/- +/- +/- +/+ 90% 140169 Anti-CKB +/+ +/+ +/+ +/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/- +/+ +/+ -/- -/- 99% 140181 Anti-FRMD6 +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- +/+ -/- +/+ -/- +/+ 94% 140247 Anti-NP-00 +/- +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ -/- -/+ 45% 140255 Anti-SIX1 +/+ +/- +/+ +/+ +/- +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/- +/- +/+ +/+ +/+ +/- +/- 99% 140294 Anti-NUMB +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 89% 140301 Anti-NPAS3 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/- +/+ +/+ +/- +/- 97% 140366 Anti-GPHN +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- +/+ -/+ +/+ -/+ 100% 140374 Anti-KTN1 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ 80% 220031 Anti-FAM109B +/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/+ -/- -/- -/+ -/+ -/- -/+ 70% 220057 Anti-POLR2F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ 100% 220170 Anti-TOM1 -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ 90% 220240 Anti-SULT4A1 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- -/- 99% 220243 Anti-TNRC6B +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 95% 220254 Anti-TXNRD2 -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- 80% 220276 Anti-LGALS2 +/- +/+ +/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- +/- +/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 67% På varje rad redovisas resultatet Mus/Human vävnadspositivitet. 12

HPR nr (HPRK) Product name Stomach Small intestine Large intestine Pancreas Liver Lung Kidney Urinary bladder Prostate Seminal vesicle Testis Epididymis Thyroid gland Salivary gland Cerebellum Cerebrum Spleen Skeletal muscle Heart Smooth muscle Skin PrEST homology med musprotein 220287 Anti-TST +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 91% 230009 Anti-DKC1 -/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ 99% 230025 Anti-HTATSF -/+ -/+ +/+ -/+ +/+ -/+ -/+ +/+ -/+ +/+ -/+ -/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ 78% 230068 Anti-PIM2 -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/+ -/- -/- -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 92% 230070 Anti-GPKOW -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ 92% 230071 Anti-ACE2 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- +/+ -/- -/- 74% 230072 Anti-UBE1 -/- -/- -/- -/- +/+ -/- +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- -/- -/- 100% 230119 Anti-COVA1 -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/+ -/+ -/- +/- -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/+ 99% 230141 Anti-REPS2 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 88% 230210 Anti-LMO6 -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ -/+ -/+ 79% 230311 Anti-HNRPH2 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 100% 230339 Anti-CNKSR2 +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 97% 230342 Anti-UBE1 +/- +/- +/- +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- +/+ +/+ 99% 230360 Anti-RPGR +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 46% 230405 Anti-GPKOW -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ 66% 230420 Anti-HUWE1 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ 97% 230436 Anti-FGF13 +/+ +/+ +/+ +/- +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/- +/- +/- -/- 99% 230453 Anti-PGRMC +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/- -/- +/+ -/+ 97% 230457 Anti-STS +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/- -/- +/- -/- 35% 230460 Anti-GPM6B +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/- 96% 230462 Anti-ITM2A +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 98% 230483 Anti-CUL4B +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ 96% På varje rad redovisas resultatet Mus/Human vävnadspositivitet. 13

