Vattenundersökningar Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma bakterier och Escherichia coli i vatten Bestämning med membranfiltermetod (MF) Coliform Bacteria, Thermotolerant Coliform Bacteria and Escherichia coli in Water Determination with the Membrane Filtration Method (MF) lnnehåll 0 Orienteering 1 Omfattning 2 Referenser 3 Definitioner 4 Princip 5 Utrustning 6 Provtagning 7 Bestämning 8 Resultat 9 Rapport Litteratur Bilaga A Odlingssubstrat och reagens (Denna bilaga är en del av standarden) Bilaga B Utökad testning (Informativ) 0 Orientering De sjukdomar som kan spridas med dricksvatten är framför allt olika mag- och tarmsjukdomar där smittämnena (bakterier, virus, parasiter) finns i avföringen för djur och människa. I vatten förekommer de sjukdomsalstrande (patogena) mikroorganismerna i regel i litet antal jämfört med de naturliga tarmbakterierna. Det finns metoder för att påvisa olika patogena mikroorganismer i vatten, men de är ofta omständliga och kostnadskrävande. Därför letar man vid mikrobiologisk rutinkontroll av vatten i stället efter olika s.k. indikatorbakterier, dvs. bakterier som normalt finns i avföring från djur och människa. De mikroorganismer som används som indication på sådan förorening är främst E. coli och dessutom hela gruppen koliforma bakterier. Den metodik som anges i denna standard för bestämning av koliforma bakterier baseras på nedbrytning av laktos till syra och gas. Det existerar dock naturligt förekommande koliforma bakterier som saknar eller har tappat förmågan att bryta ner laktos, och som därför faller utanför metoddefinitionen trots att de har samma indikatorvärde. E. coli anses vara av fekalt ursprung, medan övriga koliforma bakteriearter antingen kan vara av fekalt ursprung eller finnas naturligt i jord och vatten. Om osäkerhet råder om deras indikativa värde bör vidare artidentifiering ske (Bilaga B). Närvaro av ett stort antal koliforma bakterier av samma art kan indikera tillväxt i vattnet.
Bestämning med membranfiltermetod (MF) Utgåva 2 Sida 2 Utgåva 2 skiljer sig från utgåva 1 genom ändrade förslag till analysvolymer. Vidare konfirmeras koliforma bakterier med hjälp av oxidastestning, och termotoleranta koliforma bakterier kan bestämmas genom direkt odling vid hög temperatur eller genom vidare analys av koliforma bakterier. Ett avsnitt om bestämning av E. coli har tillkommit. Följaktligen har vissa odlingssubstrat, såsom laktostryptonlaurylsulfatbuljong tillkommit. Recept på odlingssubstrat och reagens är placerade i en bilaga, och ytterligare en bilaga ger information om utökad testning. VARNING! Vid användning av denna standard hanteras kemikalier och mikroorganismer som, om de inte hanteras rätt, kan medföra hälsorisker. Regler för arbetsmiljön finns i Arbetarskyddsstyrelsens författningssamling, t. ex. i reglerna om farliga ämnen och om biologiska ämnen. 1 Omfattning I denna standard beskrivs bestämning av antal koliforma bakterier i vatten vid 35 C, termotoleranta koliforma bakterier och E. coli i vatten vid 44 C enligt SS 02 81 65, utg 2, Mikrobiologisk undersökning Membranfiltermetod. Membranfiltermetoden är främst avsedd för ospädda prov med låg bakteriehalt. Metoden är olämplig för vatten med hög halt av partiklar, kolloidala substanser och tillväxthämmande substanser som kan stanna på filtret. Den bör heller inte användas för vatten som ger hög bakgrundsväxt, vilket stor bestämning av önskad grupp mikroorganismer. I dessa fall bör SS 02 81 64, utg 2, Mikrobiologisk undersökning Rörmetod MPN användas. Membranfiltermetoden ger vanligen färre falska positiva indikationer än rörmetoden. Falska indikationer kan dock förekomma, främst från grupperna Aeromonas, Xantomonas och Pseudomonas. Flertalet av dessa organismer är emellertid oxidaspositiva bakterier och kan därför sorteras bort med oxidastest. Membranfiltermetoden ger snabbare resultat an Rörmetod MPN och kan anpassas för fältbruk. Vid undersökning av klorerat vatten med avseende på termotoleranta koliformer och E. coli skall 7.2 beaktas. Ansvarig myndighet bestämmer provtagningsfrekvens och vilka mikrobiologiska krav som skall ställas på vattnet. 2 Referenser SS 02 81 63, utg 2, SS 02 81 64, utg 2, SS 02 81 65, utg 2, SS 02 81 05, utg 1, Vattenundersökningar Mikrobiologisk undersökning Provtagning Vattenundersökningar Mikrobiologisk undersökning Rörmetod MPN Vattenundersökningar Mikrobiologisk undersökning Membranfiltermetod Vattenundersökningar Utvärdering av membranfilter för mikrobiologiska analyser 3 Definitioner Koliforma bakterier i denna standard definierade som oxidasnegativa bakterier som vid aerob odling på LES endoagarsubstrat bildar syra och aldehyd inom (24 ± 4) h vid inkubering i (35 ± 0,5) C.
