Växtbioteknik (Eller: Transgena Växter) Ines Ezcurra Docent i molekylär genetik, Träbioteknik, KTH Bioteknologi ines@biotek.kth.se
Växtbioteknik - Historik och GMO kontroversen - Lagstiftning & regler - Transgena växter: metoder - Large-scale biology - Industriella tillämpningar
Definition: Växtbioteknik = Modifiering av växtcellers proteinuttryck med hjälp av rekombinant DNA teknik Exempel: Stabila transgener, "transient" uttryck, gene silencing
Historik och GMO kontroversen
Jordbrukets revolutioner: - 20 000-3 000 BC: Den neolitiska revolutionen m.h.a. domesticering av grödor. - 60-talet: Den gröna revolutionen m.h.a. hybridgrödor, bevattning, konstgödsel. - 90-talet: Växtbiotekniska revolutionen?
GMO kontroversen Den första GMOn var Flavr Savr tomaten, 1994, antisense polygalacturonas, mognar i plantan och förblir fast. God efterfråga, ingen kontrovers. Sen kom: - Endless Summer tomaten, saknar produktion av växthormonet etylen, förblir grön (marknadfördes aldrig p.g.a. patenttvist) - Bt majs, uttrycker Bacillus thuringiensis insekticid protein Cry9C - Roundup soja, uttrycker herbicidresistent protein EPSPS från Agrobacterium. Herbiciden glyfosat (Roundup) inhiberar växtens endogena EPSPS, som behövs för biosyntes av aromatiska aminosyror
- För alla dessa produkter: ingen självklar fördel för konsumenter, dålig info om fördelar från producenter. - Allmänheten fortfarande känslig efter galna-kosjukan 1996. - Det handlar ju om mat och miljö! Frankenfoods!!!
Några inflytelserika artiklar: - Playing God in the garden, av Michael Pollan, New York Times söndagsbilaga 1998. - Monark fjärilen vs. Bt-majs, artikel i Nature 1999. - Kontamination av transgen majs i gamla majssorter i Mexico, artikel i Nature 2000.
Antiglobaliseringsrörelsen 1999 tog ställning mot GMOs och Monsanto. José Bové under en anti-gmo protest i Mars 2006
Anti-GMO argumenten handlar ofta om den moderna jodbrukens problem & dilemma, och om jordbrukspolitik, snarare än om GMOs.
Lagstiftning i Sverige och EU All verksamhet som gäller GMO kräver tillstånd av en myndighet, som bör analysera miljö- och hälsorisker samt konsekvenser av eventuella skador. Detta gäller: - Utsläppande på marknaden, det vill saga försäljning eller användning i olika produkter - Försöksodling i fält - Innesluten användning, till exempel i växthus och i laboratorier GMO skall alltid märkas!!! på labb, i växthus, på fält, i den färdiga produkten
Debatten håller på att vända: - Växtbioteknologi växer i hela världen, särskilt i 3:e världen. T.ex. utvecklingen i Argentina: soya export skapar $$$-inflöde, jordbruket & ekonomin blomstrar - Fågelinfluensan skapar vaccinbehov - Energikrisen skapar behov av biobränsle, Greenpeace reviderar uppfattning - Tekniska genombrott för produktion av terapeutiska proteiner i växter
Increased yields
Some economic statistics (Argentina 2005)
Transformation av växter
Transformation av växter Stabila transformanter: ärftlig modifiering GMOs Transient" uttryck: icke-ärftlig modifiering ej GMO Transient GFP uttryck
Agrobacterium transformation: Ti = tumor inducing T-DNA = transferred DNA
Ti-plasmiden = en naturlig växtvektor Auxin & Cytokinin: växthormoner Opiner - syntes & secretion från tumörer - används som C-källa av A. tumefaciens Border sekvens (höger): krävs för T-DNA integrering vir-gener Transfer + integrering av T-DNA Ori: startpunkt för replikation
Modifierade Ti plasmider = växtvektorer, även kallade binära vektorer (t.ex. kanamycin R ) Vir-generna i Agrobakterium cellen genom en modifierad Ti-plasmid utan T-DNA
Transformation av tobak 1 2 1. Co-cultivation: sterila bladbitar + Agrobacterium 2. Vävnadskultur under selektion + hormoner som inducerar skott & rötter 3. Stabila transformanter 3
Biolistik - transformation med helium-drivna gene guns - Bra för arter som inte kan transformeras med Agrobacterium, t.ex. sädesslagen. - Även för transient uttryck. - Guldpartiklar med höghastighet
Transient GUS activity in bombarded immature wheat embryos
Promotorer och reportergener: PROMOTER X GENE X PROMOTER X REPORTER GENE By ex. GUS, LUC, GFP Reportergen aktiveras under samma omständigheter som GEN X
Växtpromotorer: viktiga verktyg för växtbioteknik 35S (från växtvirus) ubiquitin konstitutiva napin Inducerbara: Glucocorticoid receptor system: induceras med dexometason, kräver uttryck av GR-fusion Hsp: heat shock promoter, induceras vid ~50 C fröspecifik AD DB RE GR + dex Y.F.P.
