INTRACELLULAR DISTRIBUTION PATTERNS OF ORGANELL SPECIFIC PROTEINS USING IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING OF TISSUE MICRO ARRAYS.

Transkript

1 Biomedicinsk analytiker program 10p INTRACELLULAR DISTRIBUTION PATTERNS OF ORGANELL SPECIFIC PROTEINS USING IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING OF TISSUE MICRO ARRAYS Dijana Cerjan Institutionen för genetik och patologi Rudbeck laboratoriet, Uppsala Handledare: Kenneth Wester Linda Paavilainen

2 ABSTRACT The knowledge of the human genome sequence, as revealed in the HUGO project, has created exciting new possibilities for biomedical research. The Swedish Human Proteome Resource (HPR) program aims to make use of this information to gain further insight into the human proteome. Recombinant proteins are generated from coding sequences identified from the human genome sequence and used to produce specific antibodies to target proteins. Antibodies are subsequently utilized for functional analysis of the corresponding proteins using tissue micro arrays. The aim of my project was to investigate the possibility of distinguishing characteristic distribution patterns of intracellular proteins in the resolution capacity offered by light microscopy. A map of representative distribution patterns was created using immunohistological staining with commercially available antibodies toward well-characterised proteins in the cell. Such a map could then aid in interpreting the results of immunohistological staining of intracellular proteins using antibodies produced within the Human Proteome Resource program. Proteins manifested in nucleus, nuclear membrane and plasma membrane were clearly visible at the expected location. Proteins manifested in different organelles in the cytoplasm however, showed all a similar staining pattern, making determination of exact protein location uncertain. A possible explanation is the resolution of the light microscope not being sufficient to visualize certain proteins specific to organelles in the cytoplasm. Results may also have been influenced by the choice of secondary antibody, where the strenghtened signal generated by an enzyme labelled polymer may have a negative effect on depiction of details in the image generated. Key words: proteomic, TMA, Immunohistokemistry, Bright field microscopy, intracellular 2

3 The Swedish Human Proteom Resource (HPR) är ett projekt vars grundprincip byggdes på ett pilotprojekt som utfördes av en grupp forskare från Institutionen för bioteknologi- Kunglig Teknisk Högskola (KTH) Stockholm. Målet med pilotprojektet var en kartläggning av alla proteiner som kodas av gener som finns på kromosom 21 (1). HPR-projektet syftar till att utifrån HUGO- projektet beskriva funktionaliteten hos alla humana gener. Genom att utnyttja den genetiska informationen framställs antikroppar mot människans proteiner, som sedan studeras med avseende på lokalisation och distributionmönster i vävnadspreparat. Detta görs på egentillverkade Tissue Micro Arrays (TMA). Mitt arbete gick ut på att immunhistokemiskt färga vävnadspreparat med kommersiellt tillgängliga antikroppar riktade mot avseende distributionsmönster välkarakteriserade proteiner i cellkärna och cellorganeller. På så sätt skapades en provkarta av olika intracellulära distributionsmönster som sedan utverderades vid den upplösning som ljusfältmikroskopi erbjuder. Provkartan kan senare vara till hjälp vid tolkning av de immunohistokemiska färgningsresultat som erhålls med i HPR- projektet framställda antikroppar med okänt mönster. Metoder som användes i projektet var: snittning, immunohistofärgning, mikroskopering och bildanalys. 3