Bestämning med membranfiltermetod (MF) Utgåva 2 Sida 3 Termotoleranta koliforma bakterier bildar syra inom (24 ± 4) h vid inkubering i (44 ± 0,5) C på ett M-FC-substrat. E. coli termotoleranta koliforma bakterier som också bildar gas från laktos såväl som indol ur tryptofan inom (24 ± 4) h vid (44 ± 0,5) C. Anm Då gasproduktion inte detekteras med membranfiltermetoden, kan organismsammansättningen skilja sig från den som erhålls med Rörmetod MPN, om inte konfirmativ analys sker. 4 Princip Se SS 02 8 165 för en generell beskrivning över membranfiltermetoden. Ett vattenprov filtreras genom ett membran med sådan porvidd att koliforma bakterier stannar på membranet. Efter filtreringen överförs membranet till ett odlingssubstrat speciellt anpassat till koliforma bakterier. I LES endoagarsubstrat (Lawrence Experiment Station) finns bland annat fuksin i reducerad form (blekrosa färg) eftersom substratet också innehåller natriumsulfit. När laktosjäsande bakterier växer bildas en aldehyd som oxiderar fuksin. Kolonierna får en kraftigt mörkröd färg och blir oftast metallglänsande. Tillsatta detergenter hindrar utväxt av icke-koliforma bakterier. På M-FC-substrat (Membrane Faecal Coliform) bildar laktosjäsande bakterier syra. Syran indikeras av en ph-indikator (anilinblått) som ger kolonierna blå färg. Den höga temperaturen hindrar utväxt av de flesta koliforma bakterier med undantag av termotoleranta arter (bland annat E. coli). Tillsatta gallsalter och rosolsyra hindrar utväxt av Gram-positiva mikroorganismer. 5 Utrustning Utrustning enligt SS 02 81 65, utg 2, avsnitt 4, med följande preciseringar: 5.1 Membranfilter Vita rutmönstrade membranfilter med porvidd 0,45 µm. OBSERVERA att olika satser av membranfilter kan ha olika egenskaper. Se SS 02 81 05, utg 1 för information om kontroll av membranfilter. 5.2 Petriskålar Sterila petriskålar av plast eller glas. 5.3 Inkubator Vattenbad, inkubatorskåp eller inkubationsrum med möjlighet att reglera temperaturen till (35 ± 0,5) C eller (44 ± 0,5) C. Vid inkubering av petriskålar med lock som inte är tättslutande, bör man dels vidtaga åtgärder för att motverka att avdunstning gör att substrate torkar ut, dels upprätthålla en hög luftfuktighet (cirka 90% relativ fuktighet) för att kolonierna skall framträda på bästa sätt. 6 Provtagning Ta ut vattenprover och transportera dessa enligt SS 02 81 63, utg 2. 7 Bestämning Bestäm antalet koliforma bakterier, termotoleranta koliforma bakterier och E. coli enligt SS 02 81 65, utg 2. Lämpliga analysvolymer för olika typer av prov framgår av tabell 1.
