Laboration om cellskada och manipulering av cellers känslighet för stress Laborationen kommer att utföras av en basgrupp och pågå under fyra dagar. Två personer ur basgruppen närvarar vid varje tillfälle och tar vid där den förra gruppen slutade ( stafett ). Det är nödvändigt att hela basgruppen samlas innan laborationen och planerar tillsammans (bearbeta de tre första sidorna)! Bakgrund Cellskador kan uppkomma t ex genom exponering för kemikalier, hetta, kyla, ischemi eller strålning. Avgörande för vilka skador som uppkommer är förutom typ av stimuli även duration och koncentration. Oxidativ stress orsakas av reaktiva syrederivat (t ex syreradikaler och väteperoxid) och leder till oxidation av intracellulära komponenter. Detta påverkar framförallt funktionen hos proteiner och lipider (bl a lipidperoxidering av cellulära membran). Antioxidanter är viktiga molekyler som skyddar mot oxidativ stress genom att hejda dessa reaktioner och återställa funktionen hos proteiner som oxiderats. Ytterligare ett sätt att minska effekterna av reaktiva syrederivat är att hålla koncentrationen av fria metalljoner såsom järn och koppar så låg som möjligt. Laborationen Laborationen är tänkt att illustrera cellers reaktion på oxidativ stress och vilka möjligheter som finns för att manipulera deras känslighet. Vi kommer att använda cellkulturer och skapa oxidativ stress genom att exponera dem för väteperoxid. För att undersöka om känsligheten för oxidativ stress kan förändras kommer ni att kunna behandla cellkulturerna med antioxidanter, extra järnjoner eller järnkelerare (ämnen som binder järn och gör det icke-reaktivt). Vid det första tillfället ska celler förbehandlas med de ämnen som eventuellt skulle kunna påverka cellernas känslighet för oxidativ skada. Ni kommer också att kvantifiera mängden apoptotiska och nekrotiska celler genom att morfologistudier. Andra dagen kommer cellskada induceras genom att exponera cellerna för väteperoxid och ni kommer att studera cellernas järninnehåll. Denna dag kommer också prover frysas för att mäta cellernas ATP innehåll under den tredje laborationen. Ytterligare en analys på de frysta proverna kommer att göras med avseende på lipidperoxidering av den fjärde gruppen (se bild 1). Planering Basgruppen ska tillsammans planera upplägget av labben genom att diskutera fram en försöksuppställning före första laborationstillfället. Förutsättningarna är följande: Ni kan maximalt använda 10 cellodlingsskålar med olika behandlingar Oxidativ stress: Modulatorer: Väteperoxid Antioxidant (N-acetylcystein) Järn joner Järnkelerare (desferrioxamin) Tänk på vilka kontroller som behövs för att kunna tolka resultaten. Använd tabellen nedan!
Anm. Ingen av manipuleringsämnena är toxiska i de koncentrationer som ska användas. Väteperoxid måste därför användas i de prover där oxidativ stress ska studeras. Dag 1: Celler är utsådda från flaska till cellodlingsskål av labbhandledarna. Tillsats av antioxidant, järn och/eller järnkelerare. Dag 2: Tillsats av väteperoxid. Nedfrysning av prover till ATP analys Dag 3: Mätning av ATP. Tillsats av väteperoxid ATP Nedfrysning av prover till lipidperoxiderings analys Dag 4: Mätning av lipidperoxidering på nedfrysta prover MDA
Skål Antioxidant Järnkelerare Järn Väteperoxid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Grupp 1: Behandling med modulatorer och studie av celldöd Cellerna som används heter UT-SCC-77 och är en cellinje från humant skivepitel. Cellerna odlas normalt på botten av cellodlingsflaskor men inför experimentet sås de ut i mindre cellodlingsskålar (70 000 celler/ml) i 2 ml cellodlingsmedium. Cellerna odlas i en inkubator (37 C) med 5 % CO 2. Cellers känslighet för cellskada orsakad av oxidativ stress kan påverkas av olika faktorer. Oxidativ stress uppstår då produktionen av fria radikaler är högre än cellens förmåga att