4 Schematiskt går kartläggningen av humana proteiner till så här: Till att börja med identifieras lämpliga gensekvenser i HUGO databaser, sådana som är unika för varje protein. Mycket av svårigheterna ligger i att tillverka en korrekt proteinstruktur. Finessen är att identifiera ett särdrag hos ett protein, dvs att hitta en representativ del av proteinet, som är unik i jämförelse med alla andra proteiner i kroppen. Varje vald gensekvens kodar för aminosyror och kommer att utgöra en så kallad PrEST (Protein Epitope Signature Tag). Proteinstrukturen framställs sedan på konstgjord väg med rekombinant teknologi. Sedan användes proteinstrukturen som immunogen för att framställa antikroppar i biologiskt material (kaniner). Antikroppar renades fram genom en annan avancerad teknik som kallas affinitetsrening där PrEST: ar användes för att selektivt rena fram monospecifika polyklonala antikroppar. Antikropparna användes i immunhistokemisk färgning av vävnadsprover från olika delar av människokroppen. Antikropparna binder endast till en specifik del av ett protein. Med hjälp av en enzymatisk reaktion uppstår då en färgning som är synlig i ljusfältmikroskop vilken bekräftar proteinets lokalisation i vävnaden och cellen. Detta bidrar till det pussel som måste läggas för att få fram kunskap om hur kroppen fungerar på molekylär nivå vid friska och sjuka tillstånd (2). Människan har ca gener. Många av dem har ingen känd funktion. Gener kodar för olika proteiner som tillverkas i cellen. Proteiner utför många olika uppgifter i kroppen. Transportproteiner möjliggör transport av ämnen i blodet och cellerna. Vissa proteiner sitter på cellmembranet och förmedlar kontakten in i cellen. De kallas receptorproteiner och har förmåga att binda till ett speciellt 4

5 ämne. Strukturproteiner är de proteiner som ger struktur åt olika vävnadstyper samt ingår i cellskelettet. Kontraktila proteiner spelar stor roll vid celldelning och vid muskelsammandragningar. Enzymer är proteiner som är verksamma som katalysatorer för kemiska reaktioner. Vid olika infektioner eller förekomst av främmande ämnen försvarar kroppen sig med hjälp av försvarsproteiner. Hormoner och transkriptionsfaktorer reglerar avläsning av gener och tillväxtfaktorer och kallas därför reglerande proteiner. Det finns mer än 200 celltyper i människokroppen. Deras utseende är anpassat efter funktion. Alla celler har samma intracellulära organeller vilka kan klassificeras i två grupper: membranösa organeller som är avgränsade från cytosolen med plasmamembran och icke membranösa organeller utan plasmamembran. I eukaryota celler är cellkärnan en membranavgränsad organell som innehåller genetisk information. I kärnan finns kromatin som innehåller DNA, histoner och olika kärnproteiner. Förutom kromatinet finns nukleoler, små områden inuti kärnan, som innehåller RNA och proteiner. Nukleoler är de ställen där ribosomalt RNA syntetiseras. Membranen som avgränsar kärnan består av inre och yttre membran. Inre membranet innehåller specifika laminreceptorer och några laminaassocierade proteinreceptorer. Yttre membranet övergår till kornigt endoplasmatiskt retikulum. Endoplasmatisk retikulum (ER) är ett membranöst nätverk som hänger ihop med kärnhöljet. ER består av kornigt ER (rer) som innehåller ribosomer och glatt ER (ser) utan ribosomer. ER finns i varje cell, 5

6 men de celler som syntetiserar och utsöndrar proteiner har mer ER. Exempel på sådana celler är fibroblaster, plasmaceller, odontoblaster och osteoblaster. Celler som producerar mucin karakteriseras av välutvecklad rer, vilket ses immunohistokemiskt som starkt färgad cytoplasma. Mucinsekretoriska celler är en del av ytepitelet. De kan bli aggregerade i speciella körtlar i genitaltrakten, respiratoriska och intestinala trakten. Glatt ER är involverad i lipid- och steroidmetabolism, glykogenmetabolism, syntes av membranlipider och lagring av kalcium. Glatt ER finns därför lite rikligare i lever, adrenocorticala celler, Leydig celler i testis, samt skelettmuskelceller och glatta muskelceller. De nysyntetiserade proteiner går från ser vidare till Golgi komplexet som består av antal membransäckar. I Golgikomplexet modifieras, sorters och packas proteiner och membranlipider från ER för intra- och extracellulär transport. Golgikomplexet förekommer i större utsträckning i sekretoriska celler exempelvis plasmaceller och osteoblaster. Celler som syntetiserar stora mängder av membran och membranassocierade proteiner, exempelvis nervceller har också mer Golgikomplex (3). Mitokondrier är cylinderformade organeller som består av dubbelmembran och matrix. Dubbelmembranen är uppbyggd av yttre och inre membran samt intermembranärt utrymme. Mitokondrier har flera viktiga funktioner som cellandning, ATP syntes, citronsyracykeln och nedbrytning av fettsyror. Mitokondrier förekommer i alla celler utom i röda blodkroppar och terminala keratinocyter. Eftersom ATP syntetiseras i mitokondrier förekommer de mer i de celler som har stor behov av energi som tvärstrimmiga muskelceller. Även i de celler som är involverade i 6

