Kromatografimetod. Separation genom olika distribution av molekyler mellan en mobil fas och en stationär fas

Relevanta dokument
Kromatografi. Kromatografi

Jonbyteskromatografi

Downstream Processing

BASÅRET KEMI B BIOKEMI VT PROTEINER OCH ENZYMER (sid )

Isolering och rening av proteinet tiopurinmetyltransferas

KEM M06. Analytisk kemi Avancerad kurs 15 hp HT 09. Av Lars Erik Andreas Ehnbom. Föreläsare Dr. Margareta Sandahl Prof.

Kromatografi. Den kromatografiska processen. Fördelar med HPLC - (utförs under högt tryck ca 400 Bar) Vätskekromatografi. Olika former av LC

Introduktion till laboration Biokemi 1

Proteiner. Biomolekyler kap 7

Aktivt kol från rötslam

Analytisk kemi. Kap 1 sid 15-22, Kap 9 sid

Lite basalt om enzymer

Preparation och spektroskopisk karakterisering av Myoglobin

Proteinstruktur samt Hemoglobin

TENTAMEN. Analytisk kemi (KD1120),

Intermolekylära krafter

Intermolekylära krafter

Högupplösande vätskekromatografi (HPLC) Niklas Dahrén

TENTAMEN. Analytisk kemi (KD1120),

Rening av proteiner: hur och varför?

Rening, inmärkning och användning av ett målprotein

Proteiner. Biomolekyler kap 7

TENTAMEN KEMISK MÄTTEKNIK (KD1190/1110),

Skrivning i termodynamik och jämvikt, KOO081, KOO041,

Gaskromatografi (GC) Niklas Dahrén

DNA-labb / Plasmidlabb

Kromatografi. Idag

Kromatografi. Kromatografi. Kromatografi. Användningsområde. Den kromatografiska processen. Typer av kromatografi. Separation.

Tentamen i Analytisk kemi II,

Preparation av hemoglobin med hjälp av gelfiltrering

Tentamen i KFKF01 Molekylära drivkrafter 2: Växelverkan och dynamik, 3 juni 2019

PATENTBESVÄRSRÄTTENS DOM

Analysera gifter, droger och läkemedel med högupplösande vätskekromatografi (HPLC) Niklas Dahrén

Introduktion till labkursen på Biokemi 1

4. VÄTSKEKROMATOGRAFI

Glattmuskel laboration

Från DNA till protein, dvs den centrala dogmen

Fö. 11. Bubblor, skum och ytfilmer. Kap. 8.

Transkription och translation. DNA RNA Protein. Introduktion till biomedicin Jan-Olov Höög 1

Från DNA till protein, dvs den centrala dogmen

Utveckling av reningsmetod för cytokrom c-id1 från Ideonella dechloratans

Felveckning och denaturering av proteiner. Niklas Dahrén

Analysera gifter, droger och läkemedel med gaskromatografi (GC) Niklas Dahrén

Institutionen för laboratoriemedicin Bilaga 2 Biomedicinska analytikerprogrammet Analytisk Kemi och Biokemisk metodik Ht 2010, Termin 3

Biologiska membran Kap 10 fig10-1, 15, 18, 19 & med tillhörande beskrivningar. Övrigt är repetition.

Jonisering. Hur fungerar jonisering? Vad är en jon?

Hur en stoppar en handbollsplan i ett snapsglas. Emma Björk Nanostrukturerade material

Organiska föreningar Kokpunkt och löslighet. Niklas Dahrén

Proteinstruktur och Hemoglobin

Kemiteknologsektionen. Plugghäfte KTKK105. Lite studiehjälp för kursen yt- och materialkemi. Linus Ögren. Del 1 av 2 Yt- och kolloidkemi.

Expression, produktion och rening av Fatty acid binding protein (FABP) från ökenmyran Cataglyphis fortis

Tentamen. TFYA47 Ytor och gränsskikt, TEN2 5 januari 2017 kl Skrivsal: TER3

Proteiner Äggvitan består av proteinet ovalbumin. Farmaceutisk biokemi. Insulin är ett proteinhormon. Gly. Arg. Met. Cys. His. Gly.

Kap. 8. Kolloidernas stabilitet

TENTAMEN KEMISK MÄTTEKNIK (KD1110),

van der Waalsbindningar (London dispersionskrafter) Niklas Dahrén

Delprov Dugga med svarsmallar Biokemi BI0968, 8:e dec 2008, Max poäng = 50 p. Preliminära betygsgränser: 3 = 27p; 4 = 35p; 5 = 43p.

Allmän Kemi 2 (NKEA04 m.fl.)

