AVSEDD ANVÄNDNING BACTEC PZA Test Medium Culture Vials Middlebrook 7H12 Medium ph 6.0 PP071JAA MA-0029 2007/06 Svenska BACTEC PZA Test Medium (Middlebrook 7H12 Broth, ph 6,0) är speciellt utvecklat för resistensbestämning av Mycobacterium tuberculosis mot pyrazinamid (PZA). Produkterna används huvudsakligen med BACTEC 460TBsystemet. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING BACTEC Radiometric Technique används för antibiotikaresistensbestämning av primära anti-mykobakteriella läkemedel (streptomycin, isoniazid, rifampin och etambutol). 1-4 Med denna teknik mäts 14 CO 2 som produceras av mykobakterier från metabilismen av ett 14 C-märkt substrat som finns i BACTEC 12B Medium. Om en antimikrobiell substans tillsätts till mediet, inhiberas mykobakteriella isolat som är känsliga för den antimikrobiella substansen och det sker en reducering i den mäng 14 CO 2 som genereras. Butler och medarbetare 5 föreslog en förbättrad konventionell metod för PZA-resistensbestämning som krävde ett speciellt 7H10 Agar Medium vid ph 5,5. En begränsning i denna metod är att vid ett ph på 5,5 växer många isolat av M. tuberculosis dåligt eller inte alls. BACTEC 12B Medium kan inte användas för PZA-resistensbestämning eftersom detta läkemedel endast är aktivt vid lägre ph-värden. 5 Heifets et al. föreslog en radiometrisk metod för PZA-resistensbestämning genom att använda BACTEC 12B Medium vid ph 5,5. Denna metod krävde att ph-värdet i varje individuell flaska sänktes från 6,8 till 5,5 efter det att tillväxten initierats i flaskan. 6 Vid ett ph på 5,5 kunde flera isolat inte växa i 12B Medium även om de totala resultaten som erhölls i 12B ph 5,5 var bättre än de som erhölls med 7H10 ph 5,5. Senare föreslogs tillsatts av äggula för att förbättra tillväxten av mykobakterier. 7 Detta resulterade i fler rapporterbara resultat, men tillsatsen av färsk äggula befanns vara besvärlig och opraktisk för ett kliniskt rutinlaboratorium. Salfinger och Heifets rapporterade efter ytterligare studier att MIC i PZA ökade vid en ökning av mediets ph från 5,5 till 6,8. 8 Med en modifiering av de ovan publicerade radiometriska resistensbestämningsmetoderna rekommenderade Salfinger et al. användning av BACTEC 12B Medium vid ph 5,9 till 6,0 (BACTEC PZA Test Medium) med en högre koncentration PZA än den som används i konventionellt fast medium (ph 5,5). 9 PRINCIPER FÖR METODEN BACTEC PZA Test Medium är ett modifierat 7H12 Medium med ett minskat ph på 6,0. Vid detta ph kan PZA-aktivitet mot mykobakterier bestämmas utan att tillväxten av de flesta M. tuberculosis-isolat inhiberas. Ökningen i ph kompenseras med att en högre koncentration PZA (100 µg/ml) används i BACTEC-testen jämfört med konventionella tester (25 50 µg/ml). PZA Test Medium innehåller ett 14 C-märkt substrat. När mykobakterier växer i detta medium metaboliserar de det märkta substratet och 14 CO 2 frigörs i atmosfären ovanför mediet inne i den förseglade flaskan. BACTEC 460TB-instrumentet analyserar förekomst av 14 CO 2 genom att avlägsna gasen från flaskan och överföra den till en elektrometer där mängden jonisering omvandlas till ett nummer som kallas Growth Index (GI, tillväxtindex). Hastigheten för och mängden 14 CO 2 som produceras i mediet är direkt proportionell mot tillväxtens hastighet och mängd i mediet. När det anti-mykobakteriella läkemedlet PZA tillsätts till mediet inhiberas tillväxten av känsliga mykobakterier. Detta indikeras av minskningen i 14 CO 2 -produktionen jämfört med en ökande trend i kontrollen. Om organismerna är resistenta kommer liten eller ingen hämning i tillväxten att förekomma i provflaskan. REAGENSER Innehåll* per flaska (4 ml) PZA Test Medium (slutligt ph 6,0 ± 0,2): 7H9 buljong... 0,47 % w/v Kaseinhydrolysat... 0,10 % w/v Bovint serumalbumin... 0,50 % w/v Katalas... 192 enheter 14 C substrat... 4 µci Avjoniserat vatten (ml)... 4 q.s. *Kompletteras efter behov för att uppfylla funktionskriterierna.