7 vätske- och elektrolyttransport förekommer mitokondrier i stor utsträckning, exempelvis i proximala tubuli (4). Alla de hittills nämnda organellerna är avgränsade med plasmamembran. Det finns dessutom ickemembranösa organeller. En av dem är mikrotubuli. Mikrotubuli består av proteinet tubulin och har funktioner som att bestämma cellform, transportera organeller inom cellen, vid celldelning, rörelse av cilier och flageller. Tillsammans med aktin och intermediära filament ingår mikrotubuli i cellskelettet. Intermediära filament är flätliknande fiber som innehåller flera proteingrupper. Dessa proteiner är vävnadsspecifika med undantag av lamin. MATERIAL OCH METOD Tissue Micro Array- TMA Framställs vanligen från formalinfixerat paraffininbäddat vävnadsmaterial. Små stansar tas från ett representativt område i respektive vävnadsprov och sätts in i ett nytt mottagarblock. Upp till 300 på varandra följande snitt kan snittas från varje block och undersökas på DNA, RNA eller protein nivå (5). Den mest förekommande användningen av TMA- tekniken är vid detektion av proteinantigen med hjälp av immunohistokemi. Det finns flera fördelar med detta. En av dessa är möjligheten att analysera ett stort spektrum av olika vävnadstyper i ett och samma vävnadssnitt. TMA med normal vävnad, tumörer eller cell- linjer kan produceras för testning och optimering av förbehandlingen, antikroppsspädning och detektionssystem. Kontrollvävnad kan placeras i samma array. Detta försäkrar specificitet och sensitivitet av immunohistokemin. 7

8 Reproducerbarheten av färgningen och tillförlitligheten av tolkningen blir förbättrad när alla vävnader behandlas samtidigt och på exakt samma sätt. Det är möjligt att jämföra olika antikroppsfärgningar mot samma antigen på histologiskt identiska vävnadsregioner (6). Resultatbedömning och analys av TMA- snitt kan utföras i vanligt ljusfältsmikroskop. För framställning av respektive TMA block krävs 48 paraffininbäddade prover vilka erhöllits från en klinisk biobank. Från varje vävnadstyp valdes tre individuella prover för att erhölla en variation i ålder och om möjligt även kön. Med hjälp av ett automatiserat instrument (ATA 100, Beecher Instruments), tillverkades vävnadsarrayerna. Med hjälp av instrumentet plockades en millimeterstor stans från varje vävnadsprov och placerades 72 sådana i ett nytt paraffinblock enligt ett schema som programmerats in i förväg. Trippletter av 48 olika vävnadstyper rymdes i två nya block. Paraffinsnittning Snitten till vävnadsarrayerna erhålls med mikrotom (Microtom-cool cut, Leica). De överfördes sedan till objektglasen (Super frost Plus Menzel GmbH & Co). På varje glas fanns tre prover av varje vävnad, sammanlagt 144 stycken. Därefter inkuberades de vid 42 C över natt och avparaffinerades. Avparaffinering av glasen gjordes i xylen (HistoLab) 2 5 minuter, sedan följde rehydrering i absolut alkohol 2 5 minuter, 95 % alkohol 2 5min, 80 % alkohol 5 8

9 minuter och därefter 5 minuter i 0,3 % H 2 O % alkohol. Slutligen sköljdes glasen och placerades i en kyvett med Target Retrieval Solution-TRS, (Dako). Immunohistokemi För detektion av antigen i vävnad används antingen polyklonala eller monoklonala antikroppar. De monoklonala har högre specificitet eftersom de produceras av en plasmacells klon. Därför är de immunhistokemiskt identiska och reagerar med en specifik epitop på antigenet mot vilken de är riktade. Monoklonala antikroppar är mer användbara pga. deras höga homogenitet, frånvaron av ospecifika antikroppar, inga variationer mellan olika batcher. Polyklonala antikroppar produceras av flera celler och reagerar med olika epitoper på det antigen mot vilka de är riktade. Det finns några nackdelar med monoklonala antikroppar. De är mer beroende av ph och rätt spädning jämfört med polyklonala antikroppar. Ibland klarar de inte formalinfixering. Reaktiviteten av epitopen kan försämras efter fixeringen vilket gör att antigen retrieval krävs. Varje antigen innehåller en eller flera epitoper som består av fem eller flera aminosyror. Aminosyror är kopplade till varandra och arrangerade tredimensionellt som resultat av intermolekylär veckning. Under formalinfixeringen kan epitopstrukturen förändras. Detta resulterar i delvis eller hel förlust av immunoreaktiviteten. För att återskapa immunoreaktiviteten används flera metoder, exempelvis proteasbaserad eller värmebaserad. 9