göra sig av med dem. Fria radikaler kan skada cellens alla komponenter, inklusive proteiner, lipider och DNA. Metalljoner kan ge upphov till fria radikaler genom den s.k. Fenton reaktionen, där en hydroxyl-radikal bildas då väteperoxid reagerar med t.ex. reducerat järn. H 2 O 2 + Fe 2+ HO + OH - + Fe 3+ Förekomsten av metalljoner i fri form kan leda till ökade nivåer av oxidativ stress. N- acetylcystein (NAC) bildas från aminosyran cystein. Tiolgruppen (-SH) medför att NAC har antioxidantegenskaper och kan genom att donera en elektron stabilisera fria radikaler. Desferal är en järnkelerare som används för att ta bort överflödigt järn. 1. Tillsats av modulatorer av oxidativ stress Beräkna hur mycket av järn, desferal och/eller NAC som ska tillsättas till varje cellodlingsskål, det är 2 ml medium i varje skål. Slutkoncentration finns i tabellen. Modulator Stamlösning Slutkoncentration Järn (FeCl 3 ) 30 mm 30 µm Desferal 100 mm 1 mm N-acetylcystein (NAC) 1 M 1 mm Tillsätt järn, desferal och/eller NAC direkt till cellodlingsmediet i skålarna enligt basgruppens försöksupplägg. Markera på locket vilka skålar som behandlats med vad. Ställ tillbaka cellerna i cellodlingsskåpet. 2. Kärnmorfologi vid apoptotisk celldöd Handledarna har i förväg preparerat prover (för alla möjliga kombinationer av modulatorer och oxidativ stress). Därefter har proverna fixerats och DAPI (4',6- diamidino-2-fenylindol) som binder till A-T-rika områden i DNA, har adderats för att färga kärnorna. Välj ut de prover som motsvarar era behandlingar och studera kärnmorfologin i ett fluorescencemikroskop. Beskriv skillnaden i morfologi mellan kontrollceller och celler behandlade med oxidativ stress (apoptotiska). Välj ut ett par representativa områden i provet och räkna totalantalet celler och antalet apoptotiska celler. Beräkna apoptosfrekvensen i provet i %.
3. Viabilitetstest nekrotisk celldöd Karakteristiskt för viabla celler är intakt plasmamembra. Om plasmamembranet är skadat kan stora vattenlösliga molekyler (t.ex. trypanblått) tränga in i cellen från utsidan och färga cellkärnan blå. Gör ett viabilitetstest av cellerna genom att tillsätta trypanblått. Lösningar 0,2 % trypanblå löst i PBS PBS Utförande Ni kommer att få kontrollceller och celler som behandlats med väteperoxid i förväg. Sug bort mediet med hjälp av vattensugen. Tillsätt 1,5 ml trypanblå-lösning och inkubera ca 1 min. Sug bort trypanblålösningen och tvätta 2 gånger med 1,5 ml PBS. Efter sista tvätten, lämna ca 1 ml PBS i odlingsskålen. Mikroskopera cellerna i ett ljusmikroskop. Beskriv vad du ser.
Grupp 2: Exponera cellerna för väteperoxid och stuera järninnehåll Hämta cellodlingsskålarna från inkubatorn och kontrollera att de ser viabla ut i mikroskopet (diskutera kännetecken på viabla celler). 1. Exponera celler för väteperoxid Sug bort odlingsmediet med vattensugen. Tillsätt 1 ml av väteperoxidlösningen. Ställ tillbaka cellerna i cellodlingsinkubatorn och inkubera 1 timme, 37 o C. Märk provrör och placera dem på is. Sug bort odlingsmediet från alla skålar och tillsätt 500 µl 2.5% triklorättiksyra (TCA) till varje cellodlingsskål för att lysera cellerna. Skrapa loss de lyserade cellerna med cellskrapan och pipettera över lösningen till provrör. Frys proverna till nästa grupp! 2. Kvantifiering av cellernas järninnehåll Handledarna har i förväg preparerat prover (för alla möjliga kombinationer av modulatorer och oxidativ stress). Därefter har proverna fixerats och cellens innehåll av järn blåfärgas medan kärnor rödfärgas. Välj ut de prover som motsvarar era behandlingar och studera cellernas järninnehåll i ett ljusmikroskop. Beskriv skillnaden i järninnehåll mellan kontrollceller och celler behandlade med oxidativ stress. Välj ut ett par representativa områden i provet och bedöm cellernas järninnehåll. Beräkna frekvens blå celler i provet i %.
