2009-01-14 005/209 1(5) Gentekniknämndens policy angående antibiotikaresistensgener i växtmaterial Gentekniknämndens policy Gentekniknämnden har den principiella uppfattningen att selektionsgener som åstadkommer resistens mot antibiotika som används som läkemedel inte ska tillåtas i genetiskt modifierade växter. Undantaget är de resistensgener som redan är vitt spridda i jord- och i mag/tarmbakterier och som ger resistens mot antibiotika som har begränsad användning inom human- och djursjukvården, dvs. gener som ger resistens mot kanamycin (nptii) och hygromycin (hph). Nämnden kommer däremot att inta en restriktiv hållning till ansökningar vad gäller växter som innehåller gener som åstadkommer resistens mot andra än ovan angivna antibiotika. Bakgrund Antibiotika är kemiska substanser som naturligt produceras av olika arter av mikroorganismer, och som används inom human- och djursjukvården för att behandla bakterieinfektioner. Dessa substanser hämmar tillväxten av andra mikroorganismer och kan slutligen döda dem. Konkurrens mellan olika organismer är troligtvis anledningen till att dessa antibiotika finns i naturen. Idag framställs många antibiotikapreparat syntetiskt. Selektionsgener inom växtförädlingen. Med genteknik kan man överföra enstaka gener från olika organismer in i växtceller. För att kunna identifiera och isolera en cell som har tagit upp en gen kopplas denna till en s.k. selektionsgen. Som selektionsgen används ofta gener som åstadkommer resistens mot antibiotika eller tolerans mot ogräsbekämpningsmedel (herbicider). När kemikalien (antibiotikan eller herbiciden) tillsätts odlingsmediet överlever endast de celler som har tagit upp generna, och dessa celler kan därefter utvecklas till en transgen planta. Inom växtförädlingen är det i första hand nptii-genen, som ger resistens mot bl.a. antibiotikan kanamycin, som är aktuell men även hph, som ger resistens mot hygromycin, används ofta då en transgen växt som redan har nptii genen skall transformeras med ytterligare gener. Horisontell genöverföring. Ett naturligt förekommande fenomen som innebär att gener, under vissa förutsättningar, förflyttas mellan olika arter av organismer såsom bakterier, svampar, och växter. Hur stor är risken för horisontell genöverföring från växter till bakterier? Genöverföring mellan bakterier. Det finns tre kända mekanismer i naturen som förmedlar horisontell genöverföring till bakterier, och som därmed kan leda till att bakterien blir resistent mot en viss typ av antibiotika. Konjugation (överföring via plasmid eller transposon) är den vanligaste genöverföringsmekanismen, följt av transduktion (överföring via bakterievirus). När det gäller en eventuell överföring av genetiskt material från en växt till en bakterie i naturliga miljöer är dock transformation den troligaste mekanismen. Naturlig transformation innebär att en bakterie tar upp fritt DNA från omgivningen. Cirka 2 % av alla beskrivna bakteriearter har förmåga att under vissa förhållanden bli naturligt
2009-01-14 005/2009 2(5) kompetenta, något som är en förutsättning för att ett upptag av DNA ska vara möjligt. Vissa av dessa bakteriearter tar dock endast upp DNA från den egna arten. Tarmbakterien E. coli hör inte till de arter som har förmåga att bli naturligt kompetenta. Genöverföring från bakterier till växter. Jordbakterien Agrobacterium tumefasciens har förmågan att överföra gener till växtceller, något som leder till s.k. krongallsjuka. De gener som överförs integreras i växtens kromosomer och producerar bl.a. ämnen som fungerar som näringskälla för bakterierna. Agrobacterium är ett viktigt verktyg inom växtbiotekniken. Genom att byta ut de gener som bakterien naturligt överför till växten kan man få Agrobacterium att föra in andra, önskvärda gener. Genöverföring från växter till bakterier För att en gen från en växt ska kunna tas upp av en bakterie, integreras stabilt i bakteriens genom och uttryckas (producera protein) måste följande krav uppfyllas: 1. Genen måste vara intakt. DNA bryts normalt ned i naturen av DNA-nedbrytande organismer och i mag-tarmkanalen med hjälp av surt ph och DNA-nedbrytande enzymer. 