10 Vi använde värmeinducerad antigen retrieval i fuktig miljö och närvaro av saltlösningar, i detta fall citrat buffert, ph 6. Uppvärmningen till 125 C i ca 40 minuter gjordes i tryckkokare (Biocare Medical) enligt tillverkarens instruktion. Efter värmebehandlingen kyldes glasen under rinnande vatten och placerades i tvättbuffert med tillsatts av 0,1 % Tween20 (Dako). Under tiden förbereddes instrumentet, Autostainer (DakoCytomation) som användes vid den immunhistokemiska färgningen. Det är ett automatiserat instrument med vilket det går att färga 48 objektglas samtidigt. Principen för färgningen som gjordes på snitt var följande: Vävnadssnitten inkuberades först med primära mus eller kanin antikroppar (tabell 1) i 30 minuter i rumstemperatur varefter de sköljdes i tvättbuffert. Sedan tillsattes enzymmärkt get anti mus/kanin dextran polymer, (EnVision, Dako) och efter 30 minuter inkubering i rumstemperatur sköljdes snitten åter. Polymeren var märkt med HRP (horseradish peroxidase) vars aktivitet resulterade i en olöslig produkt. Som kromogen-substrat användes diaminobenzidin (ChemMate DAB, Dako) som spädes 1:50 (kromogen: substrat). Slutligen sköljdes proverna och glasen placerades i destillerat vatten. Motfärgning gjordes i Harris hematoxylin i 6 minuter. Efter sköljning i kranvatten avlägsnades överflodig färg bort genom att glasen doppades i saltsur sprit ca 20 sekunder. Färgen oxiderades i kranvatten ca10 minuter. Slutligen dehydrerades snitten i stigande alkoholskala och xylen. Täckglas monterades med xylenbaserat monteringsmedel (Pertex). 10

11 Visualisering och utvärdering av immunhistokemiskt färgningsresultat med den utvalda antikroppspanelen gjordes i ljusfältmikroskopet (BH-2, Olympus) med objektiven X4, X10, X20 och X40. RESULTAT Resultatet redovisas i Tabell 2 och bildcollage (fig 1-4). DISKUSSION För att göra en provkarta över den intracellulära distributionen av olika proteiner användes 14 olika antikroppar vilka testades på 48 olika vävnadstyper. Antikropparna var samtliga välkarakteriserade och riktade mot proteiner uttryckta i olika cellorganeller. Syftet var att se hur detaljerat det går att studera proteiners intracellulära distribution via immunhistokemiska färgningsmönster och ljusfältmikroskop. Fibrillarin är ett protein som skall finnas i nukleoler i alla friska celler (7). Efter den immunhistokemiska färgningen kunde man se att antikroppen bundit specifikt till nukleoler i cellkärnan. Proteinet emerin ingår i alla cellers kärnmembran (8). Detta bekräftades efter att antikroppen riktad mot emerin visade ett tydlig perinukläert mönstret. De proteiner som lokaliseras till olika organeller i cytoplasman var däremot inte lika enkla att särskilja sinsemellan. Färgningsmönstret som erhöllits med antikroppar riktade mot Golgikomplexet liknade det som erhålls med antikropp riktade mot endoplasmatisk retikulum. I båda fall var det cytoplasmatisk och granulär färgning som inte gick att härleda 11

