Linköpings universitet 2014-02-19 Cellskada och manipulering av cellers känslighet för stress Henrik Lindholm, Ebba Bagge, Mariel Nehme, Moa Bydén, Julia Dahlgren Solberg, Felicia André, Mustafa Al-Attar, Daniel Duchen
Bakgrund Celler anpassar ständigt sin struktur och funktion beroende på ändrade krav och etracellulär stress. Sådan stress kan vara kemikalier, ischemi, strålning, kyla eller hetta. Om stressen överstiger den adaptiva förmågan, eller om den yttre stressen är väldigt skadlig för cellen kan en cellskada utvecklas. Om stressen är alltför svår, är bestående eller utvecklas väldigt snabbt blir resultatet en irreversibel cellskada som orsakar celldöd. Oidativ stress är en vanlig cellstress som orsakas av fria radikaler. Fria radikaler bildas normalt som en restprodukt i elektrontransportkedjan i cellens mitokondrier och även i cellernas peroisomer. Vanligtvis neutraliseras de fria radikalerna av antioidanter i cellen, men om mängden fria radikaler överstiger cellens neutraliseringskapacitet kan cellskador, så som oidation av lipider (till eempel lipidperoidering av cellmembran), DNA och proteiner uppstå. Blir den oidativa stressen för stor leder det till celldöd. Metalljoner så som järnjoner har förmågan att generera hydroylradikaler genom Fentonreaktionen där järnjonen reagerar med väteperoid. H 2 O 2 + Fe 2+ HO + OH - + Fe 3+ Om koncentrationen av fria metalljoner hålls låg minskar därför bildandet av fria radikaler i cellen. Oidering av cellmembranens fosfolipider genererar aldehyder, eempelvis malondialdehyd (MDA) och 4-hydroyalkener (HAE). Dessa kan påvisas med en spektrofotemer (vid våglängd 586nm) efter att reagerat med N-methyl-2-phenylindole (R1) och bildat ett stabilt kromoforkomple. Hypotes Vid Fentonreaktionen bildas fria radikaler och det blir en oidativ stress. Därför borde tillsats av järn och väteperoid, men även tillsats av endast järn då cellerna själva genererar väteperoid, orsaka oidativ stress hos cellerna. Tillsats av järnkelerare borde minska den oidativa stressen cellerna utsätts för då järnkeleraren binder upp järnet och därmed hindrar det från att medverka i Fentonreaktionen. Tillsats av antioidanter borde precis som järnkeleraren minska den oidativa stressen då det neutraliserar de fria radikalerna. För att undersöka hypoteserna om hur olika modulatorer påverkar den oidativa stressen cellerna utsätts för läggs undersökningen upp enligt följande kombinationer. 1
Tabell 1: Försöksupplägg. Skål 1-5 används som kontroll. Skål Väteperoid Järn Järnkelerare Antioidant 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Material - 20 cellodlingsskålar med UT-SCC-77 (cellinje från humant skivepitel) och näringsmedium - N-acetylcystein (antioidant) - Järnjoner -Desferrioamin (järnkelerare) - Pipetter - Pasteurpipetter - Väteperoid utspädd med PBS - PBS -Triklorättiksyra, TCA - Cellskrapa 2
Metod 1. Tillsats av modulatorer De olika modulatorernas volym beräknades och pipetterades till cellodlingsmediet i skålarna enligt försöksupplägget (se tabell 1). Totalt iordninggjordes 20 cellodlingsskålar för att få två uppsättningar av varje vald kombination till efterföljande studier. För att beräkna den volym av varje modulator som skulle tillsättas användes följande formel: Tabell 2 Modulator där c 1 = stamlösningens koncentration v 1 = volym modulator som ska tillsättas c 2 = slutkoncentration v 2 = slutvolym Stamlösning Slutkoncentration Volym som ska tillsättas (v 1 ) Järn (FeCl 3 ) 30 mm 30 µm 2 µl Desferal 100mM 1 mm 20 µl N-acetylcystein (NAC) 1 M 1 mm Slutvolymen (v 2 ) i denna laboration ska vara 2 ml medium i varje skål. Se bilaga 1 för beräkningar. Cellerna inkuberades sedan i ett cellodlingsskåp som efterliknar kroppens miljö (37 o C, 5% CO 2 ) till nästkommande dag. Dessutom studerades apoptotiska cellers kärnmorfologi med hjälp av i förväg preparerade prover (för olika kombinationer av modulatorer och oidativ stress) i en fluorescencemikroskop. Proverna var fierade och DAPI (4-6-diamidino-2-fenylindol) var tillsatt för att, genom inbindning till A-T-rika områden i DNA, färga cellernas kärnor. De prover som motsvarade försöksupplägget i denna laboration valdes ut och de olika provens apoptosfrekvens beräknades i procent. 2 µl 3
