RAPD-PCR för storskalig typning av Bacillus cereus

Rapport nr 4988 2000-12-15 RAPD-PCR för storskalig typning av Bacillus cereus En metod att skilja olika stammar åt med genetiska fingeravtryck Birgitta Svensson, Kerstin Ekelund, Anders Christiansson, Bodil Andersson och Jörgen Nilsson Svensk Mjölk Forskning Telefon 0771-191900. E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se

RAPD-PCR för storskalig typning av Bacillus cereus En metod att skilja olika stammar åt med genetiska fingeravtryck Birgitta Svensson, Kerstin Ekelund, Anders Christiansson, Bodil Andersson och Jörgen Nilsson SAMMANFATTNING Bacillus cereus är en Gram-positiv, sporbildande bakterie som är vanligt förekommande i naturen. Sporerna är värmeresistenta och överlever lågpastörisering på mejeriet och vissa stammar kan sedan tillväxa i den kyllagrade mjölken. Detta gör att B. cereus är en viktig hållbarhets begränsande faktor för lågpastöriserad, kyllagrad mjölk. Den viktigaste kontamineringsvägen för mjölk med B. cereus är nedsmutsning av kornas spenar med jord under betesgång. Sporerna som finns i jorden fastnar på spenarna och hamnar i mjölken vid mjölkning. Sporerna följer sedan med mjölken till mejeriet. Mjölken kan även kontamineras ytterligare av B. cereus på mejeriet om denna bakterie har lyckats etablera sig inne i mejeriet. Denna typ av kontaminationskällor är mycket svåra att hitta efter som det ofta rör sig om relativt låga halter och att kontaminationen inte är jämn över dagen. Det är även svårt att skilja mellan kontamination i mjölkråvaran och kontamination på mejeriet. Enbart spridningssiffror ger inte den upplösning som krävs för att hitta eventuella kontaminationskällor på mejeriet utan det krävs en metod som kan skilja bakterierna åt på stamnivå. På Svensk Mjölk Forskning i Lund har vi utarbetat en RAPD-PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA Polymerase Chain Reaction) för att kunna skilja olika B. cereus isolat åt. Metoden är i stort sett nere på stamnivå. RAPD är baserat på PCR där DNA uppförökas utanför cellen. Vad som skiljer RAPD från vanlig PCR är att den primer (startsekvens) man använder inte är specifik för en särskild gen. Man använder istället en kort primer (9-10 nukleotider lång) som ska binda in till sekvenser som är slumpvis fördelade över hela DNA:t. Detta ger upphov till ett antal DNA-fragment som avspeglar var primern bundit in. När DNA-fragmenten separeras på en agaros gel får man ett bandmönster (genetiskt fingeravtryck) som är unikt för den stam man analyserat. På detta vis kan man skilja olika stammar åt. I denna rapport beskriver vi en RAPD-metod för B. cereus i detalj, hur vi gör och vilken utrustning vi använder. I diskussionen tar vi upp en del om utvecklingen av metoden och det finns även ett avsnitt som handlar om fel och misstag som kan uppstå vid användning av denna metod. METODBESKRIVNING Preparering av DNA som templat för PCR B. cereus renodlas genom stryk på TGA-plattor. Med en 1 µl platinös skrapas B. cereus av från plattan och sätts till 1 ml sterilt destillerat vatten i ett eppendorfrör med snäpplock (Bergman & Beving 0030 120 086). Röret skakas så att cellerna slammas upp ordentligt och centrifugeras sedan vid 12000 g i 3-5 minuter (Eppendorf Centrifuge 5410). Efter centrifugeringen hälls vattnet av och cellerna slammas upp i 100 µl sterilt vatten och några korn aktivt kol (KEBO Art. nr. 1.7276 1 kg, mortlas före användning) tillsättes. Därefter fryses rören vid 70 C i minst 1 timme. 2

Bacillus mycoides (B. cereus var. mycoides) går inte att skrapa från platta utan måste odlas upp i TG-buljong. Från en renodlad B. mycoides-kultur på platta ympas till 10 ml TG-buljong i 100 ml flaska. Flaskan sätts på skak vid 150 varv per minut vid 30 C över natten. En ml av kulturen överförs till ett eppendorfrör med snäpplock och centrifugeras 3-5 minuter vid 12000 g. Cellerna slammas därefter i 1 ml sterilt destillerat vatten och behandlas som B. cereus (se ovan). Efter frysning vid 70 C kokas rören i vattenbad i exakt 10 minuter. Detta sker utan föregående tining. Särskilda lockhållare (KEBO, Art. nr. 104.640-15) måste sättas på eppendorfrören för att de inte ska öppna sig under kokningen. Efter kokning sätts rören på isbad. Cellerna har nu gått sönder och DNA:t finns i lösningen. Cellresterna centrifugeras ner vid 12000 g i 3-5 minuter. Supernatanten är färdig att användas för RAPD-PCR. Det går att frysa proven för att använda dem senare. Man bör då centrifugera dem igen för att vara säker på att inte få med cellrester. Färska DNA-preparationer ger dock oftast bäst resultat. RAPD-PCR mix I RAPD-PCR mixen