HPR nr (HPRK) Product name Stomach Small intestine Large intestine Pancreas Liver Lung Kidney Urinary bladder Prostate Seminal vesicle Testis Epididymis Thyroid gland Salivary gland Cerebellum Cerebrum Spleen Skeletal muscle Heart Smooth muscle Skin PrEST homology med musprotein 230497 Anti-EBP +/+ -/+ -/- -/- +/+ -/- +/- +/- -/+ -/- +/+ +/- -/- -/- -/- -/- +/+ -/- -/- -/- -/- 77% 230505 Anti-BGN +/+ +/+ -/- +/+ -/+ -/+ -/+ -/+ +/- +/- -/+ -/+ +/+ +/+ -/- -/- -/+ -/- -/- -/- -/+ 94% 230509 Anti-NLGN3 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/- -/- -/+ +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/- -/- +/- -/- +/- -/- -/+ 100% 230526 Anti-LRCH2 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 86% 230543 Anti-SLC16A2 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/+ -/- -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- 61% 230612 Anti-PCSK1N -/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- 89% 230624 Anti-MAP3K1- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 92% 230627 Anti-TSPAN6 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- -/- -/- -/- +/+ 83% 240010 Anti-UTY +/+ +/+ +/+ -/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- -/+ -/- -/- -/- -/- 97% 250001 Anti-TPM1 -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- +/- -/- 99% 250013 Anti-GAB2 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 88% 250048 Anti-LGALS3B -/+ -/- -/- -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/+ -/- -/- 67% 250054 Anti-CRIM1 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ -/- -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/-? 88% 250071 Anti-PRG1 -/- -/- -/- -/- -/- -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/+ -/- -/- -/+ -/- -/- -/- -/- 53% 250084 Anti-RHOBTB +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- -/+ -/- -/- -/- +/- +/- +/- 97% 250089 Anti-PDCD4 +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+? 98% 260037 Anti-FOXO1A +/+ +/+ +/+ +/- +/- +/- +/+ +/+ +/- +/+ +/- +/+ +/- +/- +/+ +/- -/- +/+ -/- -/-? 91% 280029 Anti-RAB27A +/+ -/- -/- +/+ -/- -/+ +/- -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- +/- -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- 96% 280034 Anti-ADA +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/+ -/- -/- -/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/- -/- -/- -/- +/+ 85% 330010 Anti-IMPDH2 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ 98% 330019 Anti-IL1RN +/+ +/+ +/+ -/- +/- +/- +/- -/+ +/+ +/+ +/- +/-? -/- -/- -/- +/- -/- -/- -/-? 76% 330020 Anti-ECE1 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ 98% 330027 Anti-IL23A +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ +/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- -/- -/- 75% På varje rad redovisas resultatet Mus/Human vävnadspositivitet. 14

HPR nr (HPRK) Product name Stomach Small intestine Large intestine Pancreas Liver Lung Kidney Urinary bladder Prostate Seminal vesicle Testis Epididymis Thyroid gland Salivary gland Cerebellum Cerebrum Spleen Skeletal muscle Heart Smooth muscle Skin PrEST homology med musprotein 330046 Anti-PRSS15 +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ -/+ -/+ +/+ -/+ -/- +/+ -/- -/+ -/+ -/+ +/+ -/- -/- -/- -/- 95% 330049 Anti-ITGAM -/- -/- -/- +/+ -/- +/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/- +/+ -/- -/- -/- +/+ -/- -/- -/- +/+ 97% 350016 Anti-PON1 +/+ +/+ +/+ +/+ +/- +/+ +/+ -/- +/+ +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ +/+ 78% 350037 Anti-CFAB- +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 86% 350044 Anti-CD14 +/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/+ -/- -/- -/- -/- +/+ -/- +/+ +/- +/+ +/- +/+ -/- -/- -/- -/- 57% 360025 Anti-CLOCK +/- -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ 90% 360034 Anti-SIM1 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+?? +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+ -/- -/+ 96% 360070 Anti-CUTL1 +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ -/+ -/+ 72% 370017 Anti-MYOM2 +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+? 75% 370022 Anti-ITGB5 +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ -/+ -/+ -/+? 88% 400016 Anti-IRF4 -/- -/- +/- -/- -/- +/- -/- +/- -/- -/- +/- +/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- 90% 520001 Anti-PAG1 +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/- +/- -/- -/- +/+ -/- +/- -/+ +/+ +/- -/+ -/- -/+ -/- -/- 73% 550001 Anti-PSMC4 +/+ +/- +/+ +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- 100% 550003 Anti-ITGA5 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- 85% 550006 Anti-PDIA3 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 95% 590012 Anti-MTERFD- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/- +/+ +/- +/+ +/+ +/- +/+ +/- +/- +/+ +/+ +/+ 98% På varje rad redovisas resultatet Mus/Human vävnadspositivitet.?=det fattas vävnadsbiopsier 15

DISKUSSION TMA-teknologin blev en stor revolution inom forskning rörande cellulär patologi och studier om proteinuttryck [9]. I denna studie använde vi TMA för att undersöka proteinuttryck i olika normala mus-och humanvävnader. Fördelen med TMA är att tekniken kräver mindre vävnadsmaterial och reducerar reagensvoylmerna och således minskar kostnaderna och förbättrar arbetsmiljön [10]. En annan fördel med att använda TMA är att man kan samla biopsier av alla normala vävnader på ett enda objektglas och många cancervävnader på få objektglas [11]. Fördelen med att använda mono-specifika antikroppar är att de leder till ökad specifik bindning och detta leder till mer pålitligt resultat. Nackdelen med att använda monospecifika antikroppar är att reningsproceduren kräver mycket protein och blir mer tekniskt krävande jämfört med orenade polyklonala antikroppar [7]. Numera används den indirekta metoden för immunhistokemisk färgning. Fördelen med att använda en indirekt metod är att känsligheten ökar för varje steg och den är därför utmärkt om man vill påvisa antigenmängder i vävnader eller celler. Det automatiserade instrument som användes reglerar tid, volym och underlättar färgning [12]. För att minska risken för bakgrundfärgning användes enzymbaserad immunhistokemi då t.ex alternativet avidinbiotin metoden erfarenhetsmässigt leder till ökad bakgrund på grund av ospecifik bindning till endogent biotin. I denna diskussion diskuteras de sex utvalda proteiner som hade helt olika vävnadsdistribution i mus jämfört med människa. HPR-antikropp nr (230405 Anti-GPKOW). Vid mikroskopering av denna antikropp var musvävnaderna helt ofärgade medan humanvävnaderna uppvisade stark kärnfärgning och 16

