Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15hp, Vt. 2010

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15hp, Vt. 2010 QUALITY OF TACSI PLATELETS AND THEIR EFFECT ON THROMBOCYTOPENIA PATIENTS Ann-Sofie Lundin Handledare: Folke Knutson och Helena Löf Ställföreträdande handledare: Karin Lejskog Klinisk immunologi och transfusionsmedicin Akademiska sjukhuset, Uppsala, Sverige 1

ABSTRACT Objective: Platelets is the smallest blood component. Low levels of platelets lead to bleeding, while high levels of platelets can cause thrombosis. Patients with thrombocytopenia (lack of platelets) needs platelet transfusion. Lack of platelets can be caused by trauma, certain drugs, surgery and splenomegaly. Methods: A new approach that pools 8 buffy coats (TACSI platelets) that were separated into 2 units instead of 4-6 buffy coats pooled to 1 unit was investigated in this study. After the platelets were extracted from the buffy coats their quality was controlled and subsequently the platelet product was evaluated in 96 patients. Results: The results showed that 80 % of the platelet units passed the European quality requirements. Further, the platelet count was increased in most patients that received TACSI platelets. Conclusion: Medical treatment may have a role in platelet count after transfusion. Since the TACSI platelets passed the quality requirements, and the vast majority of patients platelet count increased after TACSI platelet transfusion, the TACSI platelets will replace the old method to produce platelets at the Uppsala University hospital. Key Words: platelet, thrombocytopenia, intercept blood system, SSP+, pathogen inactivation 2

FÖRKORTNINGAR CAD HBsAg HTLV NAT PVC SSP+ TACSI UVA compound adsorption device hepatit B antigen humant T-lyfotropt virus virusnukleinsyratestning polyvinyl chloride storage solution for platelets terumo automated centrifuge and separator integration ultra violet A 3

INTRODUKTION Trombocyter, som är blodets minsta beståndsdelar, bildas från megakaryocyter i benmärgen. Megakaryocyter ansvarar för livslång produktion av trombocyter och har en diameter mellan 50 - och 100 µm [1]. I slutet av megakaryocyternas mognadsfas snörs det av små delar av cytoplasman, som blir omgivna av cellmembran. Dessa små cytoplasmafragment som saknar kärna och har formen av en liten diskus kallas trombocyter. Trombocyterna har en diameter på 1,5 - och 5 µm samt har en överlevnadstid på/mellan 8 - och 10 dygn. Det bildas mellan 1500 - och 3000 trombocyter per megakaryocyt. Av alla trombocyter i kroppen så finns ¾ cirkulerande medan ¼ kan återfinnas i mjälten, det är i mjälten som trombocyterna fagocyteras. Vid splenomegali kan 90 % av de cirkulerande trombocyterna befinna sig i mjälten. Den viktigaste uppgiften trombocyter har är att medverka i den primära hemostasen. Fungerar inte hemostasen kan detta leda till blödning eller trombos. Trombocyternas uppgift i hemostasen är att täta skadade blodkärl och forma trombocytpluggar [2]. Trombocyterna medverkar inte enbart i hemostasen utan även i aktiveringen av de humorala koagulationsfaktorerna. Koagulationsfaktorer som är K- vitaminberoende gynnar den humorala koagulationsprocessen. K-vitamin är även nödvändigt för att levern ska bilda olika kofaktorer (exempelvis protrombin). Genom degradering av kofaktorer (som faktor V) får man en negativ feed back reglering som stänger av koagulationskaskaden. Faktor V bidrar även till att lokalisera koagulationen. Trombopoetin är kroppens endogena trombocyttillväxtfaktor som produceras i levern. Trombopoetin aktiverar megakaryocyterna, och ökar därmed nybildningen av trombocyter. Låg produktion av trombopoetin kan leda till trombocytopeni [3]. Vid kärlskada utsöndras trombocyter, därefter aktiverar kalcium och K-vitamin en kedjereaktion som leder till klyvning av faktor V som i sin tur aktiverar faktor X som får protrombin att ombildas till trombin. Trombin i sin tur får fibrinogen att omvandlas till ett nätverk av trådar, fibrin, som erytrocyter och trombocyter fastnar i. Till slut har det bildats en plugg av trombocyter i fibrinnätet som hindrar blödningen vid kärlskadan. Man vill att trombocytantalet skall ligga mellan 150 - och 350 * 10 9 /L. Ett för lågt antal trombocyter kan ge upphov till trombocytopeni, som ökar 4

