Molekylärbiologi 7.5 ECTS Ladokkod: TK151C Tentamen ges för: Bt3 Namn: Person nummer: Tentamensdatum: 17/12 2012 Tid: 09:00-13:00 Hjälpmedel Tillåtna hjälpmedel är lexikon. Dock EJ elektroniskt lexikon Totalantal poäng på examen: 76 poäng För att få respektive betyg krävs: Betyg 3: 38 poäng; Betyg 4: 50 poäng; Betyg 5: 61 poäng Allmänna anvisningar : Frågorna 6-10 besvaras på separata papper Rättningstiden är som längst tre veckor Viktigt! Glöm inte att skriva namn på alla blad du lämnar in. Lycka till! Ansvarig lärare: Elisabeth Feuk-Lagerstedt Telefonnummer: 0704-444188
Flervalsfrågor: Varje rätt svar ger 2 poäng Fråga 1 Vilket av följande alternativ är korrekt? a) Genomet hos fagen M13 är dubbelsträngat och cirkulärt b) Genomet hos fagen M13 är enkelsträngat och cirkulärt c) Genomet hos fagen M13 är dubbelsträngat och linjärt d) Genomet hos fagen M13 är enkelsträngat och linjärt Fråga 2 Mängden adenine i DNA är alltid samma som mängden a) Cytosin b) Uracil c) Guanin d) Thymin Fråga 3 Vilket av följande används inte i en PCR körning? a) Taq polymeras b) Restriktionsenzymer c) Oligonukleotid primers d) Deoxynukleosid trifosfater e) Samtliga ovanstående används Fråga 4 Ett genomiskt bibliotek: a) Är ett register av mrna molekyler från en celltyp i en organism b) Är en samling proteiner från en organism c) Är en samling DNA molekyler från en organism d) Är en samling lipider från en organism Fråga 5 Vilket/vilka av följande är inte en vektor? a) YEp b) MCS c) BAC d) YAC e) Samtliga ovanstående är vektorer
Besvara varje fråga (gäller 6-10) på ett nytt papper! Bakgrundsinformation för frågorna 6, 7, 8, 9, 10: Cellulaser används i rengöringsmedel, inom pappersindustrin, i djurfoder och t.o.m. inom livsmedelsindustrin. En industriell katalysator måste vara värmetålig, men tyvärr är aktiviteten hos dessa enzymer känslig för just värme. Därför vill du försöka göra en värmetålig cellulas genom att använda dig av den 1867 bp långa genen celi15 som kodar för enzymet endo-β-1,4 glukanas och finns naturligt i Bacillus subtilis. För att producera ditt rekombinanta extracellulära enzym med en molekylvikt på 52 kda sätter du in genen i vektorn pmd18-t och transformerar E. coli stammen BL21. Restriktionsenzymer och deras igenkänningssekvenser HindIII: A ^ AGCTT BamH1: G ^ GATCC SphI: GCATG^C HincII: GTY^RAC ACC I: GT^MKAC SalI: G^TCGAC EcoRV: GAT^ATC XbaI: T^CTAGA ^ Indikerar restriktionsställe Y = T or C; R = A or G; M = A or C; K = G or T SmaI: CCC^GGG XmaI: CCC^GGG KpnI: GGTAC^C SacI: GAGCT^C EcoRI:G^AATTC
Fråga 6 Du vill rena DNA från B. subtilis för att kunna klona genen celi15. Du har hört att det är svårt att isolera DNA från G + organismer så som B. subtilis och att du först bör göra cellerna till protoplaster (Protoplaster är celler där cellväggen helt tagits bort). Du har inget sådant protokoll i labbet men bestämmer dig för att försöka med ett protokoll, där cellerna omvandlas till sfäroplaster istället. Beskriv stegen i framrening av DNA och ange syftet med varje steg. (10 p) Fråga 7 Innan du klonar genen celi15vill du först få många kopior av den. Därför designar du nedanstående primers med inbyggda restriktionsställen och med ett T m på 59 o C: Forward primer: 5 AACCAAGCTTCATATGAAACGGTCAATCTCATTTTTATTACGT3 Reverse primer: 5 AAGAATTCTCTACTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAATCT3 a) Vilket/vilka restriktionsenzym i polylinkern har du bestämt dig för att använda i ditt försök och hur klipper de (sticky eller blunt)? Motivera ditt svar! (6p) b) Hur designer du amplifieringsprotokollet för att lyckas med att få många kopior? (9 p) c) Hur åskådliggör du produkten i PCR-röret efter avslutad amplifieringsprocess? (4p) Fråga 8 Efter amplifieringen så vill du skapa rekombinanta molekyler och göra en transformation. a) Beskriv hu du skapar dessa rekombinanta molekyler i ditt försök. (6p) b) Vilken är din värdcell i transformationen och vilka egenskaper måste den ha? Motivera ditt svar! (6p) c) Förklara selektionsprocessen, som du använder dig av, för att hitta värdceller med rekombinanta molekyler? (8p) Fråga 9 För att kontrollera att dina utvalda värdceller kan producera endo-β-1,4 glukanas så vill du dessutom göra en s.k. direkt selektion och låta dem växa på an agarplatta med Avicel (en mikrokristallin cellulosa). I bilden nedan kan du se två zoner med kolonier, zon A och zon N. Förklara vilka kolonier som har rekombinanta molekyler och motivera ditt svar! (5p)
Fråga 10 Du funderar på att använda vektorn pmd18-t som en expressionsvektor. a) Är det möjligt att använda denna vektor för att producera stora mängder av proteinet i E. coli? Motivera ditt svar! (6p) b) Är det möjligt att använda denna vektor för att producera stora mängder av proteinet i jäst? Motivera ditt svar! (6p)