ingår DNA, som utgör mallen för det nya DNA som ska bildas under PCR-reaktionen; deoxynukleotider, byggstenarna till det nya DNA:t; Taq-polymeras, enzymet som bygger det nya DNA:t; Mg 2+, som behövs för att Taq-polymeraset ska fungera; primer, en kort DNA-bit som bestämmer var enzymet ska börja bygga nytt DNA samt buffert för att hålla rätt ph och saltkoncentration. PCR-mix blandas i sterilt eppendorfrör (Sarstedt 72 692 005). PCR-mixen blandas av 35µl sterilt milliq vatten, 5µl buffert (GeneAmp 10xPCR-buffert: 100mM Tris-HCl, ph 8.3, 500mM KCl, 15 mm MgCl 2, 0.01% (w/v) gelatin, autoklaverad; Perkin Elmer, USA), 1µl av varje deoxynukleotid (10 mm ; datp, dctp, dgtp, dttp; Perkin Elmer, USA), 3µl MgCl 2 (25 mm, egen tillverkning, sterilfiltrerad), 1µl primer (200 µm; 5 -CCGAGTCCA-3 ; Cybergene, Huddinge, Sverige), 0.5µl enzym (AmpliTaq DNA-polymeras 5u/µl, Perkin Elmer, USA). PCR-mix till flera prov kan blandas i ett och samma rör (se Tabell 1). Till varje PCR-rör sätts sedan 48 µl PCR-mix och 1-2 µl DNA-preparation. Det är viktigt att ha med ett negativt kontrollrör där inget DNA sätts till, så att man kan se att man inte kontaminerat sina lösningar med DNA. Det är även bra att ha med en positiv kontroll, t.ex. DNA från en stam som man har använt tidigare för RAPD-PCR. Tabell 1. PCR-mix för olika antal PCR-rör. Till varje enskilt PCR-rör sättes 48µl PCR-mix och 1-2 µl DNA-preparation. Det är viktigt att alla lösningar hålls kalla under blandningen. 5 rör 10 rör 15 rör 17 rör 20 rör 22 rör 25 rör 32 rör µl µl µl µl µl µl µl µl Sterilt MilliQH 2 O 172,5 345 517 587 690 759 862 1104 Buffert (10x) 25 50 75 85 100 110 125 160 dntp:s (10mM) 4x5 4x10 4x15 4x17 4x20 4x22 4x25 4x32 MgCl(25 mm) 15 30 45 51 60 66 75 96 Primer(s) (200µM) 5 10 15 17 20 22 25 32 Taq polmeras(5u/µl) 2,5 5 7,5 8,5 10 11 12,5 16 Den slutliga koncentrationen i PCR-röret blir: 10 mm Tris-HCl, ph 8.3; 50 mm KCl; 3 mm (1.5+1.5) MgCl 2 ; 0.2 mm av varje deoxynukleotid; 4µM primer; 2.5 units Taq DNApolymeras. DNA-koncentrationen kan variera beroende på hur mycket bakterier man gjort preparationen från. DNA från ca 10 5-5x10 6 bakterier ger reproducerbara resultat. För att PCR-reaktionen ska gå bra är det viktigt att behandla alla reagensen på ett korrekt sätt. Det är även viktigt att göra exakt likadant varje gång om resultaten ska bli 3

jämförbara. MilliQ-vattnet bör förvaras i kyl vid 4 C. Buffert, nukleotider, MgCl 2, primer och enzym förvaras vid 20 C. Buffert, nukleotider, primer och MgCl 2 tinas i rumstemperatur och sätts i 4 C kylblock före användning. Enzymet förvaras i buffert med glycerol och är därför inte fruset. Enzymlösningen får inte värmas upp utan tages ut från frysen precis före tillsats. Vid pipettering av enzym måste man observera noga att man inte får med luftbubblor. Detta är lätt hänt eftersom glycerolen gör lösningen trögflytande. För pipettering av PCR-reagensen ska alltid sterila spetsar med filter (Eppendorf 0030 067.010) användas, för att undvika kontamination från pipetten. Den färdigblandade PCR-mixen hålls vid 4 C och fördelas på PCR-rören (rörstorlek beror på vilken PCR-apparat som används). Varje PCR-rör ska innehålla 48µl PCR-mix och 1-2 µl DNA-preparation. TC1 (gamla termocyklern) I DNA Thermal Cycler TC1 (Perkin Elmer, USA) används 0.5 ml PCR-rör (Eppendorf 0030 121.023). Rören märks på locket. Efter tillsats av PCR-mix och DNA så tillsätts 2 droppar mineralolja. Detta görs för att vätskan i röret inte ska avdunsta under PCR-reaktionen. Rören centrifugeras 10 sekunder vid 12000 g för att få all vätska ner i botten på röret. Rören sätts i PCR-apparaten och startas enligt beskrivning nedan. 9700 (nya termocyklern) I GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer, USA) används 0.2 ml rör (Perkin Elmer N801-0540). Här krävs ingen olja eftersom denna PCR-apparat har värmning även i locket och detta förhindrar avdunstning. Det är mycket viktigt att rören är ordentligt stängda annars finns risk för avdunstning trots värme i locket. Dessa små rör behöver inte heller centrifugeras för att få ner vätskan i bottnen. Rören sätts i en särskild platta och eftersom det inte går att märka rören på locket är det viktigt att anteckna var i plattan de olika rören står. Sätt plattan i PCRapparaten, stäng locket ordentligt och starta enligt beskrivning nedan. PCR-reaktionen I termocyklern sker själva PCR-reaktionen. Den består av tre faser, denaturering, annealing och elongering. Under denatureringen, som sker vid 94-95 C, bryts vätebindningarna mellan DNA:ts två strängar och man får enkelstränat DNA. Därefter sänks temperaturen och primern kan binda in