1 Rapport för projektet Utveckling av en effektiv metod för förökning av nya rabarbersorter Li-Hua Zhu Jessica Fajerson Växtförädling och bioteknik SLU, Alnarp 2011-12-18
2 Slutrapport Projekttitel: Utveckling av en effektiv metod för förökning av nya rabarbersorter Sökande: Li-Hua Zhu Medsökande: Kimmo Rumpunen och Elisabet Nilsson Exjobbare: Jessica Fajerson Projektperiod: 2007-2008 Beviljat medel: 100 000 SEK Vetenskaplig redovisning Introduktion Rabarber (Rheum rhaponticum) är en flerårig och tålig växt som klarar sig bra i de flesta svenska växtzoner. Den är en robust och lättodlad medicinal- och köksväxt som ger en hög avkastning och har en karaktäristisk arom. Intresset för att använda rabarber i olika livsmedelsprodukter och som färskvara ökar, i både de nordiska länderna och många andra länder i världen. I till exempel Tyskland ökade produktionen, från 652 till 724 ha, och efterfrågan, på i första hand färsk rabarber kraftigt år 2005. Detta innebär en ökad efterfrågan på billiga plantor och bra sorter, något som också märkts i Sverige. Det finns stora sortskillnader när det gäller olika egenskaper hos rabarber (Rumpunen och Henriksen 1999). Nyligen har man även visat att rabarber, i förhållande till övriga grönsaker, har relativt höga halter antioxidanter, i form av olika fenoler (Zhou et al. 2006). De sorter som idag förökas är i första hand utvalda för hemträdgårdsodling och har inte de egenskaper som krävs vid kommersiell rabarberproduktion. Rabarber kan förökas genom delning av äldre plantor men detta tar lång tid och är arbetskrävande, vilket i sin tur ger dyra plantor. Mikroförökning har emellertid visat sig vara en effektiv och användbar metod för att föröka rabarber (Lepse 2007; Roggemans och Claes 1979; Rumpunen 1990, 1996; Zhao et al. 2005) men idag saluförs endast ett begränsat antal sorter, eftersom förökningsbarheten varierar med sorten. Många äldre sorter har dessutom en mycket stor benägenhet att producera blomstjälkar som måste avlägsnas manuellt för att inte stjäla kraft från plantorna. Det har därför varit motiverat att ta fram nya rabarbersorter med bättre egenskaper. Vid SLU på Balsgård har därför ett mindre rabarberförädlingsprogram bedrivits sedan 1990. Detta har resulterat i ett antal nya selektioner, varav F101, F104, F106, F108 och F112, valts ut på grund av bra smak, hög avkastning, låg blomningsbenägenhet samt motståndskraft mot svampsjukdomar, som annars drabbar bladen (svartfläcksjuka, Ramularia rhei). Smaktester, som genomförts tillsammans med Procordia Food AB i Tollarp och Eslöv, har visat en utsökt smak hos dessa selektioner. Utöver detta växtmaterial har även olika kloner av Canada Red funnits vara mycket odlingsvärda, med olika goda egenskaper. Dock är mikroförökningsbarheten okänd för det ovannämnda växtmaterialet och det är därför angeläget att testa denna egenskap, eftersom förökningsbarheten är en mycket viktig faktor som påverkar möjligheten att producera billiga plantor för kommersiell produktion. Mikroförökning är en vanlig metod för att snabbt massföröka växtmaterial på kort tid och denna metod är särskilt användbar för nya förädlade sorter, där man initialt endast har tillgång till en begränsad mängd växtmaterial. Dessutom kan mikroförökning göra det möjligt att effektivt producera sjukdomsfria och sortäkta plantor (Lepse 2007; Roggemans och Claes 1979). Traditionell mikroförökning kräver stora arbetsinsatser, eftersom växtdelarna odlas på fast medium i små burkar, vilket orsakar en hög produktionskostnad. Däremot erbjuder