blödningsbenägenheten. Trombocytopeni kan uppkomma av olika orsaker; nedsatt produktion ses i första hand vid benmärgsskador, trauma-, viss medicinering exempelvis cytostatika, strålbehandling, brist på B12 och/eller folsyra, kirurgiska ingrepp samt splenomegali [4]. Patienter som redan har eller som går på en behandling som förväntas ge trombocytopeni behöver en trombocyttransfusion [2,5]. Trombocyttransfusion kan ges profylaktiskt för att minska risken för kliniska blödningar. Men terapeutiska transfusioner ges vid signifikant blödning [6]. När en patient har fått en trombocyttransfusion vill man se en ökning av trombocytantalet men ökningen kan variera av flera olika anledningar, exempelvis på grund av att vikt, blodvolym och mjältstorlek kan variera samt att läkemedelsintag kan påverka trombocytantalet [4]. Kvaliteten på trombocytkoncentrationen kan variera beroende på metod, förvaring, förvaringstemperatur och lagringslösning. Detta kan ge förändringar i ph:t som har en stor betydelse för trombocyternas livsduglighet. För att lättare kunna bevara ph:t under förvaringen bör förvaringspåsarna ha en bra syre- och koldioxid genomsläpplighet. Påsarna som trombocyterna förvaras i innehåller polyolefin och PVC mjukplast med tri(2 - etylhexyl) trimellitat, som ger trombocytpåsen en hög gasgenomsläpplighet [2]. Enligt Eu-guiden ska 75 % av alla trombocytenheter som framställs innehålla trombocyter över 300 * 10 9 /L. En trombocytenhet skall däremot inte innehålla trombocyter över 700 * 10 9 /L då Intercept UVA Illuminator (Cerus Europe B.V. Amersfoort, Nederländerna) inte är validerad att patogeninaktivera så stora trombocytenheter. Det finns olika metoder att framställa trombocyter till transfusion. Exempel på dessa metoder är via aferes eller lättcellskoncentrat (som framställs från helblod). Att utvinna trombocyter via aferes går ut på att en donator lämnar enbart trombocyter medan leukocyterna, erytrocyterna och plasman ges tillbaka till donatorn. Donationen sker på så sätt att en maskin samlar upp en mängd blod från givaren till en separeringscentrifug. Efter att trombocyterna samlats in så återförs resterande blodkomponenter tillbaka till givaren. Framtagandet av trombocyter från helblod går ut på att centrifugera helblodet och separera de olika blodkomponenterna från varandra, resultatet blir till 3 olika påsar; 1 med lättcellskoncentrat, 1 med plasma och 1 med erytrocytkoncentrat. För att få samma mängd trombocyter vid lättcellskoncentratframställning som med aferesframställning krävs det att man poolar ihop ett antal lättcellskoncentrat från helblod (vanligast är att poola ihop mellan 4 och 5

6 lättcellskoncentrat). Efter polning sker en centrifugering som separerar trombocyterna från de övriga cellerna med hjälp av ett filter [7,6]. Denna studie inriktar sig på trombocytframställning från lättcellskoncentrat. Man poolade ihop 8 lättcellskoncentrat (TACSI centrifugen) som sedan delades upp till 2 enheter som kunde gå till 2 olika patienter, istället för som normalt (ORBISAC centrifugen) enbart 5 lättcellskoncentrat poolas ihop till en enhet [7]. Vid framställning av trombocyter vill man förhindra överföring av patogener (som HIV, HTLV, HBV och HCV), bakterier, andra virus, parasiter och eventuella leukocyter som kan finnas kvar. Detta görs med hjälp av olika patogeninaktiverings processer. Här användes Intercept blood system (Cerus Europe B.V. Amersfoort, Nederländerna) som bland annat innehåller amotosalen HCl samt en CAD absorptions-enhet som hjälper till att inaktivera patogener och eventuella leukocyter [2,5]. Amotosalen HCl är en psoralen förening som inflätas i de spiralformade DNAoch RNA-strängarma. När amotosalenet utsätts för UVA-ljus blir det reaktivt och bildar kovalenta bindningar med pyrimidinerna i nukleinsyran, RNA- och DNAsträngarna är våra 2 vanligaste nukleinsyror. Denna fotokemisk reaktion resulterar i att nukleinsyran kopieras och förebygger därtmed spridning av patogener genom hämmad proteinsyntes [8]. När trombocyterna tillsammans med amotosalen HCl har belysts med UVA-ljus, överförs trombocyterna till en transferpåse som innehåller en CAD absorptions-enhet [8]. Denna CAD absorptions-enhet absorberar överskottet av amotosalenet och de fria fotokemiska produkterna så pass bra att det enbart kommer finnas låga koncentrationer kvar, som inte längre kan skada patienter som behöver trombocyttransfusion [2] SSP+ är en näringslösning som innehåller bland annat glukos och acetat, som används under trombocyternas metabolism för att bevara ATP-nivån. ATP är en viktig energibärare för trombocyterna. Under glykolysen metaboliseras glukos till bland annat laktat. När acetat används som substrat vid trombocyternas metabolism så sjunker laktatproduktionen och en ökning av O 2 -konsumtionen sker och ph blir stabilare [9]. När trombocyter framställs från lättcellskoncentrat förvaras de i ständig rörelse i 20-24 C upp till 7 dygn eller tills de skickas ut till patienter [4]. Syftet med denna studie var att göra kvalitetskontroller på trombocytenheterna för att se om TACSI-trombocyterna klarade kvalitetskraven samt kontrollera 96 trombocytopena patienters trombocytvärde efter att de fått TACSI-trombocyter. Ökar 6