OLIKA SLAGS LÖSNINGAR

Kvalitativ analys. Kvantitativ analys. Biokemisk analys och separationsteknik. GLP = Good Laboratory Practice. GMP = Good Manufacturing Practice

Tentamen KFKF01,

1 Tror du reaktionen nedan är momentan eller ej? Motivera. 1p S 2 O H + S(s) + SO 2 (g) + H 2 O(l)

Repetition kemi och instuderings/övningsfrågor

För godkänt resultat krävs 20 p och för väl godkänt krävs 30 p. Max poäng är 40 p

Laborationsrapport glattmuskel basgrupp 7

Hierarkisk proteinstruktur. Hierarkisk proteinstruktur. α-helix Fig 3-4. Primärstruktur Fig 3-3

Analysera gifter, droger och andra ämnen med HPLC och GC. Niklas Dahrén

Introduktion. Introduktion Farmakodynamiska aspekter Farmakokinetiska aspekter Interaktioner

BIOKEMISKA SEPARATIONSMETODER - EN ÖVERSIKT

KEMI 1 MÄNNISKANS KEMI OCH KEMIN I LIVSMILJÖ

Introduktion till kemisk bindning. Niklas Dahrén

TENTAMEN. Analytisk kemi (KD1120),

5. Transkriptionell reglering OBS! Långsam omställning!

Cellbiologi: Intracellulär sortering och cellsignalering

Kap. 8. Bindning: Generella begrepp

TENTAMEN. Analytisk kemi (KD2010),

Dipol-dipolbindning. Niklas Dahrén

Porösa Material och Kemiska Ytmodifieringar

Van der Waalsbindning (Londonkrafter) Niklas Dahrén

Lim Klubbmaterial för åk 4-6 Anna Karin Jern och Berit Kurtén-Finnäs

Den elektrokemiska spänningsserien. Niklas Dahrén

c) Hur förskjuts jämvikten av en tryckförändring? Motivera svaret. (2) Jämvikten förskjuts åt vänster om trycket ökar:

Enzymer Farmaceutisk biokemi. Enzymet pepsin klyver proteiner i magsäcken till mindre peptider

Den elektrokemiska spänningsserien. Niklas Dahrén

Vattenavvisande impregnering - material och utförande. CBI Betonginstitutet

Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området

Fysik TFYA68 (9FY321) Föreläsning 6/15

Farmakodynamik och Farmakokinetik

Frå n åminosyror till proteiner

Polära och opolära ämnen, lösningsmedel och löslighet. Niklas Dahrén

Kap. 7. Laddade Gränsytor

Laboration Enzymer. Labföreläsning. Introduktion, enzymer. Kinetik. Första ordningens kinetik. Michaelis-Menten-kinetik

KEMISK TERMODYNAMIK. Lab 1, Datorlaboration APRIL 10, 2016

Allmän kemi. Läromålen. Viktigt i kapitel 11. Kap 11 Intermolekylära krafter. Studenten skall efter att ha genomfört delkurs 1 kunna:

Tentamen KFKF01,

Tentamen i Immunteknologi 29 maj 2002, 8-13

Modellbaserad processutveckling för Läkemedelsindustrin

{ { De fyra naturkrafterna. Intermolekylära krafter, ytkrafter & Atomkraftmikroskopet (AFM) Kraft- och potentialkurvor

Processer att beakta i de förorenade massorna

Jonföreningar och jonbindningar del 1. Niklas Dahrén

Transkript:

Kromatografi Separation genom olika distribution av molekyler mellan en mobil fas och en stationär fas LC-Vätskekromatografi (oftast vattenbaserade system) Kolonner vanligast men andra system finns Separationsprincip Storlek, form Nettoladdning/laddning pi Hydrofobicitet Biologisk funktion Antigenicitet Sockerinnehåll Svavelinnehåll (Cys) Kromatografimetod Gelfiltrering Jonbyte Kromatofokusering HIC/RPC Affinitet Immunoadsorbtion Lectin affinitet Kovalent kromatografi!stationärfasen (1) Oftast mer än 90% av kolonnvolymen Vanligast med kulformade partiklar, d=2-100µm Xerogeler-sväller i vatten (ex. dextran, akrylamid) Aerogeler opåverkade (ex. glas, silika) Önskvärda egenskaper: Hydrofil Ingen egen affinitet till proteiner Derivatiserbar Stabil i extrema förhållanden Tåla höga flöden Möjlig att producera med olika porositet & partikelstorlek

Stationärfasen (2) Oorganiska material Silika Glas Hydroxyapatite Organiska polymerer Syntetiska Polyakrylamide Polymetacrylate Polystyren Polysackarider Cellulosa Dextran Agarose Stationärfasen (3) Microporous Korskopplad dextran, polyakrylamid Små porer Ideala för gelfiltrering Mjuka, tål endast låga flöden Macroporous Aggregerade och korskopplade polymerer (agarose, polyakrylamid, silika ) Större porer Lämpliga för adsorptionskromatografi Kompositgeler, bestående av macro&micro kan ge geler med bra egenskaper