Varningar och försiktighetsbeaktanden: Avsedd för in vitro-diagnostik. Denna produkt innehåller torrt naturgummi. Patogena mikroorganismer, inklusive hepatitvirus och humant immunbristvirus, kan förekomma i kliniska prover. Allmänna försiktighetsbeaktanden 10-13 och institutionens riktlinjer bör följas vid hantering av alla föremål som kontaminerats med blod eller andra kroppsvätskor. Alla förfaranden skall utföras i lämpligt säkerhetsskåp och i ett område med ordentlig ventilation. Inokulerade flaskor måste testas på ett BACTEC 460TB-instrument utrustat med en BACTEC 460TB-kåpa som tillhandahåller HEPA-filtrerad luft och negativt tryck i instrumentets testområde. Före användning skall varje flaska undersökas för tecken på skada, försämring eller kontamination såsom grumlighet, buktande eller indraget membran eller läckage. Flaskor som uppvisar tecken på kontamination FÅR EJ användas. Det kan vara övertryck i en kontaminerad flaska. Flaskkontamination är inte alltid tydligt synlig. Flaskor som visar tecken på skada skall kasseras före inokulation. I sällsynta fall kan sprickor ha uppstått i glasflaskan och halsen kan gå sönder när locket dras av eller under hantering. Det kan också i sällsynta fall förekomma att flaskan inte är fullständigt förseglad. I båda fallen kan flaskans innehåll läcka eller spillas ut, speciellt om flaskan vänds upp och ned. Om flaskan har ympats skall det utläckta eller spillda materialet hanteras med försiktighet eftersom det kan innehålla patogena organismer/agens. Alla ympade flaskor skall steriliseras i autoklav innan de kasseras. För att minimera risken för läckage vid inokulation av prover på odlingsflaskor, skall sprutor med permanent fastsatta nålar eller Luer-Lok-spetsar användas. Kontamination Försiktighet skall iakttagas så att kontamination av provet under provtagning och inokulation på BACTEC-flaskan förhindras. Ett kontaminerat prov kan utfalla positivt, men detta innebär inte att resultatet är kliniskt relevant. Sådan kontamination kan förorsakas av felaktigt underhåll av BACTEC-nålar och slangar, dålig rengöring av membranet eller felfunktion hos BACTEC nålvärmningsenhet (se instrumentets användarhandledning). Det kommer an på användaren att avgöra huruvida provet är kontaminerat eller ej, med ledning av sådana faktorer som typ av påvisad organism, uppträdande av samma organism i flera odlingar, patientens anamnes, lämpliga kontroller av utrustningen etc. Förvaringsanvisningar Flaskor med BACTEC PZA Test Medium skall förvaras svalt (2 25 C) och torrt. Skriv utgångsdatumet på utsidan på varje förpacking och använd de äldsta förpackningarna först. Det är en god metod att åtskilja radioaktivt material genom att förvara detta i ett skåp som endast auktoriserad personal har tillgång till. Skåpet skall märkas med orden Varning: Radioaktivt material. Mediet får inte exponeras för direkt, stark belysning. Testa alltid varje flaska initialt på BACTEC 460TBinstrumentet för att etablera en atmosfär med 5 10 % CO 2 i flaskan och för att sortera bort flaskor med höga bakgrundsavläsningar. Om en flaska avläses GI 20 eller mer vid den initiala screeningen skall den kasseras. BEREDNING AV PROV Isolerade rena M. tuberculosis-kulturer skall odlas färskt i BACTEC 12B Medium och användas för denna test när de befinner sig i en aktiv tillväxtfas. Gamla, kylskåpsförvarade odlingar eller odlingar som har visat toppavläsningar för tillväxtindex i mer än en dag skall inte användas. FÖRFARANDE Tillhandahållet material: BACTEC PZA Test Medium Material som krävs men ej medföljer: BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 tester) } BACTEC 