till det enkelsträngade DNA:t. Detta kallas för annealing. Vilken temperatur man ska ha här avgörs av vilken primer man använder. När primern bundit in höjs temperaturen till 72 C och Taq-polymeraset börjar bygga nytt DNA. Detta kallas för elongering. De tre faserna upprepas ett antal gånger för att få så mycket nybildat DNA att man kan detektera det med t. ex. gelelektrofores. Efter amplifieringen av DNA:t bör man inte använda samma arbetsutrymme som används för att blanda till PCR-mixen och man bör även använda andra pipetter än de som används för att blanda PCR-mixen för att minska risken att kontaminera arbetsytor och pipetter med stora mängder DNA. TC1 (gamla termocyklern) TC1 termocyklern startas med huvudströmbrytaren. Kontrollera att rätt user är angiven (ex #188). Ange filnamn vid FILE (ex 10) tryck därefter på ENTER och sedan på START. Det program som ligger inlagt i den angivna filen kommer att starta (ex 10 se Figur 1). Programmet i Figur 1 tar ca 3.5 timmar att köra på denna termocykler. För att avsluta tryck STOPP, en uppmaning om att trycka STOPP en gång till kommer upp. Stäng därefter av apparaten på huvudströmbrytaren. Tag ut PCR-rören. Efter PCR-reaktionen tas 40µl lösning från 0.5 ml rören till ett nytt rör, som innehåller 5 µl loading buffer (25% Ficoll, 0.25% Bromfenolblått, 0.25% Orange G). Det är viktigt att inte 4

få med någon olja. Centrifugera i 10 sekunder för att få all vätska i botten och sätt sedan på gel eller förvara i frys vid 20 C. File 10 Delay time 3:00 min (time delay) Delay temp. 94 C Link to file 11 File 11 Seg 1 94 C) (step cycle) Time 0:45 min Seg 2 30 C Time 2:00 min Seg 3 72 C Time 1:00 min Cycle count 4 Link to file 12 File 12 Seg1 94 C (step cycle) Time 0:45 min. Seg 2 36 C Time 1:00 min Seg 3 72 C Time 2:00 min. Cycle count 26 Link to file 13 File 13 Delay time 10:00 min (time delay) Delay temp 75 C Link to file 14 File 14 Soak temp 4 C (soak file) Figur 1. Temperaturprofil för RAPD-PCR på Bacillus cereus på TC1 (gamla termocyklern) 9700 (nya termocyklern) Termocyklern 9700 startas med huvudströmbrytaren. Kontrollera att rätt user är angiven (ex kerstin). Tryck på F1 (=RUN). Ange vilket program som ska köras genom att flytta ner eller upp med piltangenterna (ex BC Figur 2). Tryck F1 (=START), uppmanas att trycka F1 (=START) ytterligare en gång. Programmet startas. Programmet i Figur 2 tar ca 2 timmar att köra på denna termocykler. För att avsluta program tryck STOPP. En uppmaning om att trycka STOPP ytterligare en gång kommer upp. Tryck därefter på F5 (=EXIT). Stäng av apparaten på huvudströmbrytaren. Öppna locket och tag ut PCR-rören. Till 0.2 ml rören sätts 5 µl loading buffer direkt. Använd ny pipettspets till varje rör. Skaka så att färgen kommer ner i vätskan. Sätt på gel eller förvara vid 20 C tills de ska användas för gelelektrofores. 5

1 Hld 3 Tmp 4 Cycles 3 Tmp 26 Cycles 1 Hld 1 Hld 94.0 3:00 94.0 0:45 30.0 2:00 72.0 1:00 94.0 0:45 36.0 1:00 72.0 2:00 * 75.0 10:00 4.0 Figur 2. Temperaturprofil för RAPD-PCR på Bacillus cereus på 9700 (nya termocyklern) Gelelektrofores För att analysera det nybildade DNA:t kan man använda sig av gelelektrofores. Man gjuter en gel av agaros och låter elektrisk ström passera igenom. DNA är negativt laddat och kommer att vandra mot den positiva polen. Man får då en separation av DNA-molekylerna med avseende på storlek. De kortaste vandrar snabbare i gelen. På detta sätt får man ett bandmönster av DNA i olika storlekar. För att kunna se DNA:t i agarosgelen måste man tillsätta etidiumbromid. Etidiumbromiden lägger sig mellan de två strängarna i DNA:t och gör att DNA:t flouroscerar när det belyses med UV-ljus. Eftersom etidiumbromid kan lägga sig mellan strängarna på DNA:t kan det göra att DNA-strängarna bryts av. Om detta sker i en levande cell kan den dö eller utvecklas till en cancercell. Etidiumbromid ska därför behandlas med största försiktighet. För gelelektrofores används Pharmacia Biotech Maxiphor elektroforesutrustning för horisontella agaros geler. Till dessa kärl är det lagom med en gel på 100 ml. För gjutning av gel till gelelektrofores vägs 1.8 g agaros (Agaros NA 17-0554-02, Pharmacia Biotech AB) upp i en 250 ml E-kolv och 100 ml 1xTBE-buffert (88 mm Tris, 89 mm Borsyra, 2 mm EDTA) tillsättes. Blandningen kokas i vattenbad i 20 minuter och tempereras sedan ca 10 minuter i 60 C vattenbad. Två droppar (ca 80 µl) etidiumbromid (0.625 mg/ml, Kebo) tillsättes, vilket ger en etidiumbromid-koncentration på ca 0.5 µg/ml. Innehållet blandas om försiktigt för att undvika luftbubblor. Kolven får stå ytterligare några minuter i 60 C. Observera att etidiumbromid