Reporter gener: Kan selekteras Hystokemisk analys Kvantitativ analys GUS, ß-glukuronidas - ja ja LUC, luciferas - ja - GFP - ja - kanamycin R ja - - hygromycin R ja - - streptomycin R ja - - klassiska reporters selektionsmarkörer
GA1 Histokemisk GUS analys med olika växt promotorer PAL840 Napin LeExt1
Transient uttryck: agroinfiltration ~ 5 d Agrobakterium kultur pressas in i bladet genom klyvöppningar i bladets undersida.
Virala vektorer: Levereras med hjälp av Agrobakterium Binär vektor: T-DNA innehåller växtpromotor plus TMV (tobacco mosaic virus) genom, plus kodande delen för givet målprotein RB Växtpromotor Virus replikas Virus movement protein Målprotein RB (RNA) mrna = RNA virus (protein) REPLICASE Målprotein REPLICASE = RNA-dependent RNApol (sense type)
Teknisk genombrott med virala vektorer
Upp till 80 % av bladets proteininnehåll!!! Marillonnet et al. 2005, Nature Biotechnology 23:718
Magnifection:
Magnifection teknologi & 100x100 m 2 facilitet 400 kg ren protein per år!!! (påstår författarna)
VIGS = viral induced gene silencing Första ssrna produceras genom Agrobacterium transformation, m.h.a. binär vector innehållande virus cassette. RdRP = RNAdependent RNApol RISC = RNA induced silencing complex
En binär vektor för VIGS RdRP = RNA-dependent RNApol CP = coating protein
Systems Biology
Animals Model Plants Dicots Populus Arabidopsis 150-200 Ma Angiosperms Monocots Gymnosperms Rice Seed plants Seedless plants 400 Ma? 1600 Ma Physcomitrella patens
Växtgenom - internationella initiativ Kartlagda genom: Arabidopsis thaliana Rice Populus trichocarpa Physcomitrella patens, mossa Pågående initiativ: Tobacco Arabidopsis lyrata Lotus japonicus (model för legymer) Sorghum Brachypodium, (model för gräss & sädesslag) Cotton Cassava
The Arabidopsis Genome Initiative: - Genomet 2000 - The 2010 Project: funktion av alla 25 000 gener!!! Mycket har åstadkommits på 5 år, se TAIR (The Arabidopsis Information Resource) http://www.arabidopsis.org/ - Fortsättning följer: The 2020 Project diskuteras
Genomet är bara början; slutmålet är att skapa en virtuell växt Gen Genomik mrna Transcriptomik Protein Metabolit Proteomik Metabolomik Bioinformatik Virtuell växt Kolhydrat Glycomics Fenotyp Fenomik
Skogsbioteknik - Skogen saknar både domesticering och en grön revolution p.g.a. long generationstid; det tar 15-30 år för våra skogsträd att blomma!!! - Blomningsmekanismer avslöjade av svenska forskare 2005. En av årets viktigaste upptäcker enligt Science början av en trädförädlings revolution? - Bioteknologi behövs för snabbare och mera precis förädling
Large-scale biology på träd Poppel genomet färdig 2006 Populus trichocarpa, jättepopel Sverige världsledande på skogbioteknologi: - Berzelii Center för Skogsbioteknik vid UPSC 2006 - skogsbioteknik - BioMime vid KTH & UPSC 2005 - nya träfibrer - FUNCFIBER vid UPSC & KTH 2005 - vedbiologi
Gen-vaskning under cellulosabiosyntes: (=gene mining) A B C D E Tissue section A = Cambium B = Early expansion C = Late expansion D = Early 2 wall E = Late 2 wall On-going process Cell division, 1 wall formation 1 wall formation 1 and 2 wall formation Cellulose synthesis Lignification, programmed cell death Expected up-regulated genes Cell-cycle genes Inhibitors of cell division, genes involved in expansion Genes involved in expansion and regulation of the transition 1 / 2 wall Genes involved in cellulose synthesis Genes involved in lignin synthesis and ray metabolism
Globalt genuttryck under xylemutveckling Microarray analysis D Genes upregulated during secondary cell wall formation Bioinformatics 20 15 10 5 0-5 -10 Genes upregulated in D D up-regulated genes PH A B C D E CAZymes and other interesting targets Functional characterization
Skogsbioteknik: farhågor & kontrovers - Plantageskog vs urskog: skogens värde för fritid & rekreation - Genflödet för träd upp till 1000 km
xx Industriella tillämpningar
Biobränsle: Sockerrör socker bioetanol Stärkelse socker bioetanol Cellulosa socker bioetanol Cellulosanedbrytning: med svagsyrahydrolys plus cellulaser (från svampar). Mest energikrävande alternativ, dock är cellulosa den mest förekommande biopolymer i jorden, så potentialen är stor. Stora forskningsinsatser just nu för att effektivisera försockring av cellulosa.