3 bioreaktorproduktion ett bättre alternativ genom att producera växter i flytande medium i stora kärl, till exempel stora flaskor (Etinne H. och Berthouly 2002; Zhu et al. 2005). I våra tidigare studier har vi testat massförökning av blåbär, jordgubbar, hallon med flera växtslag i bioreaktorer och fått mycket positiva resultat, i de flesta fall. Vi har således framgångsrikt producerat blåbärsplantor i bioreaktorer under flera år. Vi har också upptäckt att i vissa fall kan växling mellan fast och flytande medium effektivt reducera hyperhydricitet, som ofta orsakar abnorma skott, ett mycket vanligt problem som förekommer när kulturer odlas i ett flytande medium. Eftersom tillväxt och utveckling av mikroplantor påverkas av mikroförökningsförhållanden, är det viktigt att utvärdera mikroplantor i växthus. För att på så sett kunna välja ut de bästa förhållandena för kommersiell mikroförökning. Syftet med detta projekt var att utvärdera förökningsbarheten in vitro hos nytt växtmaterial av rabarber, samt utvärdera etableringen av mikroförökade rabarberplantor i växthus. Projektet genomfördes delvis av en exjobbare. Vi producerade över 10 000 rabarberplantor i bioreaktor genom att använda protokollet som utvecklats i detta projekt. Dessa mikroplantor användes sedan som moderplantor på Elitplantstationen i Balsgård, till odlare för kommersiell produktion. Material Rabarberklonerna som användes i försöket är sex nya kloner (0132 Canada Red 3, 0223 röd Elmsblitz, F0302 F101, 0217 F104, 0211 F106 och 0208 F108) som kom från SLU i Balsgård. Dessa kloner odlades i stora krukor i växthuset inför in vitro etablering (se figur 1A). Metoder Etablering in vitro Både vilande och växande knoppar (se figur 1B) samt meristem, från alla sex kloner, användes som explantat för in vitro etablering. Rhizombitar där knoppar fanns skars bort från moderplantorna och tvättades grundligt under rinnande kranvatten (se figur 1C). Därefter ytsteriliserades de med 6% kalciumhypoklorit med 2 droppar Tween 20 i 15 minuter, under skakning. Sedan sköljdes de 6 gånger med sterilt vatten. Mediet för etablering innehöll MS, 20 g L -1 glukos, 1 mg L -1 BAP, 1 mg L -1 IBA och 7 g L -1 agar. ph justerades till 5.7. Explantaten flyttades till nytt medium var 3-4 vecka. Skottproduktion på fast medium Fem kloner användes för skottproduktionsförsök. Klon 0211 F106 växte för långsamt och kunde inte uppförökas i tillräckligt stor mängd för detta ändamål. För skottproduktion användes mediet innehållande MS, 20 g L -1 glukos, olika koncentrationer av BAP (1.5, 2.5, 3.5, 4.5 och 5.5 mg L -1 ) i kombination med 0.5 mg L -1 IBA och 6 g L -1 agar. ph justerades 5.7. För varje kombination användes 30 skott per klon. Efter 4 veckor registrerades antal nya skott som producerats. Försöket upprepades minst 2 gånger. Effekt av paclobutrazol på skottillväxt För att vidare öka förökningshastigheten har vi testat tillväxtretardanten paclobutrazol och dess effekt på skottillväxten. I detta försök var försökningsmediet samma som för
4 skottproduktion, men innehöll 3.5 mg L -1 BAP och 2 mg L -1 paclobutrazol. Detta försök genomfördes endast med klonen 0217 F104 och skotten som användes kom från förökningsmedier med olika BAP koncentrationer. Två burkar, en med och en utan tillsatt paclobutrazol, med 5 skott i vardera användes i försöket och skottillväxten registrerades efter 3 och 6 (2x3) veckor. Rotning på fast medium Rotningsmedium var halvt MS innehållande 20 g L -1 glukos, 0.1 mg L -1 IBA, 6 g L -1 agar och ph justerades till 5.7. Alla fem kloner som användes i