Bestämning med membranfiltermetod (MF) Utgåva 2 Sida 4 Tabell 1 Förslag till analysvolymer 7.1 Koliforma bakterier Lägg filtren på LES endoagarsubstrat (A.1.1) och inkubera vid (35 ± 0,5) C. Gör en avläsning efter (24 ± 4) h, eftersom en del kolonier kan avfärgas vid längre inkubering. Fortsätt inkuberingen så att den sammanlagda inkuberingstiden blir (44 ± 4) h om det finns anledning att misstänka att bakterierna är stressade. En typisk koliform koloni är rosa till mörkröd med metallglänsande yta. Den metallglänsande ytans storlek kan variera från knappnålsstor till att helt täcka kolonins yta. Räkna metallglänsande kolonier under ett mikroskop vid 10 gångers förstoring. Belys filtret uppifrån med ett kallt, vitt ljus. Kolonier utan metallglans kan vara rosa, röda, vita eller färglösa, och skall betraktas som icke-koliforma bakterier. Det totala antalet kolonier (koliformer och icke-koliformer) på endoagarsubstrat är inte korrelerat till det totala antalet bakterier i provet. Ett högt antal icke-koliforma bakterier kan dock hämma utväxten av koliforma bakterier. En del icke-koliforma bakterier, t. ex. vissa Aeromonas-, Pseudomonas- och Xantomonas-arter, kan ge upphov till röda eller metallglänsande kolonier på endoagar. Flertalet av dessa är dock i motsats till de koliforma bakterierna oxidaspositiva. Undersök därför ett representativt antal kolonier av olika morfologi med oxidastest. 7.1.1 Oxidastest Renstryk kolonier från primärplattan på jästpeptonagar (A. 1.3) eller annat oselektivt substrat. Substratet får inte innehålla förjäsbara kolhydrater, eftersom bildade syror kan orsaka falska negativa resultat. Inkubera vid (35 ± 0,5) C. Kolonier som skall oxidastestas får inte vara äldre än 1 dygn. Utför oxidastesten enligt reagenstillverkarens föreskrifter (A.2.1). Beräkna antalet koliforma bakterier med utgångspunkt från antalet oxidasnegativa kolonier. 7.2 Termotoleranta koliforma bakterier Lägg filtren på M-FC-substrat (A.1.2) och inkubera vid (44 ± 0,5) C i (24 ± 4) h. Om misstanke finns att bakterierna i provet är stressade, t ex om vattnet är klorerat, bör plattorna först inkuberas vid (35 ± 0,5) C under (4 ± 1) h. Flytta därefter plattorna till (44 ± 0,5) C och inkubera där så att den sammanlagda inkuberingstiden blir (24 ± 4) h. Räkna alla blå kolonier. Den blå färgen kan variera i intensitet eller finnas enbart i kolonins centrum. Termotoleranta koliforma bakterier kan också bestämmas med utgångspunkt från koliforma bakterier. Renstryk ett representativt antal metallglänsande kolonier från LES endoagarsubstrat (7.1) och undersök laktosjäsning enligt 7.3. Koliforma bakterier som förjäser laktos vid (44 ± 0,5) C är termotoleranta koliforma bakterier.