Stationärfasen (4) Införande av aktiva grupper Jonbytesgeler En enstegsprocess Oftast halogenid med den laddade gruppen som reagerar med matrisen i basiska förhållanden Affinitetsmatriser Oftast trestegsprocess Aktivering av matrisen Koppling av liganden Blockering av resterande aktiva grupper Ligand-protein-interaktioner 1) Jon-jon-interaktioner eller jon-dipol-bindningar 2) Vätebindningar 3) Van der Waalskrafter 4) "-" interaktioner 5) Hydrofoba interaktioner 6) Kovalenta interactioner (S-S)

Interaktioner Negativa laddningar Hydrofoba ytor Positiva laddningar Yta med specifik affinitet Retentionsparametrar Retentionsfaktor: Retardationsfaktor: k= V R V 0-1 R F = V o V R V 0 # volymen av mobilfasen N; antalet bottnar H; bottenhöjden N=5.55 t R eller V R ( t R ) 2 W1/2 W 1/2 W b h p 2 h p N=16 t ( R ) 2 H = L W b N N=6.28 t ( R ) 2 A p

Van Deemter-kurvan H Cu A u B/u H = A B Cu u A, beror av matrisens geometri (strömvirvlar->breddning) B, beror av diffusionen C, beror av den hastighet som molekylerna distribueras med Perfusionskromatografi, stora porer som går genom hela partikeln, snabbare flöden möjliga ty transporten in i porerna blir ej diffusionsberoende, C blir lågt Upplösning R s = 1 2 t R2 - t R1 (w b1 w b2 ) R s är beroende av: Selektiviteten Retentionen Antalet bottnar t R1 t R2 Rent praktiskt: Matrisens egenskaper Kolonnens längd Flödeshastigheten Buffertsammansättning w b1 w b2

Adsorption [PS] [S]=Q: antalet tillgängliga platser [PS] bundet K= [PS] [P][S] Ofta behöver man även ta hänsyn till tävlande molekyler. [PS] [ES]=Q [P] i lösning Langmuirs adsorbtions isoterm: [PS]= Q K [P] 1 K[P] Eluering Isokratisk eluering Samma buffert hela tiden Gradienteluering Buffertens sammansättning förändras över tiden Kompetitiv eluering En tillsatt molekyl får tävla med målproteinet om platserna på matrisen

Kapacitet Nominell kapacitet Hur många (teoretiska) platser det finns på matrisen Dynamisk kapacitet Hur mycket gelen binder upp i det tänkta fallet! Beroende av: Målprotein Sammansättningen i råextraktet Buffertsammansättning Flödeshastigheten Gelfiltrering, innan du börjar Vilken buffert behöver matrisen tåla? De flesta matriserna tål ph 2-10 (finns även de som tål upp till ph 14) Silika tål ej höga phn < 8 Vilken upplösning behövs? avsaltning<preparativ rening<analytiska applikationer partikelstorlek 5-50 µm (mindre partiklar->bättre upplösning) Flera matriser kan blandas eller packas på varandra Hur mycket och vad fastnar på matrisen? Icke-specifika interaktioner Ändringar i mobilfasen kan påverka proteinet (15 ms/cm brukar vara bra) Provvolymen: 1-2% av bäddvolymen för 100 µm-partiklar, ännu mindre volym för mindre partiklar

Avsaltning Stor skillnad i storlek på de substanser som ska separeras Större frihetsgrader. Höga flöden Stora provvolymer >30% av bäddvolymen Proteinfraktionering Bäst separation då kontaminanterna vandrar i voiden Mindre än 30% skillnad i storlek, svårt att separera Stor porvolym och hög selektivitet önskvärt Stor kolonnarea -> stor provvolym kan laddas För att öka processiviteten, nytt prov kan laddas vid Vt

Storleksuppskattning mha GF Beroende av molekylens form Kallibrering med molekyler som har samma form logm stav sfär K D = V R-V 0 V i K D ; distributionskoefficient V 0 ; voidvolym V R ; retentionsvolym porvolym; V i = V t - V 0 K D Kromatofokusering ph 7.3 ph 7.4 ph 7.5 ph 7.6 ph 7.7 - - - - - - - - - - - - - repelleras snabb förflyttning binder till matrisen

Kromatofokusering Hög upplösning ph-gradienten bildas mha en jvt-buffert (högt ph) som sedan ersätts av en kromatofokuseringsbuffert (anjonbyte), polyamfolyter Den stationära fasen måste ha laddade grupper som inte titreras i det tänkta ph-intervallet Precipitering - ett problem Kan undvikas genom att proteinerna har en nettoladdning då de binder till matrisen Ökad jonstyrka kräver högre laddning för inbindning, detta påverkar dock ph-gradienten. Om proteinet faller kan det lösas upp igen då pht stiger Urea eller detergenter kan inkluderas i bufferten