12B Medium Se Tillgänglighet BACTEC 460TB instrument Tuberkulinspruta med permanent fastsatt nål 5 ml spruta Desinfektionslösning 70-procentig isopropylalkohol Beredning av läkemedelsmedium a. Frystorkat PZA-läkemedel levereras separat tillsammans med en speciell PZA Reconstituting Fluid (RF, rekonstitutionsvätska). b. Rengör locket på flaskan med en alkoholtork. Tillsätt aseptiskt 5 ml RF med en spruta in i den frystorkade PZA-flaskan. Blanda väl. När innehållet är fullständigt löst ger detta en stamlösning på 4000 µg PZA/mL. c. Tillsätt 0,1 ml av PZA-stamlösningen i varje PZA-mediumflaska med en 1 ml spruta före inokulationen och efter locket har rengjorts med en alkoholtork. Den resulterande PZA-koncentrationen är 100 µg PZA/mL medium. 2
Försiktighetsbeaktanden: PZA får inte beredas med vatten eller annan spädningsvätska än RF. Volymen av rekonstitutionsvätskan kan variera. Uppmät exakt 5 ml från den medföljande flaskan vid rekonstitution av PZA-pulvret. Tillsats av korrekt mängd läkemedel i mediet är kritiskt för resistensbestämningens prestanda. Tillsätt exakt 0,1 ml stamlösning med en 1 ml tuberkulinspruta. Beredning av kontroll Ett PZA Test Medium utan tillsats av läkemedel används som kontroll. Tillsätt 0,1 ml rekonstitutionsvätska i kontrollflaskan innan odlingen inokuleras. RF innehåller en tillväxtfrämjande substans, polyoxietylenstearat (POES): Det måste finnas RF i alla inokulerade flaskor. Beredning av inokulat Endast aktivt växande odlingar skall användas för beredning av detta test. Överväxta, lagrade odlingar eller odlingar på annat medium skall inte användas. a. Fortsätt odlingen av kulturen som skall testas i en flaska med BACTEC 12B Medium (Kat. nr. 442004) med tillsats av 0,1 ml RF per flaska. b. Inkubera vid 37 C ± 1 C och testa flaskorna dagligen på BACTEC 460TB-instrumentet. c. När det dagliga tillväxtindexet når 300 499 skall denna flaska användas för inokulation av resistensbestämningen. d. Om tillväxtindex är högre än 300 499 skall färskt 12B Medium tillsättas till den initiala odlingsflaskan enligt tabellen nedan. Registrera den spädning som används för framtida referens. GI 300 499: Ingen spädning GI 500 599: Tillsätt 1,0 ml 12B Medium GI 600 699: Tillsätt 1,5 ml 12B Medium GI 700 799: Tillsätt 2,0 ml 12B Medium GI 800 899: Tillsätt 2,5 ml 12B Medium GI 900 998: Tillsätt 3,5 ml 12B Medium Blanda noga före användning. Undvik flaskor som avläses över 999, dessa har passerat toppvärdet för tillväxtindex. Inokulation av testen a. Rengör locken på alla odlingsflaskor med en 70-procentig alkoholtork innan en spruta sätts in. b. Blanda testkulturen grundligt i 12B Medium med en 1,0 ml tuberkulinspruta med en permanent fastsatt nål. c. Tillsätt 0,1 ml av detta inokulat i kontrollflaskan och PZA-flaskan. KONTROLLODLINGEN FÅR EJ SPÄDAS enligt rekommendationerna för andra läkemedel (t.ex. isoniazid, streptomycin, etambutol, rifampin, etc.). d. Desinficera locket på gummimembranet med ett lämpligt desinfektionsmedel och rengör med en 70- procentig alkoholtork. OBS! Var försiktig vid hanteringen av flaskorna under testens gång. Flaskornas membran kan kontamineras med organismer från odlingen. Inkubering och testning a. Alla inokulerade flaskor (inklusive kontrollflaskor) skall testas på BACTEC 460TB-instrumetet före inkubering för att säkerställa en atmosfär med 5 % CO 2. Om detta har gjorts tidigare kan flaskorna testas omedelbart efter inokulationen. b. Alla flaskor skall inkuberas vid 37 C ± 1 C. c. Testa PZA och kontrollflaskorna dagligen på BACTEC 460TB-instrumentet tills tillväxtindex når 200 eller mer. Kvalitetskontroll Odlingsflaskorna FÅR