är ett gift och ska behandlas försiktigt. Gelen gjuts i en form med storlek 20 x 14.5 cm (Pharmacia Biotech). Kanterna på formen tejpas med maskeringstejp och läggs i ett gjutkärl. Bordsytan där gelen ska gjutas måste stå så horisontellt som möjligt för att få gelen jämn. Den tempererade gelen hälls försiktigt i formen. Det är viktigt att undvika bildning av luftbubblor. Skulle luftbubblor bildas kan dessa skjutas åt sidan med en plastinös eller brännas bort med en tändsticka. Till gjutformen finns en kam med 15 brunnar. Kammen sätts 1-1.5 cm från ena kanten av gelen. Gelen får stelna ca 45 minuter i rumstemperatur. Gelelektroforesen körs i ett elektroforeskärl (Pharmacia Biotech HE 99x Max Submarine units). Formen med gelen läggs på plattan i elektroforeskärlet och 1xTBE-buffert, med tillsats av 100 µl/l av en 5 mg/ml etidiumbromidlösning, hälls på så att vätskan står några millimeter över gelen. I brunn 1, 8 och 15 läggs 18 µl av en storleksmarkör (100 bp-ladder, Pharmacia Art. nr. 27-4001-01), vilket motsvarar 0.9 µg DNA, i resterande brunnar läggs 18 µl prov. Locket sätts på. Observera att locket ligger åt rätt håll så att inte elektroforesen går baklänges. Koppla till strömkälla (Pharmacia Biotech EPS 300). Sätt spänningen till 100 V. Detta ger en ström 6

på 400 mamp. Låt elektroforesen gå så att färgbandet hunnit 12.5 cm från brunnarna (ca 3.5 timmar). Bryt strömmen och tag upp gelen. Lägg gelen utan form på UV-bord (LKB 2011 Macrove Transilluminator, λ 302 nm). Torka noga bort all vätska. Om gelen ser fin ut dokumenteras resultatet genom fotografering. Fotografering Fotografering görs med polaroidkamera (Polapan, polaroidfilm 665 PN) med försättslins på +2 dioptrier och Kodak Wratten gelatinfilter No 22, 75x75 mm (CAT 149 5571). Exponera i 45 sekunder med bländare 11. Polaroidfotot framkallas i 30 sekunder. Fotot fixeras med fixeringslösning som medföljer polaroidfilmen. Negativet sköljs noga med kranvatten och avjonat vatten och får sedan torka innan det används för analys av RAPD-PCR resultatet. Figur 3 visar ett exempel på hur ett negativ av en gel kan se ut. Figur 3. Exempel på hur ett negativ av en agarosgel kan se ut. Spår 1, 7 och 12 innehåller storleksmarkörer. Spår 11 är den negativa kontrollen (utan DNA). Övriga spår är genetiska fingeravtryck från Bacillus cereus isolerade från silomjölk på ett mejeri. Analys med GelCompar 4.1 (Applied Maths, Belgien) Scanning av negativ För att kunna jämföra de genetiska fingeravtrycken med varandra med hjälp av ett datorprogram behöver man överföra dem till elektronisk form. Man kan då använda sig av en scanner som skapar en rastrerad bild av gelfotot. GelCompar känner igen PC TIFF-filer (Tagged Image File Format) och dessa kan skapas med en flatbed scanner. Digital kamera kan användas istället för scanner för att överföra gel-informationen till datorn. Negativet scannas in med en flatbed scanner (HPScanJet, Hewlett Packard, USA). Starta datorn. Öppna programmet HP PrecisionScanPro. Starta transparency-adaptorn genom att klicka på Tools:Transparency adaptor. Välj svart/vitt genom att klicka på Output type:grayscale. Lägg i den svarta ramen anpassad för transparency-adaptorn. Torka av eventuellt damm på negativet som ska scannas, med antistatisk duk. Lyft på locket och lägg in negativet av gelbilden så att den matta sidan är vänd uppåt och brunnarna ligger kant i kant med övre sidan av ramen. Om negativet buktar sig kan det läggas i en plastficka avsedd för OH-bilder. Klicka på Scan:preview. 7

Markera den del av negativet som ska scannas genom att trycka in vänster musknapp och dra så att en ram bildas. Justera ramen genom att med vänster musknapp dra i sidorna på ramen. Övre sidan på ramen bör vara 1 cm ovanför nederkanten av det svarta fältet och nedre ramen strax nedanför det längst gångna bandet. Klicka eventuellt på Scan:zoom för att finjustera ramen. Klicka på Scan:Save As, bilden scannas in. Spara på H:\GCW40\ user \GELS.IMA. Tryck OK. Ta ut bilden och lägg eventuellt in en ny om fler bilder ska scannas direkt, tryck sedan på Scan:Preview. Eller, stäng ner programmet. Innan programmet stängs släck lampan i transparency adaptorn genom att klicka på Tools:Transparancy adaptor. Konvertering av in scannat foto till densitometriska kurvor GelCompar använder sig av en-dimentionella densitometriska kurvor av bandmönstren för att jämföra de olika fingeravtrycken. Den rastrerade bilden som skapades med hjälp av scanner måste därför översättas till en densitometrisk kurva. Detta görs i programmet Convert i GelCompar. Öppna Gel Compar 4.1. Välj user ur listan i mitten (ex. Bodil). Klicka