EULISA ANA Screen 6 IgG

Bruksanvisning EULISA ANA Screen 6 IgG Avsedd användning Enzymimmunoanalys för detektering av autoantikroppar IgG mot RNP, Sm, Ro (SS-A), La (SS- B), Scl-70 and Jo-1 Mikrotitrering, 96 brunnar Förvara kitet vid +2-8 C Endast för in vitro-diagnostik. Dokument nr. E-23-0223-01 SE Januari 2013 EULISA Screen 6 IgG SVENSKA 214096 96

Innehåll 1. Introduktion och bakgrund 2. Varningar och försiktighetsåtgärder 3. Testprincip 4. Kitets innehåll 5. Material som krävs men som inte ingår 6. Förvaring av kitet 7. Reagens- och provberedning / provkrav 8. Analysmetod 8.1. Manuell användning 8.2. Dynex DS2 automatiskt ELISA-system 9. Utvärdering och kvalitetskontroll 10. Tolkning av resultat / metodens begränsningar 11. Prestanda 11.1. Standardisering 11.2. Analytisk specificitet 11.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) 11.4. Homogenicitet i fast fas 11.5. Linjäritet 11.6. Precision 11.7. Frekvensdistribution av dsdna-ak (IgG) 11.8. Manuell drift jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system 12. Garanti 13. Symboler 14. Referenser 15. Sammanfattande flödesschema Den produkt som beskrivs i detta dokument har tillverkats i enlighet med IVDdirektivet 98/79/EG. 2

1. Introduktion och bakgrund Cirkulerande autoantikroppar mot olika intracellulära antigener (antinukleära antikroppar, ANA) är typiska för systemiska autoimmunmedierade reumatiska bindvävssjukdomar (1, 2, 3, 4). Dessa består av systemisk lupus erythematosus (SLE), blandad bindvävssjukdom (MCTD- Mixed Connective Tissue Disease), Sjögrens syndrom (SS) A och B, progressiv systemisk skleros (PSS, sklerodermi)/crest-syndrom och polymyosit (PM). På grund av överlappande symtom är det ofta svårt att ställa diagnos på ovanstående sjukdomar och därför stöds diagnosen oftast av mätning av deras anknutna autoantikroppar. 8 antigener som specifikt känns igen av dessa antikroppar immobiliseras, rad för rad, på den fasta fasen i den aktuella enzymlänkade immunadsorbenta analysen (ELISA): antigen source disease autoantibody prevalence (5) RNP (proteins A, C, 68kDa) recombinant MCTD 95 % SLE 30-40 % PM 14 % SS 4 % Sm (proteins B, B', D) bovine thymus SLE 12-39 % MCTD 7 % SS-A/Ro (60kDa-protein) bovine thymus SS 60-100 % SLE 45-50 % MCTD 15-30 % PSS 5-7 % PM 5-7 % SS-B/La recombinant SS 30-90 % SLE 15-30 % MCTD 5-15 % Scl-70 (DNA-topoisomerase 1) recombinant PSS 20-76 % Jo-1 (Histidyl-tRNA-synthetase) recombinant PM 20-40 % The test is designed for the qualitative, summary determination of the respective autoantibodies (IgG) in human serum, without the ability to discriminate between them. It is intended as initial screen test for an overall diagnosis of the above disorders. The test is fast (incubation time 30 / 30 / 30 minutes) and flexible (divisible solid phase, ready-to-use reagents). A negative and a positive control check the assay performance. 3