EJ användas efter utgångsdatum. Använd inte flaskor som är spruckna eller defekta. Kassera flaskor på tillämpligt sätt. För information om kvalitetskontroll för BACTEC 460TB-instrumentet hänvisas till användarhandboken för BACTEC 460TB och 460. Som med alla andra resistensbestämningar för läkemedel är inokulatets kvalitet av avgörande betydelse. Använd endast aktivt växande kulturer i 12B Medium med tillämplig spädning. Under ideala förhållande skall kontrollens tillväxtindex vara 200 inom 4 till 7 dagar. Om tillväxtindex i kontrollen når 200 inom mindre än 4 dagar indikerar det att inokulatet är för tungt. Denna test skall upprepas såvida resultaten inte är mycket tydliga. Om tillväxtindex för kontrollen inte når 200 förrän efter mer än 7 10 dagar visar det på dålig inokulatkvalitet (t.ex. låg viabilitet, låg initial GI-avläsning av inokulatet eller felaktig spädning) och testresultaten kan bli felaktiga. Tillväxtindex i flaskorna med kontroll och läkemedel skall följas noggrant tills mycket tydliga resultat erhålls. Om resultaten är tvivelaktiga skall testen upprepas. Om tillväxtindex i flaskan med läkemedel ligger mycket nära 10 % av tillväxtindex i kontrollen skall flaskorna testas ytterligare 1 3 dagar. Detta kommer att vara till hjälp vid bedömning av testodlingens resistensmönster. Om resultaten inte kan tolkas skall testen upprepas med ett isolat som odlats i färskt BACTEC 12B Medium (Kat. nr. 442004). Använd alltid H37Rv (ATCC 27294) som känslig kontroll och H37Rv PZA-R (ATCC 35828) som resistent kontroll. 3
Kvalitetskontroll måste utföras i enlighet med gällande bestämmelser eller ackrediteringskrav samt laboratoriets etablerade procedurer för kvalitetskontroll. Det rekommenderas att användaren konsulterar tillämpliga NCCLSriktlinjer och CLIA-föreskrifter för lämpliga kvaliteskontrollförfaranden. TOLKNING AV RESULTAT Instrumentet avläses direkt på en tillväxtindexskala på 0 999. Tillväxtindex är egentligen ett mått på organismernas metaboliska aktivitet i mediet. När tillväxtindex i kontrollflaskan når 200 eller mer skall resultatet tolkas enligt följande: GI i flaskan med läkemedel är < 9 % av GI i flaskan med kontroll = Känslig GI i flaskan med läkemedel är > 11 % av GI i flaskan med kontroll = Resistent GI i flaskan med läkemedel är mellan 9 % och 11 % (inberäknat) av GI i flaskan med kontroll = Borderline METODENS BEGRÄNSNINGAR Tillväxtindexsiffran reflekterar den hastighet och mängd av tillväxt som förekommer i mediet, men kan inte användas för att kvantifiera kolonibildande enheter per ml. Kolonimorfologi och pigmenteringsegenskaper kan endast bestämmas på fasta medier. Ett gränsvärde på cirka 10 % skall användas som en ungefärlig uppskattning av resistens eller känslighet grundat på GI-resultat. BACTEC PZA resistensbestämning rekommenderas endast för isolat av M. tuberculosis-komplexet. Annan användbarhet hos PZA eller resistensbestämningsmetoden för andra mykobakterier än tuberkulos (MOTT) har inte fastställts. FÖRVÄNTADE VÄRDEN Det bör ske en gradvis ökning av tillväxtindex i kontrollflaskan. I provflaskan kommer tillväxtindex att vara konstant, eller det kommer att öka eller minska beroende av testorganismernas känslighet (se exempel 1 och 2). Vanligtvis erhålls BACTEC-resultat inom 4 till 7 dagar. Det kan dock ibland ta längre tid att uppnå resultat med långsamt växande odlingar. Tolka inte resultaten förrän efter 4 dagar och inte efter mer än 21 dagar. Exempel #1: PZA-resistens Dagliga avläsningar av tillväxtindex GI läkemedel 1 2 3 4 5 GI kontroll % Resultat: Kontroll 9 31 74 195 475 4 x 100 = 0,8 % Känslig Läkemedel 6 9 9 9 4 < 9 % 475 Exempel #2: PZA-resistens för dagliga avläsningar av tillväxtindex Dagliga avläsningar av tillväxtindex GI läkemedel 1 2 3 4 5 6 7 GI kontroll % Resultat: Kontroll 7 28 41 70 120 177 282 244 x 100 = 86,5 % Resistent Läkemedel 17 29 40 68 92 157 244 > 11 % 282 KLINISKA PRESTANDA Baserat på ett modifierat 7H12-medium vid ph 6,0 är den radiometriska BACTEC 460TB-tekniken hittills den enda odlingsbaserade metoden för PZA-resistensbestämning som rekommenderas av National Committee for Clinical Laboratory Standards. 