Bild 1: Mikroskopisk bild av celler infärgade med DAPI. Även nekrotisk celldöd studerades, och då med hjälp av infärgning med Tryptanblått. Celler som gått i nekros färgas in och ses som blå i ljusmikroskop. Infärgningen beror på att cellmembranen hos de nekrotiska cellerna inte längre är intakta. Slutligen undersöktes järninnehåll i celler som i förväg behandlats med olika kombinationer av modulatorer och oidativ stress. Färgen Prussian blue färgar celler som innehåller järn blå, och för att öka visualiseringen av cellerna är de även färgade röda. Frekvensen celler med järninnehåll beräknades i procent utifrån ljusmikroskopiska bilder. Bild 2:Mikroskopisk bild av celler infärgade med Prussian blue. 4
2. Eponering för väteperoid inför undersökning av ATP samt lipidperoidering En uppsättning skålar, det vill säga 10 stycken, togs följande dag ut ur cellodlingsskåpet. Mediet pipetterades bort och ersattes med 1000 µl väteperoid i skål 4, 6, 7, 8, 9 och 10, enligt Tabell 1. I resterande skålar byttes mediet ut mot 1000 µl PBS. Cellerna inkuberades sedan en timme i cellodlingsskåpet. Därefter pipetterades den tillförda vätskan bort för att ersättas med 500 µl TCA (triklorättiksyra) för att lysera cellerna till efterföljande ATP-mätning, eller 200 µl vatten till efterföljande lipidperoideringstest. En cellskrapa användes sedan för att lossa cellerna från odlingsskålen, och med hjälp av en pipett flyttades celler och vätska över till numrerade Eppendorfrör. De tjugo rören frystes sedan in (i -70 o C) för senare analys i steg 3 och 4 av laborationen. 3. ATP-analys Till tio nya provrör tillsattes 780 µl Tris-EDTA buffert. Ett av dem sattes i luminometern för att ange buffertens bakgrundsvärde. Till dessa provrör pipetterades sedan 200 µl ATP-reagens. Sedan tillsattes 20 µl från de tidigare nedfrysta Eppendorfrören till vardera provrör. Provrören sattes sedan en åt gången i luminometern varav ett värde (I prov ) för varje provrör uppmättes. Därefter tillsattes 10 µl ATP-standard till varje rör för att sedan vorteas igen. Provrören placerades sedan än en gång i luminometern för att mäta upp nya värden (I prov+std ). Med hjälp av dessa värden räknades sedan ATP-innehållet (ATP prov ) ut med följande formel: ATP prov = 10-7 I prov / (I prov+std I prov ) 4. Mätning av lipidperoidering 2 µl av MDA-standardstamlösning späddes med 1000 µl vatten. Spädningen användes sedan för att bereda se olika Eppendorfrör med olika koncentration MDA genom att tillsätta vatten. Varje rör innehöll 200 µl lösning där förhållandet mellan andelen vatten och spädningen av MDAstandard varierades enligt Tabell 3. En standardkurva kunde då tas fram, se Diagram 4. Denna användes sedan för att beräkna MDA-R1-komplekoncentrationen utifrån absorbansvärdena som erhölls vid spektrofotometri. Tabell 3 Koncentration (µm) 0 0,5 1 2 3 4 MDA-standard (µl) 0 25 50 100 150 200 Vatten (µl) 200 175 150 100 50 0 5
100 µl tinat prov, från vardera Eppendorfrör som frystes ned i steg 2, pipetterades till 10 nya Eppendorfrör. Reagens (R1) späddes med diluent och från denna blandning tillsattes 325 µl till varje Eppendorfrör och även till de se proven som utgjorde standardkurvan. 75 µl reagens (R2) tillsattes till varje Eppendorfrör. Eppendorfrören inkuberades i värmeblock, 45 o C, i 45-60 min. Dessa centrifugerades sedan i 10 min för att bli av med cellrester som annars kan störa vid mätning. 2150 µl (dubbelprover) supernatant överfördes från varje prov (prover och standardkurva) till en 96-hålsplatta för spektrofotometeri. Därefter mättes absorbansen. Koncentration MDA-R1-komple beräknades i proverna utifrån standardkurvan. Se Diagram 5. Resultat Tabell 4: Beräkning av andel celler som gått i apoptos utifrån fotografier tagna med fluorescensmikroskop av olika cellodlingsskålar med samma förutsättningar som i denna studie. Se diagram 1. Modulatorer Totalt antal celler Antal döda celler Antal döda celler i procent Enbart celler 65 4 6 % NAC 56 2 4 % Desferal 70 4 6 % Järn 63 9 14 % Väteperoid 32 25 78% NAC + väteperoid 32 13 41% Desferal + väteperoid 72 8 11 % Järn + väteperoid 7 7 100 % Desferal + järn + väteperoid 51 13 25 % NAC + järn + väteperoid 9 6 67% 6
Diagram 1: Mortalitet hos celler i procent Diagram 2: Järninnehåll hos celler i procent 50% 40% 30% 20% 10% Andel celler med järn 0% Järn Järn+Antioidant Järn+Järnkelerare Kontroll 7