på Convert. Tryck på file: load image. Välj en fil ur GELS IMA. Om bilden kommer upp som positiv, välj Edit:Negativise. Justera den gröna rektangeln m.h.a. Limits: whole image eller manuellt m.h.a. musen om gelen är väldigt ojämn. För musen till den kant du vill ändra på och håll ner vänster musknapp när du förflyttar linjen. Övre linjen ska rama in ca. 1 cm av det svarta fältet och den nedre linjen strax nedanför det sista markörbandet. Om markörerna har gått olika långt på en gel, trycker du på SHIFT och vänster musknapp och böjer av linjen så att avståndet från sista bandet till linjen blir lika stort längs hela nederkanten. Tryck på Edit: optimize image. Tryck på Track: auto search, spåren markeras med svart (spåret för scanning) och blått (spåret för gelstripset som sparas efter convert-programmet) Om du vill ta bort några gelspår, markera med musen på noden till det spåret och välj Track: remove. Om det ligger något oönskat skräp inom de svarta linjerna kan du flytta hela markeringen litet genom att hålla ner vänster musknapp på dess nod och dra i sidled. Tryck på Scan. En lista kommer upp över markerade spår. Flytta gelbilden åt sidan så att listan bli synlig. Stäng inte gelbilden, gelstripsen kommer då inte att sparas. Markera Reference-rutan och de spår som utgör referens. Tryck ENTER. Avmarkera reference-rutan. Namnge spåren med önskad information i Genus, Species, Subspecies o.s.v. (valfri information kan läggas in här). Markera spåret och tryck ENTER. Vid fel, rätta till informationen och tryck ENTER igen. Spara informationen genom att klicka på File:save gel H:\GCW40\ user \GELS.RAW. Konvertera fler filer eller stäng programmet. Normalisering av densitometriska kurvor mot en databasstandard För att kunna jämföra de genetiska fingeravtrycken från olika geler med varandra måste de ha vandrat exakt lika långt vid gelelektroforesen. Detta är omöjligt att uppnå även om man är mycket noga med tiden. Man måste därför med datorns hjälp manipulera fingeravtrycken så att de ser ut att ha vandrat lika lågt. På varje gel körs tre storleksmarkörer. I datorn har en sådan markör lagts in som databasstandard. Alla gelernas storleksmarkörer jämförs med databasstandarden och GelCompar räknar sedan ut hur långt de andra spåren på gelen ska ha vandrat för att stämma med databasstandarden. På detta sätt ser det ut som om alla gelspår vandrat lika långt vid elektroforesen. Detta kallas för normalisering. Öppna programmet Normalize. Tryck på file:load. Välj fil ur GELS RAW. Gelstripsen kommer upp med databasstandarden längst till vänster. Gå in i associate och se så att selection: reference patterns only är markerad. 8

Sätt den blå pilen på nedersta bandet (band 1) i databasstandarden. Tryck ned shift+ctrl och klicka på motsvarande band i referensen med höger musknapp. Upprepa samma sak med band 8 och 16 i databasstandarden. Upprepa för övriga referensspår. Tryck på Alignment: Align associated peaks. Klicka på associate: By pattern recognition. Tryck på Alignment: Align associated peaks. För att kontrollera att normaliseringen är acceptabel, klicka på en referens och gå in i Alignment: Normalization curve. Avvikelsen från mittlinjen ska vara jämn inom korrelations-intervallet och inte ha några vassa knyckar. Procentsatsen i övre högra hörnet visar elektroforesens reproducerbarhet och ej kvaliteten på normaliseringen. Gör likadant för övriga referenser. Om normaliseringen inte blev bra börja om genom att trycka Alignment: Initialize. När normaliseringen ser bra ut spara på File: save. Sparas i GELS.INT. Ladda nästa gel eller stäng ner programmet. Klusteranalys av RAPD-PCR resultaten För att jämföra många genetiska fingeravtryck med varandra används klusteranalys. En klusteranalys sker i två steg. Först görs en parvis jämförelse av de fingeravtryck man valt att analysera. Från denna jämförelse skapas sedan ett släkträd, dendrogram, där de fingeravtryck som är mest lika varandra hamnar i samma gren, kluster, av dendrogrammet. Det finns många olika sätt att göra den parvisa jämförelsen. Vi har valt Pearson korrelations koefficient, eftersom man med denna metod jämför hela den densitometriska kurvan utan att definiera band. Detta är en något mer objektiv metod än när man går in och definierar band och lämplig att använda när man ska jämföra RAPD-PCR fingeravtryck där det kan vara svårt att avgöra vad som är ett band på gelen. Även dendrogram kan skapas med flera olika metoder. Vi har valt att använda Wards metod. För att göra klusteranalysen öppna Analyze. Gå in i System och kontrollera att Extended menus är öppnat (det ser man om det står Short