skottproduktionsförsöket inkluderades i rotningsförsöket. En mörkerbehandling, under 3,5 dagar, testades på klon 0217 F104 och 0208 F108. Skotten kom från alla undersökta BAP koncentrationer. För varje koncentration användes minst 12 skott. Skottproduktion och rotning i bioreaktor Skottproduktion i bioreaktorer genomfördes med klonerna 0132 Canada Red 3 och 0223 röd Elmsblitz, som är väl efterfrågade på marknaden. Mediet innehöll 20 g L -1 glukos eller 30 g L - 1 sackaros, 1 mg L -1 BAP och 1 mg L -1 IBA. Skottproduktion registrerades efter 3 veckor. Rotning genomfördes i bioreaktor med samma rotningsmedium som det fasta mediet, i ljus. In vitro odlingsförhållanden Alla in vitro kulturer i denna rapport odlades i en klimatkammare med dagslängden 16 timmar, temperatur 21/18 C (dag/natt) och ljusintensiteten 33 µmol m 2 s -1. Etablering av mikroplantor i växthus/utomhus Välrotade mikroplantor, från både fast medium och bioreaktor, planterades i krukor med planteringsjord blandad med perlit (1:1) i växthus. Från början täcktes mikroplantorna med plastmuggar för att undvika uttorkning. Plastmuggarna öppnades efter 1-2 veckor och togs bort efter 2-3 veckor, när mikroplantorna började visa ny tillväxt. Resultat och diskussion In vitro etablering Alla sex kloner lyckades etableras in vitro, på samma etableringsmedium, oavsett typ av explantat (se tabell 1 och figur 1D). Etableringsgraden ligger mellan 27-100 %, men de flesta kloner visade över 80 % etablering. Infektionsgraden ligger mellan 0-28 % för vilande och växande knoppar där klonen 0217 F104 hade den högst infektionsgraden, medan kloner F0302 F101 och 0208 F108 samt meristemexplantaten, från alla andra kloner, inte visade någon infektion alls (se tabell 1 och figur 2). Detta tyder på att meristem är den bästa typen av explantat för etablering in vitro, utan någon infektion, för vissa kloner. Infektion skedde efter 1-3 veckor och var mest från svamp och lite från bakterier. Dock visade i stort sett vilande och växande knoppar en lik hög etableringsgrad, som är högre än för meristem. In vitro etablering av rabarber har tidigare rapporterats av Rumpunen (1990), Roggemans och Claes (1979) och Lepse (2007). Vi har lyckats med att etablera alla kloner med en låg infektionsgrad, medan Lepse (2007) rapporterade en infektionsgrad på 25-53 %. Detta kan naturligtvis bero på skillnader i genotyp och ursprung av växtmaterial, för in vitro etablering,
5 men kan också bero på att vi grundligt tvättade rhizombitarna innan de ytsteriliserades. Tillväxthastigheten in vitro mellan de olika rabarberklonerna skiljde sig åt, där klonen 0211 F106 växte betydligt långsammare och visade en låg förökningshastighet. Denna klon inkluderades därför inte i de senare försöken. Tabell 1. Resultat av in vitro etablering av de sex olika rabarberklonerna Klon Antal växande knoppar (vk) Etablering (vk) % Antal meristem (m) Etablering (m) % Antal vilande knoppar (vik) Etablering (vik) % 0217 F104 21 51 21 81 25 36 28 Infektion % (vk+vik) 0132 Canada Red 3 0223 röd Elmsblitz 12 75 14 57 12 83 13 18 89 16 31 9 100 11 F0302 F101 14 93 15 27 11 91 0 0211 F106 10 90 12 67 9 67 21 0208 F108 19 89 20 45 10 80 0 A B C D E F G H Figur 1. Moderplanta och olika faser av mikroförökning av rabarber. A: Moderplanta i kruka. B: Växande skott på rhizomet. C: Vältvättade icke sterila skott med en bit av rhizomet. D: In vitro etablering av en knopp. E: Växande skott i provrör. F: Skott förökade i burk. G: En färdig rabarberplanta för ex vitro etablering. H: Väletablerade rabarberplantor i växthus.
