Kromatografi Separation genom olika distribution av molekyler mellan en mobil fas och en stationär fas LC-Vätskekromatografi (oftast vattenbaserade system) Kolonner vanligast men andra system finns Separationsprincip Storlek, form Nettoladdning/laddning pi Hydrofobicitet Biologisk funktion Antigenicitet Sockerinnehåll Svavelinnehåll (Cys) Kromatografimetod Gelfiltrering Jonbyte Kromatofokusering HIC/RPC Affinitet Immunoadsorbtion Lectin affinitet Kovalent kromatografi!stationärfasen (1) Oftast mer än 90% av kolonnvolymen Vanligast med kulformade partiklar, d=2-100µm Xerogeler-sväller i vatten (ex. dextran, akrylamid) Aerogeler opåverkade (ex. glas, silika) Önskvärda egenskaper: Hydrofil Ingen egen affinitet till proteiner Derivatiserbar Stabil i extrema förhållanden Tåla höga flöden Möjlig att producera med olika porositet & partikelstorlek
Stationärfasen (2) Oorganiska material Silika Glas Hydroxyapatite Organiska polymerer Syntetiska Polyakrylamide Polymetacrylate Polystyren Polysackarider Cellulosa Dextran Agarose Stationärfasen (3) Microporous Korskopplad dextran, polyakrylamid Små porer Ideala för gelfiltrering Mjuka, tål endast låga flöden Macroporous Aggregerade och korskopplade polymerer (agarose, polyakrylamid, silika ) Större porer Lämpliga för adsorptionskromatografi Kompositgeler, bestående av macroµ kan ge geler med bra egenskaper
Stationärfasen (4) Införande av aktiva grupper Jonbytesgeler En enstegsprocess Oftast halogenid med den laddade gruppen som reagerar med matrisen i basiska förhållanden Affinitetsmatriser Oftast trestegsprocess Aktivering av matrisen Koppling av liganden Blockering av resterande aktiva grupper Ligand-protein-interaktioner 1) Jon-jon-interaktioner eller jon-dipol-bindningar 2) Vätebindningar 3) Van der Waalskrafter 4) "-" interaktioner 5) Hydrofoba interaktioner 6) Kovalenta interactioner (S-S)
Interaktioner Negativa laddningar Hydrofoba ytor Positiva laddningar Yta med specifik affinitet Retentionsparametrar Retentionsfaktor: Retardationsfaktor: k= V R V 0-1 R F = V o V R V 0 # volymen av mobilfasen N; antalet bottnar H; bottenhöjden N=5.55 t R eller V R ( t R ) 2 W1/2 W 1/2 W b h p 2 h p N=16 t ( R ) 2 H = L W b N N=6.28 t ( R ) 2 A p
Van Deemter-kurvan H Cu A u B/u H = A B Cu u A, beror av matrisens geometri (strömvirvlar->breddning) B, beror av diffusionen C, beror av den hastighet som molekylerna distribueras med Perfusionskromatografi, stora porer som går genom hela partikeln, snabbare flöden möjliga ty transporten in i porerna blir ej diffusionsberoende, C blir lågt Upplösning R s = 1 2 t R2 - t R1 (w b1 w b2 ) R s är beroende av: Selektiviteten Retentionen Antalet bottnar t R1 t R2 Rent praktiskt: Matrisens egenskaper Kolonnens längd Flödeshastigheten Buffertsammansättning w b1 w b2
Adsorption [PS] [S]=Q: antalet tillgängliga platser [PS] bundet K= [PS] [P][S] Ofta behöver man även ta hänsyn till tävlande molekyler. [PS] [ES]=Q [P] i lösning Langmuirs adsorbtions isoterm: [PS]= Q K [P] 1 K[P] Eluering Isokratisk eluering Samma buffert hela tiden Gradienteluering Buffertens sammansättning förändras över tiden Kompetitiv eluering En tillsatt molekyl får tävla med målproteinet om platserna på matrisen
Kapacitet Nominell kapacitet Hur många (teoretiska) platser det finns på matrisen Dynamisk kapacitet Hur mycket gelen binder upp i det tänkta fallet! Beroende av: Målprotein Sammansättningen i råextraktet Buffertsammansättning Flödeshastigheten Gelfiltrering, innan du börjar Vilken buffert behöver matrisen tåla? De flesta matriserna tål ph 2-10 (finns även de som tål upp till ph 14) Silika tål ej höga phn < 8 Vilken upplösning behövs? avsaltning<preparativ rening<analytiska applikationer partikelstorlek 5-50 µm (mindre partiklar->bättre upplösning) Flera matriser kan blandas eller packas på varandra Hur mycket och vad fastnar på matrisen? Icke-specifika interaktioner Ändringar i mobilfasen kan påverka proteinet (15 ms/cm brukar vara bra) Provvolymen: 1-2% av bäddvolymen för 100 µm-partiklar, ännu mindre volym för mindre partiklar
Avsaltning Stor skillnad i storlek på de substanser som ska separeras Större frihetsgrader. Höga flöden Stora provvolymer >30% av bäddvolymen Proteinfraktionering Bäst separation då kontaminanterna vandrar i voiden Mindre än 30% skillnad i storlek, svårt att separera Stor porvolym och hög selektivitet önskvärt Stor kolonnarea -> stor provvolym kan laddas För att öka processiviteten, nytt prov kan laddas vid Vt
Storleksuppskattning mha GF Beroende av molekylens form Kallibrering med molekyler som har samma form logm stav sfär K D = V R-V 0 V i K D ; distributionskoefficient V 0 ; voidvolym V R ; retentionsvolym porvolym; V i = V t - V 0 K D Kromatofokusering ph 7.3 ph 7.4 ph 7.5 ph 7.6 ph 7.7 - - - - - - - - - - - - - repelleras snabb förflyttning binder till matrisen
Kromatofokusering Hög upplösning ph-gradienten bildas mha en jvt-buffert (högt ph) som sedan ersätts av en kromatofokuseringsbuffert (anjonbyte), polyamfolyter Den stationära fasen måste ha laddade grupper som inte titreras i det tänkta ph-intervallet Precipitering - ett problem Kan undvikas genom att proteinerna har en nettoladdning då de binder till matrisen Ökad jonstyrka kräver högre laddning för inbindning, detta påverkar dock ph-gradienten. Om proteinet faller kan det lösas upp igen då pht stiger Urea eller detergenter kan inkluderas i bufferten