menus i listan). Först måste man välja ut vilka genetiska fingeravtryck man vill analysera och lägga dessa på en lista. Dubbelklicka på önskad GELS.INT-fil. En förteckning över spåren kommer upp. Markera önskat spår och tryck på höger musknapp så att en röd pil visas till vänster i fönstret. Spåret kommer upp på en lista till höger (för att ta bort ett spår, tryck åter på höger musknapp). Stäng ner fönstret över spåren och öppna ev. en ny fil för att plocka ut fler spår. Gå in i Edit: zones och markera den zon på gelspåren som ska analyseras, från ca. 69 upp till ca. 390 (motsvarar 100-1400 bp) genom att flytta markören till gränserna, håll ner höger musknapp och dra musen till kanten så att det fält som ej ska vara med gråmarkeras. För att aktivera en zon igen, tryck då ned vänster musknapp och dra ut åt kanterna. Alla spåren på listan analyseras nu inom den valda aktiva zonen. Klicka på Exit. Spara listan i List: Save as och ge den ett lämpligt namn. Listnamnet kommer nu upp i rutan nere till vänster. Välj den information som ska synas på dendrogrammet, genom att trycka på F9 (välj gärna både gelnamn och spårnamn). Egna kombinationer av information som ska visas på dendrogrammet kan göras och sparas. För att göra själva klusteranalysen gå in i Comparison: Clustering (correlation) och välj Ward och Fine alignment. Tryck OK. Dendrogrammet kommer upp (ändra ev. skalan i Arrange: Correlation minimum). Om man vill föra samman de grupper som är nära besläktade så går man in på Arrange: Swap. Om man vill att gelstripsen ska synas intill dendrogrammer välj Show:Gelstrips. Gå in i Print och välj full size. En ruta kommer upp där namnet på ditt träd är markerat. Gå in i Print och se till att Print with header är markerat. Klicka sedan på Print: selected job. 9

Dendrogrammet kan förhandsgranskas innan det skrivs ut. Välj Print:Preview mode. Här kan man justera hur dendrogram och gelstrips ska se ut på sidan genom att dra i de gula linjerna. Man kan även justera bredden på gelstripsen under menyn Size. Under menyn Print kan man skriva ut dendrogrammet. Man kan även exportera dendrogrammet till klippbordet om man vill föra över det till något annat program genom att välja Print:Copy to clipboard och sedan klistra in dendrogrammet i det önskade programmet. Tolkning av dendrogram Datorn jämför de densitometriska kurvorna för varje genetiskt fingeravtryck och beräknar parvis korrelationskoefficienter mellan densitetsprofilerna som lagras i en likhetsmatrix. Dendrogrammet görs utifrån denna matrix. De fingeravtryck som har mest lika densitometriska kurvor kommer att hamna i samma gren på dendrogrammet. Man kan inte bara dra en linje vid en viss procents likhet i skalan på dendrogrammet och säga att alla över denna procent är lika utan man måste använda sig av gelstripsen för att avgöra vilka som är identiska eller inte. Figur 4 visar ett exempel på hur ett dendrogram med gelstrips kan se ut. Figur 4. Exempel på hur ett dendrogram kan se ut. De fingeravtryck som markerats med klammer har bedömts som lika. Fingeravtryck av Bacillus cereus isolerade från silomjölk på ett mejeri. DISKUSSION Olika primers En primer för RAPD-PCR är ca 10 nukleotider lång och bör ha ett högt CG innehåll. Den ska binda in slumpmässigt över hela bakteriens arvsmassa. Vilken primer man ska använda beror på vilken bakterieart man vill studera. Man får därför prova sig fram genom att generera slumpmässiga primers eller leta i litteraturen. Om någon har använt en primer i en närbesläktad art så kan man prova denna. För RAPD bör man välja en primer som ger mellan 7 och 15 band inom det storleksintervall man vill analysera. Färre band ger en dålig upplösning och fler band gör det svårare att reproducera resultatet. 10

I vårt fall provade vi nio olika primers (Tabell 2) på sju olika B. cereus-stammar. Primers 4 och 6-9 gav få eller svaga band och sorterades bort i den efterföljande utprovningen. Övriga primers gav alla ett lämpligt antal band med olika mönster för de olika stammarna. Primer 1 valdes för vidare optimering av metoden (se nedan). Primerhalten hölls från början vid 8 µm men ändrades sedan till 4 µm utan att reproducerbarheten förändrades. När metoden optimerats testades primer 3 som alternativ till primer 1. Primer 3 fungerade bra som alternativ primer med samma PCR-reaktionsförhållanden som primer 1. Tabell 2. Primers använda under utprovning av metoden. Primer 1 har använts för det fortsatta arbetet. Primer 3 har använts för verifiering av resultaten. Primer nr Primer sekvens % GC 1 5 C-C-G-A-G-T-C-C-A 3 66.7 2 5 A-C-G-C-G-C-C-C-T 3 77.8 3 5 C-C-G-G-C-G-G-C-G-3 100 4 5 