Internationella satsningar på biobränsle 2007 US Dept of Energy (DOE) och BP (British petroleum satsar $800 miljoner på två stora forskningscentra Målet: att effektivisera produktion av bioetanol från cellulosa - Cellulosanedbrytande enzymer - Nya snabbväxande arter - Transgena växter modifierade för lättare nedbrytning av cellulosa - Fermentationsprocessen
BP-satsningen BP (British Petroleum) satsar 500 miljoner dollar för att skapa nytt forsknings-centrum i Berkeley, CA, kallad EBI, Energy Biosciences EBI, utvecklar metoder för kostnadeffektiv och 'kol-neutral' global energi produktion Tvärvetenskaplig forskning: biologi - genomik - ingenjörsvetenskap - materialvetenskap - kemi - fysik
Forskning på EBI o Solenergi Växtfibrer Sockerarter Biobränsle GM växter Enzym teknologi, kemi, fysik Modellväxter: snabbväxande gräs, typ elefantgräs och hirs (Panicum, Miscanthus) & jättepoppel
Biobränsle i Sverige: Antalet miljöbilar ökar snabbt 80 % av allt bioetanol i Sverige har importerats från Brasilien. Nytt för 2006: tullar skyddar svensk biobränsle industri SEKAB & etanolpiloten i Örnsköldsvik: etanol av cellulosa Agroetanol i Norrköping: etanol av spannmål
Andra internationella satsningar Biobutanol av Dupont & BP: i marknaden 2008
PMPs: Plant made pharmaceuticals - Vacciner - Antikroppar - Enzymer - Bioaktiva proteiner tillväxtfaktorer cytokiner antimikrobiella proteiner från modersmjölk
Ventria Bioscience: humana modersmjölksproteiner, lactoferrin & lysozym, från transgen ris Studie i Peru visar att Ventrias proteiner är effektiva mot akut barndiarré.
Två miljoner barn dör i akut barndiarré varje år i världen
Agroindustriella tillämpningar: herbicidresistens
No tillage technology requires herbicide application & herbicide resistant crops reduces soil erosion, nutrient leakage and fossil fuel consumption reduces water evaporation from the soil sequesters carbon in the soil lower emission of greenhouse gases increases net profits by significantly reducing machinery and labor costs and fossil fuel consumption
Plogningsfri odling i Youtube: odling av GM-solrosor i Argentina
No-tillage corn in US
Roundup technology The company: Monsanto The herbicide: glyphosate (Roundup) The plant target protein: EPSPS, an enzyme acting in the shikimate pathway that yields aromatic amino acids and secondary plant products. Resistance: by introducing EPSPS from resistant microbial sources
Ökad motstånd mot torka och vattenstress
ERA1 technology era1 mutant: enhanced response to abscisic acid (Pei et al. 1998, Science 282:287) The mutant has increased response to ABA This causes the stomata to close earlier and more tightly ERA1 is a farnesyltransferase, but its protein targets are unknown
YPT, yield protection technology based on ERA1 Drough-responsive promoter plus ERA1 antisense = YPT technology, licenced to Performance Plants from Canada transgenic YPT rapeseed resistant to drought
YPT canola yields better under diverse field conditions 2002 2003 2003 2004