6 Figur 2. Meristemexplantat som användes för in vitro etablering av rabarber. Meristem som fortfarande sitter på rhizomet (vänster) och meristemet med en bit av rhizomvävnaden, som skars bort för in vitro etablering (höger). Skottproduktion på fast medium Efter etablering odlades knopparna eller meristemen på etableringsmediet tills fina skott hade utvecklats (se figur 1E och 1F). För att undersöka cytokinins inverkan på förökningshastigheten testades olika koncentrationer av BAP. Resultaten från denna test presenteras i tabell 2. De fem olika rabarberklonerna kan i princip delas upp i två grupper baserat på förökningshastighet, det vill säga den ena gruppen visade en lägre förökningshastighet än den andra. Klon 0217 F104 och F0302 F101 tillhör den första gruppen, i vilken förökningshastigheterna inte skiljde sig åt mellan de olika BAP koncentrationerna och en förökningshastighet på lite över 2 förekom. Detta tyder förmodligen på att man behöver testa andra typer av cytokininer eller andra komponenter i mediet för att få upp förökningshastigheten. De resterade tre klonerna tillhör den andra gruppen, som visade en högre förökningshastighet än den första gruppen, men ingen direkt skillnad mellan de olika BAP koncentrationerna upptäcktes heller här. I denna grupp var förökningshastigheten upp till 3.62 hos klonen 0208 F108, vid BAP koncentrationen 2,5 mg L -1. Generellt kan man konstatera att en BAP koncentration på högre än 2.5 mg L -1 i princip inte hjälper för att öka förökningshastigheten. Man kanske behöver justera andra mediumkomponenter. Lepse (2007) har också rapporterat en förökningshastighet på 2 och Rumpunen (1990) hade en förökningshastighet på mellan 1.4 och 3.5. Tabell 2. Antal skott som producerades per explantat från de olika rabarberklonerna på medium innehållande olika koncentrationer av BAP. Klon BAP (mg L -1 ) 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 0217 F104 2.32 2.15 2.12 2.24 2.23 0132 Canada Red 3 0223 röd Elmsblitz 3.34 3.22 3.27 3.03 3.12 3.05 3.50 3.02 3.34 3.18 F0302 F101 2.47 2.52 2.60 2.50 2.29 0208 F108 3.17 3.62 3.12 3.39 3.33
7 När det gäller utseende av skott på medierna med olika BAP koncentrationer, visade det sig att skotten hos klon F0302 F101 blev kortare med BAP koncentrationer 4.5 och 5.5. Särskilt för skotten som förökats på 5.5 mg L -1 jämfört med dem som förökats på medium med lägre BAP koncentration (se figur 3). Bladstjälken och bladytan hos denna klon blir också mindre vid högre BAP koncentrationer (4.5 och 5.5 mg L -1 ) jämfört med de på lägre BAP koncentrationer. Dock fanns ingen skillnad mellan de olika BAP koncentrationerna för de övriga klonerna (se tabell 3). BAP 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 mg L -1 Figur 3. Skott från klon F0302 F101, som förökats på skottproduktionsmedium med olika BAP koncentrationer, efter 4 veckor. Tabell 3. Bladstjälkslängden (cm) (BS) och bladyta (cm 2 ) (BY) hos rabarberkloner som förökats på skottproduktionsmedium med olika BAP koncentrationer. Klon BAP (mg L -1 ) 1.5 (BS/BY) 2.5 3.5 4.5 5.5 Noteringar om skotten 0217 F104 4/1.5 4/1.5 4/1.5 4/1.5 4/1.5 Oftast ett dominerande 0132 Canada Red 3 0223 röd Elmsblitz 1/0,5 1/0.5 1/0.5 1/0.5 1/0.5 Små kompakta 4/1.5 4/1.5 4/1.5 4/1.5 4/1.5 F0302 F101 5/6 5/5 5/4 4/3 3/2 Kraftiga 0208 F108 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 Små kompakta
8 Effekt av paclobutrazol på skottillväxt Paclobutrazol hämmade kraftligt skottillväxten, huvudsakligen på grund av minskad bladstjälkssträckning (se figur 4). Den inhiberade effekten observerades efter 3 veckor och effekten var ännu tydligare efter dubbla kulturtiden (se figur 4B). Efter 3 veckor blev blad på skott med behandlingen mindre och mörkare jämfört med kontrollen. Vid slutavläsningen var skotten som behandlats med paclobutrazol mer kompakta och bladstjälklängden var efter 3 veckor 1.5 cm och 0.5 cm efter dubbla kulturtiden jämfört med 4 cm för kontrollen (se figur 5C). Skotten förökade sig dock inte alls (se figur 4A och 4B), vilket tyder på att paclobutrazol negativt påverkade skottmultipliceringen. Paclobutrazol är en välkänd tillväxtretardant som har motsatt funktion som gibberelliner och kan reducera stamlängden in vitro, genom att reducera cellexpansion och celldelning genom blockering av gibberellins aktivitet (Smith et al., 1990). A B C V M H V M H 1 2 3 4 5 6 Figur 4. In vitro odlad rabarber i burkar som behandlats med tillväxtretardanten paclobutrazol. A: Rabarberskott i burkar (V: vänster, kontrollen. M och H: mitten och höger, behandlade efter 3 respektive 2x3 veckor). B: Skott (V: kontrollen. M och H: behandlade efter 3 respektive 2x3 veckor). C: Blad (1-2: kontrollen. 