14,15 I en studie av Pfyffer et al. resulterade PZA-resistensbestämning mot M. tuberculosis i en större övertensstämmelse än 96 %, vid en jämförelse av BACTEC 460TB PZA medium och läkemedel och BACTEC MGIT 960 PZA medium och läkemedel. Medelomsättningstiden för BACTEC 460TB PZA-testen var 5,4 dagar, ej inräknat den tid som krävdes för att erhålla en radiometrisk fortsatt odling med ett tillväxtindex på 200. 14 Tillgänglighet Kat. nr. Beskrivning 442139 BACTEC PZA Test Medium Culture Vials, 4 ml, kartong med 10 st. 442143 BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 tester) 442004 BACTEC 12B Medium 445203 BACTEC 460TB Instrument 4
REFERENSER 1. Gross, W. M. and J.L. Hawkins, 1985. Radiometric selective inhibition test for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacteria bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21:565-568. 2. Middlebrook, G. et al. 1977 Automatable radiometric detection of growth of Mycobacterium tuberculosis in selective media. Amer. Rev. Resp. Dis. 115:1066-1069. 3. Roberts, G.D. et al. Evaluation of the BACTEC radiometric method for recover of mycobacteria and drug susceptibility testing of M. tuberculosis from acid-fast smear positive specimens. J. Clin. Microbiol. 18:689-696. 4. Siddiqi, S.H. et al. 1981. Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 13:908-912. 5. Butler, W.R. and J.O. Kiburn. 1982 Improved method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide. J. Clin. Microbiol. 16:1106-1109. 6. Heifets, L.B. and M. D. Iseman, 1985. Radiometric method for testing susceptibility of mycobacteria to pyrazinamide in 7H12 broth. J. Clin. Microbiol. 21:200-204. 7. Woodley, C.L. and R. W. Smithwick, 1988. Radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in egg yolk enriched BACTEC 12B medium. Antimicrob. Agents Chemother. 32:125-127. 8. Salfinger, M. and L. Heifets, 1988. Determination of pyrazinamide MICs for Mycobacterium tuberculosis at different ph s by the radiometric method. Antimicrob. Agents Chemother. 32:1002-1004. 9. Salfinger, M. et al. 1989. Rapid radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Res. Microbiol. 140:301-309. 10. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 11. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80. 12. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 13. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045. 14. Pfyffer, G.E., F. Palicova and S. Rüsch-Gerdes. 2002. Testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide with the nonradiometric BACTEC MGIT 960 System. J. Clin. Microbiol. 40:1670-1674. 15. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Tentative standard M24-T2. Susceptibility testing of mycobacteria, nocardia and other aerobic actinomycetes, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 5
6
Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland 21152 USA 800-638-8663 BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: 353-61-47-29-20 Fax: 353-61-47-25-46 ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BACTEC, Luer-Lok and MGIT are trademarks of Becton, Dickinson and Company. 2007 BD.