C-G-G-C-C-C-C-T-G-T 3 80 5 5 C-G-G-C-C-A-C-T-G-T 3 70 6 5 C-G-G-T-C-A-C-T-G-T 3 60 7 5 T-G-G-T-C-A-C-T-G-T 3 50 8 5 T-A-G-T-C-A-C-T-G-T 3 40 9 5 T-A-A-T-C-A-C-T-G-T 3 30 * Källa: Symbicon AB, Umeå Olika halter MgCl 2 Taq DNA- polymeras kräver Mg 2+ för sin funktion. Man måste därför tillföra magnesiumjoner till sin reaktionsblandning. Oftast görs detta i form av MgCl 2. Vissa DNApolymeraser kräver dock andra magnesiumsalter. Kontrollera därför alltid med leverantören av polymeraset vilket salt som ska tillsättas. I vissa PCR-buffertar ingår MgCl 2 detta bör beaktas så att rätt mängd tillsätts om det krävs mer magnesium än vad som redan finns i bufferten. Oftast har man något högre magnesiumhalt (3-4 mm) i RAPD-PCR än vad man har vid vanlig PCR-analys (1-2.5 mm). Enklaste sättet att prova ut magnesiumhalten är att göra en parallell serie med olika magnesiumkoncentrationer. När vi provade ut vår metod användes koncentrationer mellan 1.5 och 6 mm MgCl 2. Starka och reproducerbara bandmönster erhölls med Mg 2+ koncentrationer över 3 mm. DNA-koncentration Variationer i bandmönster beror också på förhållandet primer och templat. Vi varierade koncentrationen av DNA i en reaktionsmix där koncentrationen av primer hölls konstant vid 8 µm och magnesiumjon koncentrationen var 3 mm. Reproducerbara bandmönster erhölls över en 50-faldig koncentration av DNA, vilket motsvarade DNA från 10 5 till 5 x 10 6 bakterieceller. Variationer i intensitet för de olika banden observerades alltid mellan olika PCR-analyser medan bandmönstret var konstant. Förekomst av band med högre molekylvikt (2 kbp eller högre) tenderade att variera mer. Därför uteslöts dessa från analyserna i GelCompar. 11

Tillsats av aktivt kol vid DNA-preparation B. mycoides kolonier växer nere i agarn och är därför svåra att skörda genom att skrapa från plattan. Dessa stammar odlas därför i flytande medium. När metoden provades ut var det inledningsvis svårt att få något resultat från B. mycoides med RAPD. Ett försök gjordes att tillsätta aktivt kol vid preparation av DNA för att binda eventuella inhibitorer av PCRreaktionen. Detta visade sig fungera utmärkt. Aktivt kol tillsattes också vid preparation av DNA från B. cereus och även här hade kolet en positiv effekt på kvaliteten på RAPDmönstren. Nu tillsätts aktivt kol rutinmässigt vid preparation av DNA från både B. cereus och B. mycoides till RAPD-PCR. Positiv och negativ kontroll För att ha kontroll på sina RAPD-PCR analyser är det viktigt att vid varje analys tillfälle ha med en positiv och en negativ kontroll. Den negativa kontrollen består av PCR-mix utan tillsats av DNA. Detta görs för att kontrollera att man inte kontaminerat sina lösningar med DNA. Som positiv kontroll bör man välja ut en stam som ger ett tydligt och lätt reproducerat bandmönster och ta med den varje gång man gör en ny PCR-analys. Om denna stam inte ger det förväntade mönstret bör man kontrollera de olika stegen och se om något särskilt kan ha inträffat just denna gången. Sporuleringsfas vid DNA-preparation Bacillus-arterna är ju Gram-positiva sporulerande bakterier. Detta måste tas i beaktande när man ska göra DNA-preparationer från bakterier från detta släkte. Gram-positiva bakterier är i regel svårare att få sönder än Gram-negativa. Har man dessutom bildning av sporer så blir det ännu besvärligare att hitta rätt tillväxtfas att skörda sina bakterier i för att få en effektiv DNApreparation. Vi odlade olika stammar av B. cereus på platta och följde utvecklingen av sporer genom att mikroskopera cellerna vid olika tidpunkter. Prov för DNA-preparation för RAPD- PCR togs i olika faser av sporuleringen. Det visade sig att de bästa RAPD resultaten erhölls om bakterierna hade hunnit bilda en pre-spor inne i modercellen. Troligen har man då fått en försvagning av cellväggen som gör det lättare att få sönder cellen och få ut DNA:t. Går man för långt i sporuleringscykeln finns det risk att DNA:t i modercellen har fragmenterats och då får man inte något RAPD resultat. Om bakterierna helt har gått över till sporer så får man inte heller ut något DNA på det sätt som vi har använt oss av. Reproducerbarhetstest med sex stammar För att kontrollera reproducerbarheten för vår RAPD-metod så valdes sex olika stammar ut. En B. mycoides och fem B. cereus. Bland de fem B. cereus stammarna fanns två som var identiska men hämtade från två olika stamkollektioner. De sex stammarna odlades upp och genomgick hela RAPD-proceduren vid fem helt skilda tillfällen och resultaten lades sedan samman vid analys i GelCompar. De två identiska stammarna hamnade tillsammans i en grupp och övriga stammar bildade varsin egen gren på likhetsträdet (Figur 5). Fler liknande tester har då och då utförts i olika sammanhang då tveksamheter har förelegat om ett antal isolat verkligen har gett identiska RAPD-mönster. Ibland har även en alternativ primer använts för att verifiera att stammar verkligen är lika. För att vara helt säker bör kanske en annan metod för att typa på stamnivå användas. En bra metod för detta kan vara REA (restriction enzyme analysis). REA är dock svårare att utföra och tar betydligt längre tid än RAPD. 12