2. Varningar och försiktighetsåtgärder Testkitet är endast avsett för in vitro diagnostiskt bruk och får inte användas i i eller på människor eller djur. Använd inte reagenser efter angivet utgångsdatum. Vi rekommenderar starkt att protokollet följs. Provbuffert, kalibratorer och kontroller innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Tvättbufferten innehåller bromnitrodioxan och konjugatet innehåller metylisotiazolinon/bromnitrodioxan som konserveringsmedel. Substratet innehåller 3, 3', 5, 5'-tetrametylbenzidin (TMB) och väteperozid (H2O2). Stopplösningen, 0,5 M svavelsyra (H2SO4), är sur och frätande. Ovan angivna reagenser kan vara giftiga vid förtäring. Iakttag rutinmässiga försiktighetsåtgärder vid hantering av farliga kemikalier. Undvik all kontakt med kroppen, använd handskar och skyddsglasögon. Skölj grundligt med vatten, om någon av reagenserna kommer i kontakt med hud eller slemhinnor. Pipettera aldrig med munnen. Kassera i enlighet med lokala/nationella föreskrifter. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparrör och bilda explosiva metallazider. Spola med stora mängder vatten vid kassering för att undvika ansamling av azider. Kalibratorer och kontroller innehåller komponenter som härrör från människor. De har visat negativa resultat vid tester för humant immunbristvirus (HIV)-ag, hepatit B yt-(hbs)-ag, HIV 1/2-ak samt hepatit C-virus (HCV)-ak, i tester som uppfyller FDA:s krav eller kraven i EU:s direktiv 98/79/EG. Det finns emellertid inga kända tester som kan garantera att produkter som härleds ur humant blod är fria från smittämnen. De måste därför hanteras som om de är smittbärande och kasseras på lämpligt sätt. Läs CDC:s (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andra lokala/nationella riktlinjer beträffande laboratoriesäkerhet och dekontamineringsrutiner. 3. Testprincip Brunnarna i den fasta fasen bestryks med a balanced mixture of the autoantigens quoted above. På denna yta kommer följande immunologiska reaktioner att äga rum: 1:a reaktionen: Antigen-specifika antikroppar i provet binder till det immobiliserade antigenet och bildar ett antigen-antikroppskomplex. Därefter tvättas obundna provkomponenter bort från den fasta fasen. 4

2:a reaktionen: En andra antikropp, riktad mot humana IgG-anti kroppar och konjugerad med HRP (pepparrotsperoxidas) tillsätts. Detta konjugat binds till komplexet. Därefter tvättas överflödigt konjugat bort från den fasta fasen. 3:e reaktionen: Det enzymmärkta komplexet omvandlar det färglösa substratet till en blå produkt. Graden av färgutveckling reflekterar koncentrationen av antigen-specific -antikroppar (IgG) i provet. 4. Kitets innehåll a. 1 mikrobrunnsplatta som belagts med a mixture of the above antigens och förpackats hermetiskt i en folielaminatpåse tillsammans med en påse med torkmedel. Plattan består av 12 remsor som var och en kan delas upp i 8 enskilda brunnar. b. Provbuffert, 100 ml, klar att användas, orange. Innehåller trisbuffrad koksaltlösning (TBS), bovint serumalbumin (BSA), tween och natriumazid. c. Tvättbuffert, 100 ml, 10x-koncentrat, blå. Innehåller TBS, tween och bromnitrodioxan. d. Negativ och positiv kontroll, 2,0 ml vardera, klara att använda, gröna respektive röda. Innehåller TBS, BSA, tween och natriumazid. e. Anti-humant IgG HRP-konjugat, 14 ml, klart att använda, rött. Buffrad lösning som innehåller stabiliseringsprotein, metylisotiazolinon samt bromnitrodioxan. f. Substratlösning, 14 ml, klar att använda, färglös. Innehåller en buffrad lösning av TMB och H2O2 i en flaska som är ogenomtränglig för ljus. 5

g. Stopplösning (0,5 M H2SO4), 14 ml, färglös, klar att användas. Varning: Svavelsyra är frätande. h. Bruksanvisning i.lot-specifikt analyscertifikat 5. Material som krävs men som inte ingår a. Avjoniserat eller destillerat vatten b. Graderad cylinder, 1 000 ml c. Rör för provspädning (överföringsrör i mikrobrunnsplattans format rekommenderas) d. Pipetter för 10, 100 och 1 000 µl (pipetter med 1 och 8 kanaler rekommenderas) e. Tvätt för mikrobrunnsplatta (tillval) f. Fotometer för mikrobrunnsplatta, försedd med ett 450 nm filter g. ELISA utvärderingsprogram (rekommenderas) 6. Förvaring av kitet Förvara kitet vid 2-8 C. Det är stabilt fram till det utgångsdatum som anges på kartongens etikett. Använd inte kitet efter utgångsdatumet. 7. Reagens- och provberedning / provkrav Komponenter från olika kit får inte bytas ut mot varandra eller slås samman, på grund av eventuella varierande frakt- eller lagringsförhållanden. 6