2. För att upptag ska ske via naturlig transformation måste bakterien vara i ett stadium av kompetens, dvs. ha förmågan att ta upp fritt DNA från omgivningen. 3. DNA-fragmenten måste stå emot bakteriens försvar mot inkommande DNA. Bakterier producerar enzymer som bryter ner främmande DNA. 4. Genen måste ha viss likhet (homologi) med bakteriegenomet för att genen ska kunna integreras i bakteriekromosomen via rekombination. 5. För att genen ska integreras stabilt i bakteriens genom och resistensgenen spridas i en population är närvaron av ett selektionstryck, i detta fall antibiotikan i fråga, av största vikt. Genöverföring mellan olika riken i organismvärlden är starkt begränsad. När det gäller överföring av biologiskt aktiva växtgener till bakterier under naturliga förhållanden har detta direkt aldrig påvisats men kan härledas fylogenetiskt. Däremot har man visat att man under optimala laboratorieförhållanden kan få ett upptag och en integrering av en växtgen i bakteriens genom. Detta krävde att kompetenta bakterier användes, att homologi skapades genom att mottagarbakterien tillfördes en inaktiv nptii-genen, samt att bakterierna utsattes för ett selektionstryck genom att kanamycin tillsattes till bakterieodlingsmedlet. Vad blir konsekvensen av en eventuell genöverföring? Vi kan konstatera att under flera miljarder år har med mycket låg frekvens gener eller bitar av gener flyttats mellan organismer, bland annat mellan växter och bakterier. För att en genöverföring ska få någon bestående effekt måste genen i fråga bidra till bakteriens överlevnadsförmåga. Under evolutionens gång gör bakterier sig av med onödigt genmaterial eftersom det "kostar" att uttrycka gener som kodar för ämnen (t.ex. proteiner) som det inte finns användning för. Följaktligen finner man inte heller gener eller delar av gener från växter eller djur som verkar ha överförts horisontellt till tarmbakterien E.coli, vars hela genom idag är sekvensbestämt. Om en gen som ger resistens mot ett antibiotikum förts över till en bakterie som en fungerande enhet kommer konsekvensen bli att bakterien i fråga kan överleva och dela sig i närvaro av aktuellt antibiotikum.
2009-01-14 005/2009 3(5) Vid riskbedömningen av en sådan händelse i mag-tarmkanalen måste man således väga in följande: 1. Används aktuellt antibiotikum i medicinskt syfte? 2. Återfinns resistens mot detta antibiotikum normalt bland jord- och mag/tarmbakterier? 3. Den vanligaste orsaken till resistens mot antibiotika är den breda och felaktiga användningen av antibiotika inom human- och veterinärmedicinen. Är nptii genen som åstadkommer kanamycinresistens en bra selektionsgen? Resistensgenens ursprung och förekomst. Inom växtförädlingen används genen nptii (eller aph(3 )IIa - som den också benämns) som selektionsgen. Denna gen är allmänt förekommande i ett stort antal vanliga resistensplasmider hos gramnegativa bakterier (t ex. hos tarmbakterien E. coli). I jord som inte har utsatts för selektivt tryck av kanamycin, är ändå 1 bakterie av 1000 naturligt resistent. I USA har man visat att 15-20 % av proverna på tarmbakterier från friska och sjuka personer innehöll kanamycinresistenta bakterier. Man har även visat att hph-genen är allmänt spridd bland bakterier. Kanamycinets verkningsmekanism. Antibiotikan förhindrar normal proteinsyntes (genom att binda till bakteriens ribosomer). Detta leder i sin tur till att bakterierna dör. Kanamycinresistensgenens verkningsmekanism. Genen nptii (neomycinfosfotransferas II) kodar för ett protein som fosforylerar kanamycinet, dvs. en fosfatgrupp binder till kanamycinet. Därmed förhindras antibiotikan från att binda till bakteriens ribosomer och utöva sin effekt. Toxicitet. Det protein som nptii genen kodar för har noga analyserats och befunnits vara varken toxiskt eller allergent. Egenskaper och korsresistens. nptii-genen åstadkommer resistens mot kanamycin, neomycin, paromomycin, ribostamycin, butirosin, gentamicin B och geneticin. Av dessa används kanamycin, neomycin och paromomycin som läkemedel. Vissa varianter av nptii-genen som används inom växtförädlingen ger endast resistens mot kanamycin, neomycin och geneticin. Produkten av genen nptii har