trombocyterna hos en övervägande del av patienterna har man grund för att ersätta den gamla metoden (ORBISAC), då 5 lättcellskoncentrat poolas ihop, patogeninaktiveras och ges till en patient. Enligt den nya metoden poolas 8 TACSI lättcellskoncentrat ihop, patogeninaktiveras och delas till 2 trombocytenheter, vilket betyder att TACSI trombocyter är mer kostnadseffektiva jämfört med ORBISAC trombocyterna då man framställer trombocyter från 5 lättcellskoncentrat. MATERIAL OCH METOD Provmaterial Trombocyter framställdes från helblod. Blodpåsarna låg och vilade 2 timmar i rumstemperatur innan centrifugering. Det centrifugerade helblodet pressades i en Optipress (Fenwal, Inc., Lake Zurich, Illinois, USA). Resultatet blev 3 påsar: 1 med lättcellskoncentrat, 1 med erytrocytkoncentrat och 1 med plasma. Lättcellskoncentratet vilade i rumstemperatur till nästkommande vardag innan poolning skedde. Framställning av en lättcellspool TACSI-kittets (Terumo Europe N.V. Leuven, Belgien) klämmor stängdes och svetsades ihop med en SSP+ lösning samt 8 lättcellskoncentrat med samma blodgrupp. Efter dataregistrering, där ny komponentkod skapades (lättcellskoncentrat från flera givare) överfördes lättcellskoncentraten till TACSI-kittets transferpåse, varefter de 8 lättcellspåsarna sköljdes med SSP+ lösning. Ladda TACSI. TACSI-kittet placerades i centralenheten i TACSI-centrifugen (Terumo Europe N.V. Leuven, Belgien) som programmerats då att cellerna sedimenterade i 4 min vid 1337 rpm och därefter separeradea under 10 min vid 300 rpm. Både sedimentering och separering skedde i 20 C. Vid separationen överfördes trombocyterna till TACSIkittets trombocytpåse. Patogeninaktivering. TACSI-kittets trombocytpåse svetsades ihop med ett Intercept blood system. De dataregistrerades, gavs en ny komponentkod som visade att de skall separeras till 2 7

påsar. Intercept blood system-setets amotosalenpåsen öppnades och amotosalenet överfördes till Intercept blood system-setets belysningspåse. Trombocyterna överfördes till behandlingssetets belysningspåse samt blandades väl med amotosalenet. Belysning. Intercept blood system-setets belysningspåse lades i Intercept UVA Illuminator som UVA-belyste trombocyterna i 5 min under ständig rörelse. Absorption. Trombocyterna överfördes till Intercept blood system-setets absorptionspåse som innehåller en CAD absorptions-enhet. Absorptionspåsen låg och vaggade minst 6 timmar och max 16 timmar så att överflödet av fritt amotosalen samt fotoprodukter skulle hinna absorberas i CAD absorptions-enheten. Överföring till slutförvaringspåse. Trombocyterna överfördes sedan till 2 Intercept blood system-setets slutförvaringspåsar där de förvarades till dess att en patient behövde trombocyter. Kvalitetskontroll Antalet trombocyter räknades i Advia 60 Hematology system (Triolab). Resultatet bör ligga runt 1500 x 10 9 /L. Antalet leukocyter räknades manuellt i mikroskop. Resultatet skall ligga < 1x 10 6 / enhet. Patientuppföljning Efter att trombocyterna skickats till avdelning/patienter gjordes en patientundersökning gällande trombocytvärdet före och efter transfusionen. RESULTAT Kvalitetskontroll Akademiska sjukhuset följer EU-guidens krav när det gäller hur mycket trombocyter en enhet skall innehålla. EU-guiden har kravet att 75 % ska innehålla minst 300 * 10 9 8