a. Innan påsen till den fasta fasen öppnas måste den ha nått rumstemperatur. Ta ut de mikrobrunnar som inte behövs ur ramen och lägg omedelbart tillbaka dem i påsen, tillsammans med påsen med torkmedel. Återförsegla påsen hermetiskt och förvara den i kylen för framtida användning. b. Späd ut tvättbufferten (10x-koncentrat [100 ml, blå]) med 900 ml avjoniserat vatten. Blanda noga. Den utspädda bufferten är stabil i flera veckor vid förvaring i kylskåp (2-8 C). c. Beredning av proverna: Hantera patientproverna som om de kan överföra smittämnen. Förbered sera med vedertagna laboratoriemetoder och späd 1/100, t.ex. 10 µl serum + 990 µl provbuffert. Blanda noga. För snabb dispensering under analysen rekommenderas att kalibratorer, kontroller och prover förbereds i överföringsrör för mikrobrunn. Detta möjliggör användning av en pipett med 8 kanaler under analysen. Om proverna inte analyseras omedelbart ska de förvaras vid 2-8 C och analyseras inom 3 dagar. Vid längre förvaring rekommenderas en temperatur på -20 C eller lägre. Upprepad frysning och upptining av sera bör undvikas. Upptinade prover måste blandas före spädning. Provkrav: Sera med hög fetthalt eller sera som är hemolyserat eller mikrobiellt kontaminerat kan ge felaktiga resultat och bör undvikas. 8. Analysmetod 8.1. Manuell användning Innan analysen påbörjas måste alla komponenter i kitet ha uppnått rumstemperatur (23 ± 3 C). För bästa resultat, d.v.s. maximalt förhållande mellan specifik signal och bakgrundssignal, är noggrann tvätt avgörande (steg a, c och e). Det är av yttersta vikt att tvättlösningen avlägsnas helt och hållet. För detta ändamål torka ordentligt plattan mot flera lager av absorberande papper. Automatiska tvättar måste verifieras mot resultat som uppnås med manuell tvätt. a. Precis före användning ska den fasta fasen tvättas en gång: fyll brunnarna med 350 µl tvättbuffert i varje, blötlägg i cirka 10 sekunder i brunnarna och avlägsna. 7

b. Dispensera kalibratorerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gradvis blå), kontrollerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gröna och röda) samt de utspädda proverna snabbt i mikrobrunnarna; 100 µl per brunn. Duplicerade mätningar rekommenderas. Inkubera plattan i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). c. Tvätta brunnarna 4 gånger som i steg a. d. Dispensera konjugatet (14 ml, klart att användas, rött) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. e. Upprepa tvättmomentet i steg c. f. Dispensera substratlösningen (14 ml, klar att användas, färglös, svart flaska) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. Eftersom substratet är ljuskänsligt bör exponering för intensivt ljus undvikas (t.ex. direkt solljus) under inkubationen. g. Dispensera stopplösningen (14 ml, klar att användas, färglös. Varning: frätande!) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Använd samma sekvens som för substratet. Färgen ändras från blå till gul. Skaka plattan, företrädesvis på en orbital skakapparat i cirka 10 sekunder. h. Läs omedelbart av absorbansen i mikrobrunnsplattans fotometer vid 450 nm. Förvara återstoden av reagenserna i kyl (2-8 C) om de ska användas igen. 8.2 Dynex DS2 automatiskt ELISA-system Denna produkt har validerats för användning med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system. En lämplig programfil för genomförande och utvärdering av analys tillhandahålls på begäran. Parametrarna i detta program är endast ett förslag och kan behöva anpassas av användaren till kraven i den faktiska analysen. Vi har generellt försökt att hålla oss så mycket som möjligt till protokollet vid en manuell användning, enligt ovan. På grund av den av nödvändighet högre temperaturen inuti DS2, har inkubationstiden för substratet gjorts kortare. Paragraf 11.8. innehåller en prestationsjämförelse mellan manuell analys och DS2 ELISA-systemet. 8

9. Evaluation and quality control Testet utvärderas kvalitativt, absorvansen av proverna jämförs med cut-off absorbansen. Vid kvalitativ testutvärdering jämförs absorbansen hos proverna med gränsabsorbansen (= cut-off). Den fastställs enligt följande formel: absorbansgränsvärde = absorbanspositiv kontroll x faktor Faktorn beror på kit-loten och anges i det lotspecifika analyscertifikatet som medföljer varje testkit. Exempel: absorbanspositiv kontroll = 1 250 mod faktor = 0,35 absorbansgränsvärde = 1 250 mod x 0,35 = 438 mod För att få en uppskattning av hur positivt ett visst prov är för dsdna-ab (IgG), kan man beräkna kvoten, enligt följande formel: kvot = absorbansprov / absorbansgränsvärde Exempel: Absorbansgräns = 438 mod absorbansgräns = 1 480 mod kvot = 1 480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontroll: Den positiva och negativa kontrollen kontrollerar analysens prestanda. Deras auktoriserade värden respektive godkända intervall anges i det lotspecifika analyscertifikatet. Kontrollernas värden måste falla inom de angivna intervallen, annars är analysresultaten ogiltiga. 9