12 till respektive organell. De tre mitokondriella markörerna uppvisade samtliga färgning av cytoplasman spridda i små granula som varierade i storlek och antal beroende på celltyp. Alla de proteiner som ingår i cytoskelettet visade samma distributionsmönster. Färgningen var cytoplasmatisk och homogen, men inte på något sätt specifik för de olika cytoskeletala proteinerna. Det fanns en tendens till ihopklumpning hos alla antikropparna i denna grupp. Upplösningen i ljusmikroskop räckte inte till för att se skillnader i distributionsmönster. E- cadherin visade däremot en tydlig membranös utbredning. Detta protein ingår i plasmamembranet i alla celler av epitelialt ursprung (10). I just de celltyperna observerdes en distinkt, membranös färgning som ibland var okontinuerlig. Skillnader i intensiteten mellan de tre prover från samma vävnadstyp kunde bero på att proverna var från tre olika individer. Visserligen var det normal vävnad men man vet ingenting om medicinering och eventuella behandlingar som dessa personer har genomgått. Som tidigare nämnts, fanns det en spridning i ålder och kön mellan proverna. Också detta är faktorer som kan ha påverkat färgningsintensiteten. Att ett tydligt färgningsmönster inte alltid med säkerhet kunde särskilja kan bero på det detektionssystem som användes. Vi använde en enzymmärkt polymer, EnVision, som förstärker signalen från den bundna antikroppen (11). Det är ett system där en peroxidasmärkt dextran polymer är konjugerad med ensekundär antikropp mot kanin eller mus. Den starka signalen från varje antikropp-protein interaktion kan ha en negativ effekt på detaljrikedomen i bilden. Alternativet är att använda direkt eller indirekt immunhistokemisk färgning men detektions 12

13 känslighet är inte tillräckligt hög då. Även den ljusmikroskopupplösningen var otillräcklig för att särskilja den cytoplasmatiska utbredningen i de olika organellerna. Man vet inte tillräckligt om distributionen av dessa organeller. Den kanske är likartad och då går det inte att se några skilnader oavsett metod.j Alternativet är att använda andra verktyg med högre upplösningsförmåga exempelvis elektronmikroskop. REFERENSER (1) Agaton, C. et al. Affinity proteomics for systematic protein profiling of chromosome 21 gene products in human tissues, 2003, Molecular & Cellular Proteomics 2, (2) Uhlen M. and Pontén F. Antibody-based proteomics for human tissue profiling, 2005, Molecular and Cellular proteomics 4 (3) Michael H. Ross m.fl. Histology with Cell and Molecular Biology, 3:40, (4) Stevens Lowe, Human Histology, 3:40 (5) Olli-P. Kallioniemi, Urs Wagner et al. TMA teknology for high-throughput molecular profiling of cancer, Human Molecular Genetics, 2001, vol.10, No7, (6) Holger Moch, Juha Kononen et al. TMA-What will they bring to molecular and anatomic Pathology, 2001, Advances in Anatomic Pathology, Vol. 8, No. 1,

14 (7) Ochs RL et al. Fibrillarin: a new protein of the nucleolus identified by autoimmune sera, (1985), Biol Cell 54: ( 8) James M. Holaska, Amy K. Kowalski, Katherine L. Wilsom, Emerin caps the pointed end of actin filaments: Evidence for actin cortical network at the nuclear inner membrane, (2004) PloS Biology 2:9 (9) Bloom GS & Brashear TA, A novel 58-kDa protein associates with the Golgi apparatus and microtubules, (1989), J Biol Chem 264: (10) Marrs J. A. And Nelson W. J., Cadherin cell adhesion molecules in differentiation and embryogenesis, (1996), International Review of Cytology 165: (11) Handbook, DAKO Corporation, Immunochemical Staining Methods, (2001), 3:29-31 Figur