svag cytoplasmatisk färgning i lever, lunga och njure. Western blot visade ett band med rätt storlek för proteinet 52 kda. Vi inhämtade information om detta protein hos människa och mus, vilken visade att proteinet har 3 splicingvarianter hos människa varav 2 uppvisar 100% homologi med det humana protein och den andra 79% homologi med proteinet. Detta kan vara en förklaring till varför infärgningen hos humanvävnad återfanns både i cytoplasma och kärna. Information om musproteinet visade att musen har två proteiner från helt olika gener-en på kromosom X och den andra på kromosom 8. En blastsökning av de två proteinerna mot PrEST:en visade inte så långa gemensamma sekvenser för antikroppen att binda till (se figur2). Fig2: Jämförelse mellan PrEST och GPKOW musproteinet. Denna figur visas att det finns inte så långa gemensamma sekvenser, för antikroppen att binda till. 17

HPR-antikropp nr (250048 Anti-LGALS3BP). Vid mikroskopering av preparat infärgade med denna antikropp var musvävnad helt ofärgad medan humanvävnad hade svag cytoplasmatisk färgning t.ex. i magsäck, lever, tunntarm och njure. Informationen om detta protein visade att det bara finns ett transkript och inga splicingvarianter hos människa. Western blot visade inte rätt storlek för detta protein. Vi blastsökte musproteinet mot PrEST:en. De var identiska till 60%. Men sannolikheten att antikroppen skulle binda till proteinet var låg på grund av att det inte finns så långa sammanhängande sekvenser som antikroppen kan binda till, alltså PrEST:en matchade inte starkt mot musproteinet (se figur 3). Fig3: Jämförelse mellan PrEST och LGALS3BP musproteinet. Denna figur visas att det finns inte så långa gemensamma sekvenser för antikroppen att binda till. 18

HPR-antikropp nr (140106 Anti-MAP3K9). Mikroskopering efter denna antikroppsfärgning visade stark kärnfärgning i musvävnad medan humanvävnaden var svagt cytoplasmatisk färgad. Information om detta protein hos människa visade att det finns två proteiner från en och samma gen hos människan. Proteinerna är 100% identiska, dessutom visade Western blot rätt band med rätt storlek 123 kda för båda proteinerna. Inga transmembranregioner hittades hos proteinerna. Mus har bara ett protein och ingen splicing. En blastjämförelse av musproteinet mot PrEST:en visade att de var till 93% identiska. Det fattas bara några aminosyror i början av musproteinet, som kan påverka antikroppsbindningen i musvävnad (se figur 4). Fig4: Jämförelse mellan PrEST och MAP3K9 musproteinet. Denna figur visas att det fattas några aminosyror i början av PrEST.en 19

HPR-antikropp nr (220287 Anti-TST). Vid mikroskopering efter infärgning fick vi helt olika resultat. I detta fall visade musvävnad bara stark kärnfärgning medan humanvävnad endast var cytoplasmatiskt färgad. Western blot visade ett band med rätt storlek 33 kda för detta protein. Antal humana transkript hos människa var bara ett, medan mus hade två olika transkript från olika gener. En blastjämförelse av de två transkripterna visade att de var till 50% identiska. Senare blastjämförde vi de två transkripten mot PrEST.en och likheten mellan dem återfanns bara i korta sekvenser. Detta antyder att sannolikheten för att antikroppen bundit till bägge transkripten var låg. HPR-antikropp nr (140097 Anti-PSMA3). Mikroskopering av preparat infärgade med denna antikropp visade att musvävnaden hade starkare infärgningar i både kärna och cytoplasma medan humanvävnad visade cytoplasmatisk färgning. Western blot visade ett band med rätt storlek 28 kda för detta protein. Vi undersökte antal transkript och splicingvarianter hos människa och mus. Proteinet hade inga alternativa transkript eller splicingvarianter i människa medan mus hade två proteiner från helt olika gener-en på kromosom 6 och den andra på kromosom 12. Vid blastsökning av de två musproteinerna visade det sig att de var identiska till 100%, dvs antikroppen borde kunna binda till ett protein hos människan och två proteiner hos mus. Detta kan förklara skillnaden som vi fick i immunhistokemi färgningen av musvävnad i jämförelse med humanvävnad (se figur 5). 20