10. Tolkning av resultat / metodens begränsningar Med utgångspunkt från mätning av en blodgivare och ett urval positiva sera (se nedan), föreslår vi för analys av patientsera: ratio normal (negative) range < 0,82 cut-off 1,00 equivocal range 0,82-1,20 positive range > 1,20 Dessa specifikationer anges endast som en indikation. För att kontrollera exaktheten bör varje analys inkludera parallella prover av normala sera. Ett negativt testresultat anger att patienten inte har förhöjda nivåer av IgGantikroppar mot IgG till de antigen som listas i kapitel 1. Därför kan inte systemic rheumatic disease uteslutas även om det är ovanligt.. Om kliniska symtom på SLE ändå observeras kan ytterligare anti-nukleära antikroppar bestämmas. Eftersom dsdna-autoantikroppar sällan observeras hos normala individer bör ett positivt resultat anses utgöra en indikation för SLE. I några få fall uppstår emellertid dsdna-antikroppar i vissa andra autoimmuna sjukdomar. Eftersom dsdna-autoantikroppar sällan observeras hos normala individer bör Ett positivt resultat anses utgöra en indikation för en av de ovan listade sjukdommarna. En uppföljande diagnos bör göras, där den specifika antikroppen och därmed identifiering av den autoimmuna sjukdommen bestämms. I några få fall up. Detta kan göras med en differentieing i en profil ELISA. Prover som visar resultat mellan ovan angivna gränser bör anses vara obestämbara och rapporteras som sådana. Vi rekommenderar att ytterligare ett prov görs två veckor senare och körs parallellt med det första provet för att dokumentera eventuell förändring i antikroppstitern. I likhet med alla serologiska analyser bör resultaten tolkas mot beaktande av patientens symtom och andra diagnostiska kriterier. 10

11. Prestanda 11.1. Standardisering Testet är standardiserat med en renad serumberedning som innehåller IgGantikroppar som är specifikt inriktade mot varje antigen. Denna beredning består av lager material för båda controller av testet. Proportionen av antikropparna är anpassad på så sätt att varje bidrar på med samma del till den övergripande signalen. 11.2. Analytisk specificitet Testet medger specifik bestämning av humana IgG-antikroppar, riktade mot de antikroppar som refereras a section 1. Testet har blivit valdiderat (bland annat) med humant serum från Center of Disease Control (CDC;Atlanta, USA) som är kommersiellt tillgänglig. Följande värden är typiska: Serum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CDC- ds- SS-B -- U1- Sm -- SS-A -- Scl- Joresult DNA /La RNP /Ro 70 1 Immun- homo- speck- speck- -- -- nuc- -- centro- -- -- fluoresc. gen led led leolar mere ratio 2,1 8,7 7,6 3,3 8,4 1,0 6,2 0,3 6,6 8,2 Notera: Den korresponderande ANA Profile 8 ELISA som särskiljer mellan de olika antigenen visar: Serum # 1 reagerar inte bara med dsdna utan också med Sm. Serum # 6 cisar ratio värdens 1 mot alla enstaka antigener-. Serum # 8 reagerar starky mot centromere-protein B som inte är inkluderat I antigen området av den nuvarande ANA Screen 6 ELISA. 11.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) Detektionsgränsen definieras som den koncentration av analytet som motsvarar genomsnittlig absorbans av provbuffert plus 3-faldig standardavvikelse (s). Det fastställdes som < 0,4 (ratio; n = 24). Rekommenderat mätintervall: 0,5 < ratio < 6 11.4. Homogenicitet i fast fas Mätning av homogenicitet i fast fas är en normal del av kvalitetskontrollen av varje produktionslot. Det bestäms genom 288-falding mätning av ett IgG-positivt prov som inte är saturerande på 3 valda plattor. Kriterium för godkännande: mod-variationskoefficient (cv) över plattorna < 8 %. 11