ingen aktivitet mot aminoglykosiderna gentamicin, tobramycin och netilmicin. En viss aktivitet mot amikacin finns beskriven, men den aktiviteten har inte visats vara kliniskt betydelsefull. Kanamycin, neomycin och paromomycin som läkemedel. Användningen av kanamycin och neomycin inom human- och veterinärmedicinen är starkt begränsad på grund av dess toxiska egenskaper. Dessa antibiotika är dock godkända för behandling av livsmedelsproducerande djur i ett antal EU-länder. Inom humanmedicin används kanamycin för närvarande, i begränsad omfattning, vid behandling av multiresistenta bakterier. Paromomycin används vid behandling av intestinala protozosjukdomar som t.ex. amöbainfektioner. I Sverige finns för närvarande inga registrerade human- eller veterinärmedicinska läkemedel som innehåller kanamycin, neomycin eller paromomycin. Skulle vi i framtiden få en ökad användning av dessa antibiotika inom human- eller veterinärsjukvården, skulle antalet resistenta bakterier komma att öka via tillväxt av redan resistenta bakterier och via horisontell överföring från andra bakterier. Ett bidrag från
2009-01-14 005/2009 4(5) genetiskt modifierade växter i vår föda som innehåller nptii-genen får förväntas vara ytterst marginellt. Slutsatser 1. Det föreligger inte några kända risker för människors och djurs hälsa eller för miljön med användandet av kanamycinresistens som selektionsgen inom växtförädlingen. Detta överensstämmer med de slutsatser som har dragits av Nordiska Ministerrådet (1996), Amerikanska livsmedels- och läkemedelsmyndigheten (FDA, 1998), FN:s livsmedels- och jordbruksorganisation/världshälsoorganisationen (WHO/FAO, 2000), och Europeiska Livsmedelssäkerhetsmyndigheten (EFSA, 2004 & 2007). Samma bedömning gäller enligt EFSA för användandet av gener som ger resistens mot hygromycin (EFSA, 2004) 2. Att intakta gener från en växt skulle kunna överföras, integreras och uttryckas i en bakterie kan inte uteslutas. Det skulle dock vara en mycket sällsynt företeelse och en eventuell överföring av nptii- eller hph-genen från en växt till en bakterie skulle därmed inte bidra nämnvärt till den redan existerande poolen av antibiotikaresistenta bakterier. 3. I enlighet med försiktighetsprincipen bör dock ansökningar som gäller marknadsgodkännande av växter som innehåller andra typer av antibiotikaresistensgener än de gener som ger kanamycin- respektive hygromycinresistens behandlas mycket restriktivt.
2009-01-14 005/2009 5(5) Referenser 1) Microbial horizontal gene transfer and the DNA release from transgenic crop plants (review) de Vries and Wackernagel, Plant and Soil 266:91 (2004) 2) Transformation of Acinetobacter sp. strain BD413 by transgenic sugar beet DNA Gebhard and Smalla, Applied and Environmental Microbiology 64:1550 (1998) 3) The natural transformation of the soil bacteria Pseudomonas stutzeri and Actinobacter sp by transgenic plant DNA strictly depends on homologous sequences in the recipient cells de Vries et al, FEMS Microbiology Letters 195:211 (2001) 4) Natural background of bacterial antibiotic resistance genes in the environment. Smalla et al, Nordic seminar on antibiotic resistance marker genes in the environment, 43-57 (1997) 5) High frequency of antimicrobial resistance in human fecal flora Levy et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 32:1801 (1988) 6) Health aspects of marker genes in genetically modified plants. Report of WHO Workshop Geneva (1993) 7) Guide for Industry: Use of antibiotic resistance marker genes in transgenic plants. U. S. Food and Drug Administration, FDA (1998). 8) Health effects of marker genes in genetically engineered food plants. Nordiska ministerrådet (1996) 9) Safety aspects of genetically modified foods of plant origin. Report of a joint FAO/WHO expert consultation on food derived from biotechnology (2000) 10) Opinion of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on the use of antibiotic resistance genes as marker genes in genetically modified plants (2004) 11) Statement of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on the safe use of the nptii antibiotic resistance marker gene in genetically modified plants (2007)