Fig5: Blast av musproteinerna PSMA3. Blastningen av proteinerna visar att proteinerna är 100 % identiska HPR antikropp nr (230009 Anti-DKC1). Mikroskopering visade att musvävnaden var negativ medan humanvävnad uppvisade kärninfärgning. Detta protein har inga transkript, splicingvarianter eller homologi med andra proteiner hos mus eller människa. Western blot visade rätt band med rätt storlek 58 kda för proteinet och information om proteinet visade att 3 av 5 prediktorer visade att detta protein har en transmembran region. Men detta kan inte påverka resultatet då PrEST:en inte var designad för denna region. Det är möjligt att proteinet har så låg koncentration hos mus att det inte kunde detekteras eller att proteinet har förändrats under evolutionen (se figur 6). 21

Fig6: Jämförelse mellan PrEST och DKC1musproteinet. Denna figur visas att det PrEST och musproteinet är 99% identiska. Efter immunhistokemisk färgning med mono-specifika antikroppar i musvävnad och blastsökning av PrEST mot musprotein i NCBIs databas avseende homologi kan slutsatsen dras att man inte kan bestämma korsreaktivitet av mono-specifika antikroppar bara på gennivå, endast utifrån homologi i aminosyrasekvens. Hur man säkrast förutsäger korsreaktivitet över speciesgränsen mus-människa kommer att utredas i fortsatta studier. 22

ACKNOWLEDGEMENT En särskilt tack till Kenneth Wester för att jag fick det intressanta projektet och hjälpen under hela arbetet. Jag tackar också Dijana Cerjan som alltid varit tillhands och svarat på alla mina frågor och hjälpt mig med den praktiska delen av laborationsarbetet. Jag tackar Cristina Al Kalili från KTH för hjälpen att blastsökning för proteiner och komma till en rimlig och bra slutsats. Jag vill också tacka alla som arbetar i HPR-projektet för att jag fick vara med och alltid känna mig välkommen hos er. REFERENSER [1] Agaton C, et al. Affinity proteomics for systematic protein profiling of chromosome 21 gene products in human tissues. 2003, Molecular & Cellular Proteomics, 2, 405-414 [2] Kononen J, Bubendorf L, et al. Tissue microarrays for hight throughput molecular profiling of tumor specimens. 1998, Nature Medicine, 4, 844-847 [3] Uhlen M, Björrling E, A Human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. 2005, Molecular & Cellular Proteomics, 4, 1920-1932 [4] Vara R, J.A, Techinical acpects of immunhistochemistry. 2005, Veterinary Pathobiology, 42, 405-426 [5] Handbook, DAKO Corporation, Immunochemical staining methods.2001, 6, 26-31 [6] Uhlen M, Pontén F. Antibody-based proteomics for human tissue profiling. 2005, Molecular and Cellular proteomics, 4, 384-393 23

[7] Nilsson P, Paavilainen L, et al. Toward a human proteome atlas: High-throughput generation of mono-specific antibodyies for tissue profiling, 2005, Clinical Proteomics Journal, 5, 4327-4337 [8] Agaton C, Uhlen M, et al Genom-based proteomic. 2004, Electrophoresis, 25, 1280-1288 [9] Bubendorf L, Nocito A, et al. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized patohology archives for high-throughput in situ studies. 2001, Journal of Pathology, 195, 72-79 [10] Warford A. Tissue microarrays: fast-tracking protein expression at the cellular level. 2004, Clinical Proteomics Journal, 3, 283-292 [11] Kamp C, Andersson A. et al. Antibody-based Tissue Profiling as a Tool for Clinical Proteomic. 2005, Clinical Proteomics Journal, 1, 1-15 [12] Warfard A, Howat W, et al. Expression profiling by high-throghput immunhistochemistry. 2004, Journal of Immunological Methods, 290, 81-92 24

25