Bestämning med membranfiltermetod (MF) Utgåva 2 Sida 5 7.3 E. coli Bestämningen sker genom undersökning dels av syra- och gasbildning från laktos (tvårörsmetod) eller enbart gasbildning från laktos (enrörsmetod), dels av indolbildning från tryptofan vid (44 ± 0,5) C. Beräkning av antalet E. coli kan endast ske med utgångspunkt från de rör som givit positiv reaktion i båda dessa analyser. Bestämningen kan utföras antingen i ett rör med kombinerat substrat (enrörsmetod) eller i två separata rör (tvårörsmetod). Renstryk ett representativt antal metallglänsande kolonier från LES endoagarsubstrat (7.1) eller blå kolonier från M-FC substrat (7.2) på jästpeptonagar (A.1.3) eller annat oselektivt substrat. Inkubera plattorna vid (35 ± 0,5) C. 7.3.1 Enrörsmetod Överför kolonimaterial från jästpeptonagar eller annat oselektivt substrat till ett rör med laktostryptonlaurylsulfatbuljong, LTLSB (A.1.5). Inkubera röret i vattenbad med en temperatur av (44 ± 0,5) C tills denna temperatur uppnåtts i röret. Flytta därefter om så önskas röret till inkubatorskåp med samma temperatur och inkubera sammanlagt (24 ± 4) h. Rör somvisar gasbildning är positiva. Undersök positiva rör på indolbildning genom att tillsätta 0,5 ml Kovács reagens (A.2.2) till rören. Framträder efter omskakning ett rött ytskikt har indol bildats. Är ytskiktets färg orange, gul eller grön är reaktionen negativ. 7.3.2 Tvårörsmetod Överför kolonimaterial från jästpeptonagar eller annat oselektivt substrat till dels ett rör med laktospeptonbuljong, LPB (A. 1.4), dels ett rör med tryptofanbuljong (A.1.6). Inkubera rören i vattenbad med en temperatur av (44 ± 0,5) C tills denna temperatur uppnåtts i rören. Flytta därefter om så önskas rören till inkubatorskåp med samma temperatur och inkubera sammanlagt (24 ± 4) h. Syra- och gasbildning i LPB-röret anses som positiv reaktion. Undersök indolbildning genom att tillsätta 0,5 ml Kovács reagens (A.2.2) till röret med tryptofanbuljong. Framträder efter omskakning ett rött ytskikt har indol bildats. Är ytskiktets färg orange, gul eller grön är reaktionen negativ. 8 Resultat Beräkna resultatet enligt SS 02 81 65, utg 2. 9 Rapport Rapporten skall innehålla följande uppgifter: a) noggrann identifiering av provet b) hänvisning till denna standard SS 028167, utg 2 c) resultat d) övriga förhållanden som kan ha påverkat resultatet. Litteratur 1) 2) 3) ISO 9308-1, Water Quality Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli Part 1: Membrane filtration method Kovács, N: Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature (1956) 178, p 703 Mac Faddin, J F: Biochemical tests for identification of medical bacteria. (1976) ISBN 0-683-95314-0
koliforma bakterier och Escherichia coli i vatten - BILAGA A TILL SS 02 81 67 Bestämning med membranfiltermetod (MF) Utgåva 2 Sida 6 Bilaga A - Odlingssubstrat och reagens (Denna bilaga är en del av standarden) Använd destillerat eller avjoniserat vatten vid alla beredningar. Vattnet får inte innehålla substanser som kan påverka mikroorganismernas tillväxt under analysbetingelserna. Samtliga kemikalier skall vara av hög renhet (pro analysi). Justera ph vid behov genom tillsats av antingen 1,0 mol/l natriumhydroxidlösning (40 g NaOH per liter vatten) eller 1,0 mol saltsyra (82,5 ml koncentrerad HCl spädd till 1 liter). A.1 Odlingssubstrat Kan ett substrat köpas i dehydrerad form bör det användas i första hand. Följ i så fall tillverkarens anvisningar vid beredningen. A.1.1 LES endoagarsubstrat Jästextrakt Kasiton*) eller tryptikas*) Tiopepton*) eller tioton*) Tryptos Laktos Dikaliumhydrogenfosfat, K 2 HPO 4 Kaliumdihydrogenfosfat, KH 2 PO 4 Natriumklorid Natriumdesoxikolat Natriumlaurylsulfat Natriumsulfit Basiskt fuksin Agar Destillerat vatten innehållande 20 ml 96 % etanol 1,2 g 3,7 g 3,7 g 7,5 g 9,4 g 3,3 g 1,0 g 3,7 g 0,1 g 0,05 g 1,6 g 0,8 g 15,0 g 1 000 ml OBSERVERA! Basiskt fuksin kan vara cancerogent. Använd dragskåp eller andningsskydd och gummihandskar vid arbetet som skydd mot inhalation och hudkontakt. Lös ingredienserna i vattnet. Värm substratet till kokpunkten under omrörning och kyl det därefter omedelbart till (45 50) C. Det får inte autoklaveras. Det färdiga substratets ph skall vara 7,2 ± 0,1. Fyll det ljuskänsliga substratet i petriskålar. Täck skålarna med ett ogenomskinligt material under avsvalningen och förvara dem därefter mörkt vid en temperatur av (2 10) C under högst två veckor. *) eller motsvarande substans