80 90 100 CCUG 5614 ATCC 7064 ATCC 27877 ATCC 14579 ATCC 11986 Figur 5. Reproducerbarhets kontroll. Varje stam har analyserats vid fem oberoende tillfällen. De genetiska fingeravtrycken för varje stam hamnar tillsammans i dendrogrammet. ATCC 14579 representeras av två olika isolat från två olika stamkollektioner. Vad kan gå fel? Här följer en förteckning över olika felkällor, deras orsaker och konsekvenser. Listan kan användas för felsökning: Det är viktigt att locken sitter ordentligt på då cellerna kokas för att preparera DNA så att inte vatten kommer in och förorenar provet. Undvik att bli störd då PCR-mixen blandas. Stäng gärna av telefonen och undvik att andra personer kommer och stör. Det är viktigt att följa schemat vad gäller tid och temperatur vid blandning av PCR-mixen. Får enzymet stå framme för länge i värmen kan resultatet bli sämre. Fel inställning av pipett. För mycket eller för litet vätska p.g.a. vätska utanpå pipettspetsen eller luftbubblor när man suger upp. Pipetten har blivit förorenad. Spetsar utan propp i kan medföra att kontaminerad luft från pipetten kommer ner i röret och tillför DNA. Man bör aldrig använda samma pipettspets 13

två gånger inte ens i samma rör. Pipettera inte direkt från stamlösningar utan gör brukslösningsrör med relativt liten mängd så man inte behöver pipettera alltför många gånger från samma rör (gäller inte enzym). Använd inte samma pipetter för att pipettera PCR-produkterna som används för att blanda mixen. Enzymet är känsligt för uppvärmning och bör hela tiden förvaras på frysblock. Enzymet är i en lösning med glycerol för att det inte ska frysa. Detta gör lösningen mycket viskös och därför ganska svår att pipettera. Det gäller att undvika att få luftbubblor och att inte köra ner pipettspetsen för långt ner i lösningen, man får då onödigt mycket på utsidan av spetsen. Om man inte får några band alls kan det vara lämpligt att prova med nytt enzym innan man börjar byta ut alla andra lösningar eller börjar att göra ny DNA-preparation. MQ-vattnet bör bytas ofta så att man inte kontaminerar sina övriga lösningar med DNA som kan ha hamnat i MQ-vattnet. MgCl 2 -lösning bör bytas relativt ofta eftersom man kan få kristallbildning av saltet som gör att koncentrationen ändras. Om man har ett system som kräver att man lägger mineralolja ovanpå PCR-mixen så bör man förvara oljan svalt och göra ett bruksrör som man pipetterar från. Det finns möjlighet att mikroorganismer kan tillväxa i oljan om den står varmt. Om man har ett system utan olja är det viktigt att locken sluter ordentligt tätt annars är det risk att vätska avdunstar under PCR-reaktionen. Om man inte ens ser storleksmarkören på gelen vid UV-belysning, då kan man ha glömt att sätta till etidium bromid. Man kan ha satt på locket åt fel håll så att DNA:t har vandrat åt fel håll och lämnat gelen. Suddiga geler kan innebära att TBE-bufferten i elektroforeskärlet är använd för många gånger. TBE-bufferten bör bytas efter 4-6 körningar. Bra gel men dåligt foto: Fel inställning på kameran. Dålig fokusering. Gamla fotokasetter. Ljusskadade foton. Dålig framkallning på grund av att man dragit ut fotot snett från kameran och på så sätt fått framkallningsvätskan att rinna ut. SLUTSATS RAPD-PCR är en bra metod för att generera genetiska fingeravtryck från B. cereus isolat. Det är även en relativt billig och snabb metod om man vill undersöka ett stort antal stammar. Men tyvärr finns det många felkällor som gör att kvaliteten på fingeravtrycken kan variera. Detta gör att det krävs tränad personal med laboratorievana för att kunna använda sig av denna metod. Det går med noggrann standardisering av metoden att få en bra reproducerbarhet inom det egna laboratoriet. Det är dock svårare att reproducera samma mönster mellan olika laboratorier. I denna rapport har vi försökt att beskriva metoden och felkällorna för att underlätta för andra användare att sätta upp tekniken. REFERENS Nilsson, J., Svensson, B., Ekelund, K. & Christiansson, A. (1998). A RAPD-PCR method for large-scale typing of Bacillus cereus. Letters in Applied Microbiology 27, 168-172. 14