Grupp 3: ATP analys med hjälp av chemiluminiscence Laborationen visar förändringar av mitokondriens funktion vid cellskada. Mitokondriens elektrontransportkedja skapar en protongradient över mitokondriemembranet och potentialskillnaden används för att syntetisera ATP. Vid cellskada, (t.ex. oxidation av lipider eller protein i mitokondriemembranet) påverkas mitokondriens förmåga att behålla protongradienten och därmed påverkas också cellernas ATP nivå. ATP nivån analyseras genom att studera reaktionen då D-luciferin omvandlas till oxyluciferin, en luciferas katalyserad reaktion. Vid denna reaktion omvandlas ATP till AMP och överskottsenergin avges som ljus (λ=562 nm). Antalet emitterade fotoner är direkt proportionellt till mängden ATP molekyler som använts. D-Luciferin + ATP + O 2 1. ATP mätning Luciferase Oxyluciferin + PP i + AMP + CO 2 + Ljus Pipettera 780 µl Tris-EDTA buffert i mätrör (engångsrör med platt botten), lika många som antalet prov. Tillsatt 200 µl ATP reagens till 4 rör i taget. I nästa steg justeras apparaten för bakgrunds luminiscens: Vortexa ett rör och mät bakgrund genom att sätta röret i luminometern och tryck på BKGR och håll inne tills displayen är nollställd. Ta ett av rören och tillsätt 20 µl prov. Vortexa och sätt tillbaka provet. Tryck på START. Anteckna värdet (I prov ). Ta ut röret och tillsätt 10 µl ATP standard (motsvarar 1 x 10-7 M ATP). Vortexa och sätt tillbaka röret. Tryck på START och anteckna värdet (I prov+ std ). Fortsätt med nästa prov enligt ovan. Beräkna mängden ATP i provet med hjälp av följande formel: ATP prov = 10-7 x I prov / (I prov+std I prov ) 2. Exponera celler för väteperoxid Sug bort odlingsmediet med vattensugen. Tillsätt 1 ml av väteperoxidlösningen. Ställ tillbaka cellerna i cellodlingsinkubatorn och inkubera 1 timme, 37 o C. Märk eppendorfrör. Pipettera över PBS/väteperoxid lösningen från cellerna till eppendorfröret. Lysera cellerna genom att tillsätta 200 µl H 2 O, skrapa loss cellerna från cellodlingsskålen med hjälp av en cellskrapa och överför dem till eppendorfröret. Proverna fryses (-70 o C) till analys vid fjärde laborationstillfället.
Grupp 4: Mätning av lipidperoxidering Oxidering av fosfolipider i cellens membran genererar aldehyder, som till exempel malondialdehyd (MDA) och 4-hydroxyalkenaler (HAE). LPO-586 kitet mäter förekomsten av dessa aldehyder och detta värde kan användas som en indikation på lipidperoxidering och därmed graden av oxidativ skada i cellerna. Metoden baseras på att N-methyl-2-phenylindole (R1) reagerar med MDA och HAE. En molekyl av MDA eller HAE reagerar med två molekyler R1 och bildar ett stabilt kromoforkomplex som kan mätas spektrofotometriskt vid våglängd 586 nm. Värdet avläses sedan mot en standardkurva. Utförande Tina proverna. Standardkurvan: Tillsätt 2 µl MDA-standard till 1 ml H 2 O. Använd den utspädda standarden till proverna i standardkurvan enligt nedanstående tabell. Koncentration (µm) 0 0.5 1 2 3 4 MDA-standard (µl) 0 25 50 100 150 200 Vatten (µl) 200 175 150 100 50 0 Pipettera 100µl av varje tinat prov till ett nytt eppendorfrör. Späd 4,5 ml reagens R1 med 1,5 ml diluent. Tillsätt 325 µl R1 till varje prov, även standardkurvan. Blanda genom att vortexa. Tillsätt 75 µl R2 reagens och vortexa. Inkubera alla rören i 45 C i 60 min. Centrifugera proverna för att få en klar supernatant (15000 x g, 10 min) Överför 150 µl av supernatanten till 96-hålsplatta. Gör dubbelprover. Mät absorbansen vid 586 nm. Beräkna koncentrationen av MDA/HAE i proverna utifrån standardkurvan.