Absorbans Basgrupp 6 Diagram 3: Beräkning av ATP i cellprover Diagram 4: Standardkurva från steg 4. Koncentration MDA 8
Diagram 5: Koncentration MDA-R1-komple i cellproverna beräknat med hjälp av standardkurvan. 9
Diskussion Utifrån resultaten ses tydligt att addition av modulatorkombinationer (NAC, järnkelerare, järn) enligt försöksupplägget gav resultat som överensstämde väl med den uppsatta hypotesen. Addering av järn och väteperoid visade sig ge den största oidativa stressen och därav störst celldöd vilket bekräftades av den låga koncentrationen, 20 µm, vid ATP-mätningen, hög koncentration av MDA (hög lipidperoidering) och 100 % mortalitet vid okulär cellräkning med hjälp av flouroscensmikroskopiska bilder. I fall då endast järn eller endast väteperoid tillsatts kunde viss oidativ stress uppmätas då ATPnivån för dessa prov var betydligt lägre än kontrollen (endast celler). Vid tillsats av enbart järnkelerare eller antioidant tillsammans med väteperoid uppmättes mindre oidativ stress med järnkelerare än med antioidant. I cellprover med endast antioidant eller järnkelerare, mättes liknande ATP-mängd som i kontrollprovet med endast celler. Att antioidant skyddar sämre än järnkelerare förstås även från MDA-analysen, då kombinationer med antioidant gav högre koncentration MDA än kombinationer med järnkelerare. Dessa resultat överensstämmer även med resultaten från räkningen av de apoptotiska cellerna. Anledning till detta skulle kunna vara en minskad frekvens utav Fentonreaktioner när järnkelerare binder järn kontra antioidanter som istället neutraliserar fria radikaler. Orsaken till att järnkeleraren skyddade bättre än antioidanten vid test av lipidperoidering beror troligen på att NAC, antioidanten som användes, är en mestadels vattenlöslig(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15122653). Detta gör att den inte är fullt närvarande i cellmembranet som skydd mot lipidperoidering, vilket har en effekt på resultatet. Hade istället en fettlöslig antioidant används i försöket hade lipidperoidering skett i mindre grad. De felkällor som eventuellt finns har i sådana fall inte påverkat resultaten i någon större grad. Felkällor som kan finnas i denna undersökning kan vara: - Att en pipettspets lossnade från en automatpipett vid tillsats av Desferal till skål 7 i steg 1. Det skulle eventuellt kunnat leda till skadade celler och att modulatorn inte adderades korrekt till cellodlingsskålen. - Att det i en skål tillsattes 18+2 µl Desferal istället för 20 µl Desferal direkt. - Att det finns felberäkning av celler på bilderna från fluorescensmikroskopet. - Mänskliga faktorer. 10
Medicinsk tillämpning N-Acetylcystein (NAC) motverkade inte mortalitet i jämförelse med celler som saknade denna antioidant. Detta kan tyda på att den mängd reaktiva syreradikaler som bildas faller inom cellens naturliga motståndskraft mot oidativ stress. Vid tillsats av väteperoid så kan istället en gynnsam antioidativ effekt ses, samt lägre mortalitet, i jämförelse med prov där enbart väteperoid tillsattes. Fördelaktigheten hos antioidanter är svår att bestämma, då vi inte vet den mängd syreradikaler som bildas, men de skulle kunna vara gynnsamma i celler där ökat krav på ATP-produktion finns; till eempel i muskelceller under arbete. Det kan eventuellt ha positiv effekt att addera antioidanter i de fall där den oidativa stressen överstiger cellens naturliga motståndskraft, då de verkar genom att oskadliggöra de fria radikaler som cellen själv inte klarar av att neutralisera. Järnkelerare gav en signifikant mindre mortalitet hos celler i jämförelse med det prov med adderad väteperoid. Intag av järnkelerare i syfte att motverka oidativ stress kan inte rekommenderas då den systemiska effekten inte är studerad. Järnkelerare används generellt vid järnförgiftning där en stor etramängd av järn finns i blodomloppet. Intag av järnkelerare vid normala järnnivåer skulle eventuellt kunna innebära kompetitiv effekt med transferrin vid järninbindning, till den grad att järnet inte finns tillgängligt för bildandet av heme, vilket då skulle kunna leda till anemi. Referens: FASS 2013 11
Bilaga 1 Beräkningar FeCl 3 M M Desferrioamin (Desferal) M M NAC M M 12