trombocyter per enhet. Kontroller gjordes på de 96 trombocytenheter som gick vidare till trombocytopena patienter och 80 % av trombocytenheterna klarade kravet, vilket kan ses i Figur 1. Figur 1. Antal trombocyter per trombocytenhet (*10 9 /L). X-axeln visar antalet patienter medan Y-axeln visar antalet trombocyter (* 10 9 /L) per trombocytenhet. Patientuppföljning I kontrollerna jämfördes 96 trombocytopena patienters trombocytvärden före och efter transfusion med en TACSI trombocytenhet. Som kan ses i Figur 2 har värdet ökat hos en övervägande del av patienterna, vilket tyder på att TACSI-trombocyterna var tillräckliga många och bra för att öka trombocytvärdet hos patienter med trombocytopeni. 9

Figur 2A. Figur 2B. Figur 2A och B. Trombocytvärde hos trombocytopena patienter före och efter transfusion med TACSI-trombocyter. 10

X-axeln visar transfunderade patienter medan Y-axeln visar trombocytvärdet hos patienter (* 10 9 /L). Svart stapel visar trombocytantal före transfusion. Grå stapeln visar trombocytantal efter transfusion. DISKUSSION Trombocyttransfusion kan ges för att förebygga eller behandla blödning hos patienter som har trombocytopeni eller nedsatt trombocytfunktion [10]. Överföring av bakterier och virussjukdomar som exempelvis HIV, HCV, HBV och HLA vid trombocyttransfusion har varit känt i flera decennier [11]. Bakteriell kontaminering är vanligare hos trombocytkoncentrat jämfört med de övriga blodkomponenterna. Många mikroorganismer kan överleva och föröka sig under de lagringsförhållanden som används för trombocyter. Åtgärder såsom: givarens lämplighet, optimal beredning, hantering och lagring, desinfektion och patogeninaktivering används för att minska risken för bakterieangrepp [12]. Övervakning av virusinfektionerna: HIV, HCV och HBV har resulterat i en minskning i infektioner hos trombocyttransfunderade patienter de senaste decennierna. Detta beror bland annat på att i mitten av 1980-talet infördes anti-hivserologiska tester och liknande för HCV. Risken för HBV-infektioner har kontinuerligt minskat sedan införandet av HBsAg test i början av 1970-talet. Införandet av virala NAT tester har kraftigt bidragit till att minska kvarstående risk för virustransmission [12]. För att förhindra överföring av patogener bakterier, virus, parasiter och eventuella leukocyter använder man sig bland annat av patogeninaktivering. Vid patogeninaktiveringen tillsätts vid Akademiska sjukhuset, 15,2 mg Amotosalen HCl till trombocytpåsen. Efter CAD-behandlingen finns det bara 2,75 mg Amotosalen, fria och bundna fotoprodukter i en trombocytenhet, vilket är så pass lite att det inte anses farligt för patienten [8]. Trombocyter kan framställas från helblod eller med aferes. Trombocyter från helblod har en högre risk för infektioner än aferes trombocyter, då helblodstrombocyter kommer från 4-6 givare jämfört med aferes där trombocyterna bara kommer från en 11

givare. Både aferes och helblodsgivare kan uppleva biverkningar såsom: svaghet, blekhet, svettning, illamående och svimning. Aferesdonation kan däremot ge komplikationer som trombocytsänkning om hög donatorfrekvens [10]. Val av AB0-RhD och HLA kan göras lättare med aferes om matchade givare är nödvändiga [13]. Som ses i Figur 2 sjönk vissa patienters trombocytvärden eller steg väldigt mycket efter trombocyttransfusion. Detta kan bland annat bero på hur stor patienten är. Då stora patienter får en trombocytenhet som innehåller lite mindre trombocyter så stiger inte trombocytvärdet tillräckligt; trombocytantalet är inte tillräckligt stort för denna patient och vice versa för en liten patient som får en trombocytenhet som innehåller lite mer trombocyter. Har en patient sepsis eller fortfarande blöder kan detta leda till att trombocytvärdet inte stiger efter trombocyttransfusion. Kontroll provet skall tas 1timme efter transfusionen (standard vid studier), annars kan ett falskt icke jämförbara värde erhållas då det kan hända någonting mellan transfusionen och kontrollprovet. Exempelvis att blödningen hinna avta. Stiger trombocytvärdet med mer än 100 efter transfusionen misstänks oftast felvärde. En av orsakerna kan vara att samma kanyl används vid transfusionen som vid kontrollprovstagningen samt att inget slaskrör tas. Båda leder till att kontrollprovet tas på själva trombocytkoncentratet varför värdet blir falskt högt. Patient nr 26 är en av de patienter vars trombocytantal har stigit mycket efter TACSI-trombocyttransfusionen. Detta beror på att denna patient kom in för benmärgstransplantation och fick 2 doser allogena stamceller som innehöll mycket trombocyter. Stamcellerna fick patienten efter trombocyttransfusionen och innan kontrollprovet togs vilket kan vara orsaken till det höga trombocytvärdet. Vid blodtransfusioner krävs det att all personal skall vara utbildad och kvalificerad, och allt material, reagenser, kvalificerad utrustning och metoder måste godkännas innan klinisk användning [13]. Valet mellan aferestrombocyter och helblods trombocyter beror till största delen på ekonomiska överväganden. Aferestrombocyter är dyrare att producera på grund av materialförsörjning, en längre framställningstid och extra givarrekrytering [7]. Att framställa trombocyter via TACSI eller den gamla metoden skiljer sig ganska mycket i kostnad. Vid transfusion med TACSItrombocyter, där man delar de 8 poolade lättcellskoncentraten till 2 enheter, kostar 12