15 15

16 16

17 17

18 18

19 Tabell 1 ORGANELL ANTIKROPP KLON SPÄDNING F ÖR - B EHA NDLING DISTRIBUTÖR ÖVRIG INFORMATION cellkärna fibrillarin 38F3 1:35 TRS ph6 GeneTex Fibrillarin är beskrivet som ett nukleolärt protein emerin FL-254 1:2000 TRS ph6 St.Cruz Emerin är ett protein från nuklearlaminaassocierade proteinfamilj. Det förekommer i nuklearmembran i alla friska celler. Mutation på genen som kodar för emerin resulterar i sjukdomen Emery-Dreyfuss muscular dystrophy(edmd). endoplasmatisk retikulum calreticulin poly 1:300 TRS ph6 GeneTex Calreticulin är ett chaperon som har många cellulära funktioner. Det är ett kalciumbindande protein. Proteinet är viktig för reglering av genuttryck, celladhesion och autoimmunitet. Calreticulin är lokaliserad i cytoplasmatisk granula i de cytotoxiska T-celler, lymfocyter, vesikler i testis. golgi komplex golgi protein 58K-9 1:1500 TRS ph6 GeneTex Golgi protein är en bra markör för golgi komplex. Antikroppen binder till det ställe där mikrotubuli binder till den yttre, cytoplasmatiska sidan av golgi komplex. mitokondrie mitochondria mono 1:100 TRS ph6 Chemicon mitochondria MTCO2 1:500 TRS ph6 GeneTex mitokondriaantikropp används som mitokondriel markör i cell- och vävnadspreparaten.

20 prohibitin poly 1:300 TRS ph6 GeneTex Prohibitin används som mitokondriel markör. Det är ett protein som finns på inre mitokondriemembran. Proteinet visar antiproliferativt aktivitet samt spelar stor roll i reglering av normala cellcyklar, imortalisering av celler och tumör supression. I visa celltyper kan prohibitin ses även i nukleus. peroxisomer catalas poly 1:16000 TRS ph6 GeneTex Catalas är ett protein som finns mest i peroxisomer och därför används oftast som markör för peroxisomer. cytoskelett tubulin DM1A+DM1B 1:400 TRS ph6 GeneTex Tubulinantikropp är en koktel av två monoklonala antikroppar med hög specificitet för proteinet tubulin och visar ingen korsreaktion med andra cytoskelettproteiner. vimentin 3B4 1:400 TRS ph6 DakoCytomation Vimentin är ett protein från grupp III intermediära filament. Proteinet finns i olika ickeepiteliala celltyper, specielt i mesenkimala celler. Vimentin finns uttryckt i många hormonberoende cancercell-linje. desmin DE-R-11 1:50 TRS ph6 DakoCytomation Desmin tillhör grupp III intermediära filamentproteiner som är en del av cytoskelettet. Desmin bygger cytoskelettal nätverk genom muskelfibrer. I normal vävnad binder antikroppen mot desmin till skelett och glatta muskelceller i blodkärl och i intestinal området. Även glatta muskelceller i uterus samt mesoteliala celler färgas med antidesmin. När det gäller sjukvävnad binder antikroppen till rhabdomyosarcoma. aktin 1A4 1:200 TRS ph6 DakoCytomation Aktin är kroppens vanligaste protein. Antikroppen mot aktin reagerar med glatta muskelceller i blodkärl, myoepiteliala celler, visa stromaceller i intestinal trakt, testis, bröst och ovarier. 20

21 cytokeratin AE1/AE3 AE1/AE3 1:150 TRS ph6 DakoCytomation Antikroppen är avsedd för laboratoriebruk för att med hjälp av ljusmikroskopi kvalitativt identifiera två epitop som finns på majoriteten av epitelcytokeratiner i formalinfixerad paraffininbäddad vävnad. Positiva resultat används som hjälp vid klassificering av normal och neoplastisk vävnad av enkel och skiktat epitelial ursprung. Det fungerar som komplement till konventionell patologi. Positivt färgningsresultat ses i cytoplasma i cylinderepitel i cervix, kolon, matstrupe, hud, tunntarmen, buken och tonsiler. Övrig vävnad som färgas inkluderar glandulär vävnad (bröst, tyroidea, prostata och svett), distala tubuli och Bowmans kapsel, gallgång, endometrium osv. Negativt resultat erhålls från binjure, hjärta, mjälte, testis. cellmembran E-cadherin HECD1 1:500 TRS ph6 Zymed Majoriteten av celladhesionstrukturer i epiteliala celler är adherens junctions. Dessa strukturer är uppbyggda mest av två adheresionmolekyler, E-cadherin och nectin. Celladhesionsmolekyler är viktiga för celltillväxt och celldifferentiering. Förutom det cadheriner är involverade i aktivering av cellsignalering, reglering av cytoskelett och kontrol av cellpolariteten. Uttryck av E-cadherin korrelerar med rörlighet och invasivitet av tumörceller. Vävnadsspecificiteten av olika cadheriner är bra markör för identifiering och differentiering i diagnostik av olika typer av cancer 21