Bilden nedan visar ett typiskt utdrag (fast fas lotnr. 2308I) av en sådan analys. plate early (n/10) late (9n/10) mean cv% row 1 2 6 7 11 12 1 2 6 7 11 12 line a 1464 1480 1490 1527 1476 1475 1490 1492 1495 1461 1478 1525 1488 1,4 line b 1514 1522 1528 1511 1487 1489 1472 1480 1504 1534 1484 1519 1504 1,4 line c 1488 1520 1518 1531 1524 1509 1464 1503 1529 1506 1463 1484 1503 1,6 line d 1517 1500 1518 1524 1533 1529 1497 1508 1528 1522 1461 1491 1511 1,4 line e 1504 1492 1499 1472 1473 1503 1471 1483 1498 1501 1497 1457 1488 1,1 line f 1480 1482 1468 1505 1478 1498 1438 1502 1503 1488 1510 1515 1489 1,4 line g 1493 1465 1478 1493 1512 1507 1457 1460 1481 1483 1475 1500 1484 1,2 line h 1545 1516 1504 1519 1517 1496 1466 1487 1504 1497 1468 1457 1498 1,7 mean 1501 1497 1500 1510 1500 1501 1469 1489 1505 1499 1480 1494 1495 cv% 1,7 1,4 1,4 1,3 1,6 1,1 1,3 1,0 1,1 1,5 1,1 1,8 1,5 12

line a line b line c line d line e line f line g line h 0 400 800 1200 1600 mod 450nm 1600 1200 mod 450nm 800 400 0 1 2 6 7 11 12 1 2 6 7 11 12 early / late plate, row no. 0911FE00.FED/FphHomV1410J 11.5. Linjäritet För att bedöma testets dos-responsförhållande, flera omgångar av individuelle serum med heterogen reaktivitet mättes i seriell 2-faldig spädning. Ett typiskt resultat visas nedan. En ungefärlig relation mellan prov concentration and resultat ratio är begränsat till värden < 2. Detta beror på den kvalitativa utvärderings modellen (se section 9) och kntrast ELISAs som är utvärderade kvantitativt genom en standard kurva. 13

8 6 sera pool 1 sera pool 2 sera pool 3 ratio 4 2 0 0 200 400 600 800 1000 nl sera pool / well 0911FE00.FED/LinearV1410J 11.6. Precision För att bedöma testets precision fastställdes resultatens variabilitet under följande förhållanden: a. inom 1 analys och mellan 3 analyser, b. mellan 3 operatörer och c. mellan 2 kit-loter. a. Variabilitet inom analys och mellan analyser (n = 24 respektive 72) prov ratio variabilitet (cv %) inom analys mellan analyser 1 1,2 3,0 3,3 2 3,2 2,0 3,0 3 4,9 1,8 4,1 b. Variabilitet mellan operatörer (n = 12) prov ratio variabilitet (cv %) 1 1,2 1,7 2 3,2 1,7 3 4,7 1,8 14

b. Variabilitet mellan 2 kit-loter (n = 6) prov ratio variabilitet (cv %) 1 1,0 11,9 2 2,9 11,9 3 4,4 9,2 11.7. Frekvensdistribution av ANA (IgG) Detta analyserades i sera från blodgivare, jämnt fördelat mellan kön och ålder och från sera som befunnits positiva genom oberoende metoder (tex monospecific, CE-compliant reference ELISAs, immune fluorescence assays (IFA)) där åtminstone en parameter var kliniskt fastställd. Följande fördelning av analyt observerades (S=standard avvikelse): blood donor sera positive sera n: 160 n: 63 mean: ratio = 0,49 mean: ratio = 7,3 mean + s: ratio = 0,84 mean - s: ratio = 5,4 mean + 2s: ratio = 1,19 mean - 2s: ratio = 3,5 median: ratio = 0,40 median: ratio = 7,8 95 th percentile: ratio = 0,94 5 th percentile: ratio = 2,9 ROC-analys av dessa data användes för att bestämma gränsvärdet som ANA Screen 6 ELISA according to (6). De data som visas här visar på en diagnostisk specificitet och sensitivitet hos denna ELISA på cirka 96 % respektive nästan 100 %. Dessa värden gäller endast analyserade sera; typer av provsamlingar kan ge andra resultat. 15

blood donor sera 50 relative frequency (%) 40 30 20 10 cut-off 0 < 0,1 0,118-0,139 0,164-0,193 0,228-0,268 0,316-0,373 0,439-0,518 0,611-0,72 0,848-1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 ratio positive sera 50 relative frequency (%) 40 30 20 10 cut-off 0 < 0,1 0,118-0,139 0,164-0,193 0,228-0,268 0,316-0,373 0,439-0,518 0,611-0,72 0,848-1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 ratio 0911FE00.FED/HäufgPlotV1410J 16