vardera enhet 926,5 kronor. Trombocyter som poolades med den gamla metoden, 5 lättcellskoncentrat poolas till en enhet, kostar 1649 kronor per enhet. Studiens syfte var att kontrollera 96 trombocytopena patienters trombocytvärde efter att de fått TACSI-trombocyter, samt se om trombocytkoncentrationen ökade hos en övervägande del av patienterna. EU-guiden har kravet att 75 % av trombocytenheterna ska innehålla minst 300 * 10 9 trombocyter per enhet. Av TACSI trombocyterna så uppfyllde 80 % kravet. Eftersom den nya metoden att framställa trombocyter klarade kraven kommer den att kunna införas på Akademiska sjukhuset i Uppsala. ACKNOWLEDGEMENT Jag skulle vilja tacka Folke Knutson, Helena Löf, Karin Lejskog, samt all personal på blodcentralen som har hjälpt mig och gjort det möjligt för mig att skriva detta arbete. REFERENSER [1] L. Pang, M. J. Weiss, M. Poncz. 2005. Megakaryocyte biology and related disorders. Journal of clinical investigation. 115:3332-3338. [2] N. Tynngård. 2009. Preparation, storage and quality control of platelet concentrates. Department of clinical immunology and transfusion medicine. 41:97-104. [3] N. H. Afdhal, R. Esteban. 2007. Introduction: thrombocytopenia in chronic liver disease treatment implications and novel approaches. Alimentary pharmacology & therapeutics. 26:1-4. [4] S. Eisenberg. 2010. Refractory response to platelet transfusion therapy. The art and science of infusion nursing. 33:89-97. [5] D. Rhenen, H. Gulliksson, J-P. Cazenave et- al. 2003. Transfusion of pooled buffy coat platelet components prepared with photochemical pathogen inactivation treatment: the eurosprite trial. Transfusion medicine. 101:2426-2433. 13

[6] M. A. Blajchman, S. J. Slichter, N. M. Heddle et- al. 2008. New strategies for the optimal use of platelet transfusions. Transfusion medicine. 198-204. [7] R. R. Vassallo, S. Murphy. 2006. A critical comparison of platelet preparation methods. Hemostasis and thrombosis. 13:323-330. [8] L. Lin, M. G. Gonlan, J. tessman et- al. 2005. Amotosalen interactions with platelet and plasma components: absence of neoantigen formation after photochemical treatment. Transfusion. 45:1610-1620. [9] V. S. Hornsey, K. McColl, O. Drummond et- al. 2006. Extended storage of platelets in SSP + platelet additive solution. Vox sanguinis the internatunal journal of transfusion medicine. 91:41-46. [10] H. Schrezenmeier, E. Seifried. 2010. Buffy-coat-derived pooled platelet concentrates and apheresis platelet concentrates: which product type should be preferred? Vox sanguinis the internatunal journal of transfusion medicine. Epub ahead of print. [11] A. A. Adjei, G. K. Kuma, Y. Tettey et.al. 2009. Bacterial contamination of blood and blood components in three major blood transfusion centers, Accra, Ghana. Japanese journal of ifectious diseases. 62:265-269. [12] F. Bihl, D. Castelli, F. Marincola et- al. 2007. Transfusion- transmitted infections. Journal of translational medicine. 5:1-11. [13] R. N. I. Pietersz. 2009. Pooled platelet concentrates: An alternative to single donor apheresis platelets? Transfusion and apheresis science. 41:115-119. 14