3-4: behandlade efter 3 veckor. 5-6: behandlade efter 2x3 veckor). Rotning på fast medium Generellt kom rotning igång tidigare på de skott som förökades på skottproduktionsmedium med lägre BAP koncentration. Dock hade ca 80-90 % av skotten producerat rötter (se figur 1G) efter 12 veckor (de flesta efter ca 6 veckor). Slutavläsning visade en rotningsgrad på mellan 67-100 % och de flesta kloner hade en rotningsgrad över 80 % (se tabell 4). Rotinduktion i mörker och ljus resulterade i en lika hög rotningsgrad. En del skott rotade sig redan på förökningsmediet. Detta visar att rabarberplantor är lätta att rota och har också rapporterats av Lepse (2007). Skottproduktion och rotning i bioreaktor Föröksningsprotokollet för bioreaktorproduktion av rabarber fungerade för de två rabarberklonerna som testades (se figur 5A) och har använts för att producera 10 000 rabarberplantor till Elitplantstationen i Balsgård. Förökningshastigheten var lika hög som på fast medium. Skotten var rotinducerade innan de planterades i växthus, med en rotningsgrad på nästan 100 %.
9 Tabell 4. Rotningsgrad för skotten från skottproduktionsmedier innehållande olika BAP koncentrationer. Klon BAP (mg L -1 ) 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 Noteringar om rötter 0217 F104 100 83 92 100 100 Få 0132 Canada Red 3 100 100 92 100 67 Kraftiga 0223 röd Elmsblitz 100 92 92 100 100 Långa, många och tunna F0302 F101 92 83 100 100 100 Mycket långa och tunna 0208 F108 92 100 83 100 100 Ganska kraftiga Etablering i växthus Mikroplantor, både från fast medium och bioreaktor, etablerades till 100 % i växthus (se figur 1H) i Alnarp. De flesta mikroplantor som levererades har etablerats väl på Elitplantstationen i Balsgård (se figur 5B och 5C). Dessa plantor har sedan använts som moderplantor och levererats till rabarberodlare. A B C Figur 5. Bioreaktorproduktion av rabarber (A) samt etablering i växthus (B) och utomhus (C) i Balsgård. Referenser Etinne H. och Berthouly M. 2002. Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell, Tissue and organ culture 69: 215-231. Lepse L. 2007. Comparison of In Vitro and Traditional Propagation Methods of Rhubarb (Rheum rhabarbarum) according to Morphological Features and Yield. Acta Hort. 812: 265-270. Roggemans J. och Claes M.C. 1979. Rapid clonal propagation of rhubarb by in vitro culture of shoot-tips. Scientia Horticulturae 11: 241-246. Rumpunen K. 1990. Mikroförökning av rabarber. Examensarbete, SLU, Alnarp. Rumpunen K. 1996. Rabarber en robust kultur. Fakta Trädgård Fritid, SLU, nr 12.
Rumpunen K. och Henriksen K. 1999. Phytochemical and morphological characterization of seventy-one cukltivars and selections of culilnary rhubarb (Rheum spp.) J. Hort. Sci & Biotechnology. 74: 13-18. Smith E.F., Roberts A.V. och Mottley J. 1990. The preparation in vitro of chrysanthemum for transplantation to soil. 2. Improved resistance to desiccation conferred by paclobutrazol. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 21: 133-140. Zhao Y., Grout B.W.W. och Roberts A.V. 2005. Abnormal chromosomes and DNA in micropropagated rhubarb (Rheum rhaponticum L.) PC49. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 83: 335-338. Zhou K. och Yu L. 2006. Total phenolic contents and antioxidant properties of commonly consumed vegetables grown in Colorado. LWT 39: 1156-1162. Zhu L.H., Li X.Y. och Welander M. 2005. Optimisation of growing conditions for the apple rootstock M26 grown in RITA containers using temporary immersion principle. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81: 313-318. 10