22 Tabell 2 ANTIKROPP VÄVNADSDISTRIBUTION INTRACELLULÄR DISTRIBUTION Fibrillarin glatt muskel cerebral cortex tonsil hud duodenum lever pankreas bronkie njure binjure testis prostata endometrium äggledare Fibrillarin förekommer som små fina korn i cellkärnan. Intensiteten varierare från sparsamt till ymnigt. Bild 1 visar hud, bild 2 är njure. Emerin Färgningsmönstret är perinukleärt, intensivt och homogent. Bild 1 visar hud, bild 2 visar njure. Calreticulin Golgi protein Den intracellulära distributionen är cytoplasmatisk med fin, grynig, homogen färgning som varierar i intensitet från cell till cell. Bild 1 visar binjure och bild 2 är från glatt muskel. Golgiproteinet ger en cytoplasmatisk, kornig färgning som är något heterogen, ibland perinukleär. Bild 1 visar pankreas, bild 2 visar äggledare. Mitochondria (Chemicon) Bred spridning i olika vävnader. Homogen, cytoplasmatisk färgning med kornigt mönster. Bild 1 visar kraftig färgning i sekretoriska celler i duodenum, bild 2 visar binjurevävnad. 22

23 Mitochondria (GeneTex) Bred vävnadsdistribution med olika intensitet beroende på energibehov. Det intracellulära distributionsmönstret är cytoplasmatiskt, finkornigt, något heterogent. Bild 1 visar hjärtmuskel, bild 2 pankreas med sekretoriska celler som innehåller många mitokondrier. Prohibitin Katalas Prohibitin som mitokondriel markör ger ett grynigt, homogent, cytoplasmatiskt färgningsmönster. Intensiteten på färgningen beror på typen av cellen. Celler med större energibehov som de i njurtubuli eller i muskler har kraftigare uttryck. Bild 1 visar njure, bild 2 hjärtmuskel. Katalas är ett peroxisomspecifikt protein. Det uttrycks homogent, cytoplasmatiskt, fint till grovkornigt framförallt i lever och njure pga detoxiska processer. Bild 1 visar lever, bild 2 visar njure. Tubulin Vimentin Proteinet förekommer i alla celltyper utom i röda blodkroppar. Uttrycksmönstret är homogent, cytoplasmatiskt men heterogent i olika celltyper. Intensiteten varierar. Bild 1 visar tuba med cilier där tubulinet uttrycks rikligt. Bild 2 visar hud där man kan se heterogenitet i olika celltyper. Intensiv och homogen, cytoplasmatisk färgning. När det gäller granulering är det svårt att karakterisera med namn. Det finns tendens till ihopklumpning. Bild 1 visar duodenum, bild 2 visar cerebral cortex. 23

24 Desmin Desmin tillhör gruppen intermediära filamentetsproteiner. Finns i alla typer av muskelceller, myofibroblaster, blodkärl, celler av mesotelial ursprung osv. Proteinet uttrycks kraftigt och homogent cytoplasmatiskt. Bild 1 visar glattmuskel, bild 2 visar endometrium med desminuttryck. Aktin Som ett av kroppens vanligaste proteiner finns aktin i alla vävnader. Proteinet ingår i cellskelettet. Den intracellulära distributionen är homogen, kraftig, cytoplasmatisk. Bild 1 visar cerebral cortex med blodkärl och bild 2 visar vävnad från testis. Cytokeratin AE1/AE Det är ett protein som ingår i epitelcellernas cytoskelett. Den intracellulära färgningen är kraftig, homogen och cytoplasmatisk. Bild 1 visar njure med olika färgningsintensitet i de proximala respektive distala tubuli. Bild 2 visar epiteliala celler i tuba. E-cadherin Proteinet ingår i plasmamembranet i alla celler av epitelialt ursprung. Färgningsmönstret är membranöst, ibland okontinuerligt som exempelvis i hepatocyter vilket visas i bild 1. Bild 2 visar membranös färgning i hudens epitelceller. 24