11.8. Manuell förfarande jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system Variabilitet: Genom att använda prover från en och samma kit-lot, jämfördes analysresultatens variabilitet mellan manuell användning och Dynex DS2 automatiskt ELISA-system: manuell användning Dynex DS2 variabilitet inom analys medelvärde cv = 1,4 % medelvärde cv = 1,9 % (n = 16) variabilitet mellan analyser medelvärde cv = 2,3 % medelvärde cv = 3,6 % (n = 48) Standardkurva: visas i paragraf 9 Korrelation: 6,00 Dynex DS2 (ratio) 4,00 2,00 y = 1,01 x r = 0,998 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 manual operation (ratio) 0911FE00.FED/KorrDynexDS2-V1410J 17

12. Garanti Euro Diagnostica AB garanterar att levererad produkt har testats grundligt för att säkerställa att de egenskaper som specificeras här har uppfyllts. Inga ytterligare garantier lämnas. De prestationsdata som presenteras här erhölls med användning av angiven metod. Eventuell modifikation av metoden kan påverka resultaten varvid Euro Diagnostica AB friskriver sig från alla garantier, såväl uttryckliga som underförstådda eller lagstiftade. Euro Diagnostica AB bär inte heller något ansvar för eventuella skador, vare sig direkta, indirekta eller efterföljande som uppstår till följd av felaktig användning eller förvaring av produkten. 13. Symboler Katalognummer Satsnummer Innehåller tillräcklig mängd för <n> tester Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik Conformité Européenne Skyddas från solljus 18

Temperaturgränser Hållbar till Varning Biologiska risker Tillverkare 14. Referenser 1. Nakamura, R. M., Tan, E. M.: Update on autoantibodies to intracellular antigens in systemic rheumatic diseases. Clin Lab Med 12 (1992), 1-23 2. Guma, M., Keil, L. B.: Autoantibodies to cellular antigens in systemic autoimmune diseases. J Clin Immunoassay 17 (1994), 98-107 3. Fritzler, M. J.: Clinical relevance of autoantibodies in systemic rheumatic diseases. Mol Biol Rep 23 (1996), 133-145 4. Hietarinta, M., Lassila, O.: Clinical significance of antinuclear antibodies in systemic rheumatic disease. Ann Med 28 (1996), 283-291 5. Messinger, M.: Autoantikörper bei systemischen entzündlich-rheumatischen Erkrankungen (Kollagenosen). In: L. Thomas (ed.): Labor und Diagnose (2005), TH-Books-Verlags-Gesellschaft, Frankfurt/Main, 1139-1161 19

6. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), 86-92 15. Sammanfattande flödesschema a. Späd sera i 1/100 i provbuffert (100 ml, klar att användas, organge) och blanda. b. Späd tvättbufferten (10x-koncentrat [100 ml, blå]) med vatten och blanda. c. Tvätta brunnarna en gång med 350 ul tvättbuffert vardera. Dispensera 100 ul av kalibratorerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gradvis blå), kontrollerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gröna och röda) samt de utspädda proverna i den fasta fasens brunnar. Duplicerade mätningar rekommenderas. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). d. Tvätta brunnarna 4 gånger med 350 ul tvättbuffert vardera. e. Dispensera 100 µl av konjugatet (14 ml, klart att använda, rött) i brunnarna. Inkubera som i steg c. f. Upprepa tvättmomentet i steg d. g. Dispensera 100 µl av substratlösningen (14 ml, klar att använda, svart flaska) per brunn. Inkubera som i steg c och tillsätt därefter 100 µl stopplösning (14 ml, klar att använda, färglös) per brunn och agitera plattan kortvarigt. h. Mät omedelbart absorbansen vid 450 nm. i. Utvärdering: Bestäm gränsabsorbansen genom att multiplicera absorbansen i den positiva kontrollen med den faktor som anges i analyscertifikatet. Beräkna därefter provernas kvot genom att dela deras absorbans med gränsabsorbansen. / January 13, 2013 20