B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack

B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack U 3300762JAA(03) 2015-07 Svenska AVSEDD ANVÄNDNING BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack (BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis-komplexets [ctb] reagens för odlingsidentifikation), för användning med BD ProbeTec ET System, utnyttjar Strand Displacement Amplification (SDA, nukleinsyraamplifiering)-teknologi för identifikation av Mycobacterium tuberculosis-komplexet isolerad från odling. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING Användningen av DNA-prober för odlingsidentifikation reducerar tiden för identifikation av vissa mykobakterier som t. ex. M. tuberculosis-komplexet, från 1 2 veckor med traditionella metoder till mindre än 24 h. 1 Mycobacterium tuberculosis-komplexets (ctb) reagens används med BD ProbeTec ET system. Testsystemet utnyttjar homogen SDA-teknologi som amplifieringsmetod och fluorescerande energiöverförings- (ET) metod för att detektera närvaro av Mycobacterium tuberculosis-komplexet från odling. 2-4 Växt kan ske från äggbaserat eller agarbaserat medium, eller flytande tillväxtmedium för mykobakterier. Mycobacterium tuberculosis-komplexet består av M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, och M. microti. 5,6 PRINCIPER FÖR METODEN BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis-komplexets (ctb) analys bygger på simultan amplifiering och detektion av det sökta DNA, med hjälp av primers för amplifiering och en fluorescensmärkt detektorprob. 2-4 SDA-reagenserna torkas i två separata mikrobrunnar för engångsbruk. Det preparerade provet tillsätts till primningsmikrobrunnen, vilken innehåller primers för amplifiering, fluorescensmärkta detektorprober samt övriga reagenser. Efter inkubering överförs reaktionsblandningen till amplifieringsmikrobrunnen, vilken innehåller två enzymer (ett DNA-polymeras och ett restriktionsendonukleas) som krävs för SDA. Amplifieringsmikrobrunnarna förseglas för att förhindra kontaminering och inkuberas i en temperaturreglerad fluorescensavläsare som övervakar reaktionen för generering av amplifieringsprodukter. Varje reaktion coamplifieras och detekterar en intern amplifieringskontroll (IAC). Avsikten med denna kontroll är att bekräfta validiteten i amplifieringsreaktionen och identifiera potentiell inhibition från det preparerade provet. Resultaten rapporteras såsom positiva, negativa eller ej bestämbara via en algoritm. REAGENSER OCH MATERIAL Varje BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis-komplexets (ctb) reagens för odlingsindentifikation innehåller: ctb primningsmikrobrunnar, 24: 4 oligonukleotider 7,6 pmol; dntp 37,6 nmol; detektorprober 30 pmol; syntetisk oligonukleotid 10 500 kopior. ctb amplifieringsmikrobrunnar, 24: Restriktionsenzym 25,5 enheter; DNA-polymeras 8 enheter; dntps 10 nmol. Tillbehör: 10 skydd, 8 avfallspåsar, 16 förseglingar Varje BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Sample Processing Kit (ET Mykobakteriers odlingsidentifikationskit för provberedning, ctb, kan) innehåller: MCI tvättbuffert 1 225 ml lösning innehållande urea, CAPS-buffert, dimetylsulfoxid, glycerol och natriumhydroxid. MCI lyseringsbuffert 2 50 ml lösning av kaliumhydroxid. MCI neutraliseringsbuffert 3 225 ml lösning innehållande bicin, kaliumhydroxid, dimetylsulfoxid, glycerol och 0,03 % Proclin (konserveringsmedel). Varje BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Sample Processing Kit (ET Mykobakteriers odlingsidentifikationsset för kontroll, ctb, kan) innehåller: MCI positiv kontroll - 20 vardera (50 µl torkade) laxtestes DNA 5 µg och 750 kopior M. tuberculosis syntetisk oligonukleotid per reaktion, 5 250 kopior totalt. MCI negativ kontroll - 20 vardera (50 µl torkade) laxtestes DNA 5 µg. Instrument, utrustning och material: BD ProbeTec ET Instrument (BD ProbeTec ET-instrument) och instrumentplatta, BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (BD ProbeTec ET primnings- och förvärmare), BD ProbeTec ET Oven (BD ProbeTec ET-ugn) eller laboratorieugn för allmänt bruk som kan värma provet till 101 ± 1 C under minst 30 minuter och högst 35 min, BD ProbeTec ET Sonic Bath (BD ProbeTec ET-sonikeringsbad) och sonikeringsbadsinsats, BD ProbeTec ET Pipettor (BD ProbeTec ET-pipetteringsinstrument) och eltillförsel, 2 ml Sample Tube Rack (2 ml provrörsställ), Clear Pipetting Rack (genomskinligt pipetteringsställ), 2 ml Sample Tubes and Caps (2 ml provrör och lock), 2 ml lock och BD ProbeTec ET Accessories kit (BD ProbeTec ET tillbehörssats), CultureSwab EZ-pinnar. Material som krävs men ej medföljer: Mikrocentrifug med inneslutande aerosol och standardrotorer kapabla till 12 200 x g (som t.ex. Eppendorfs mikrocentrifug model 5417C), vortexmixer, engångshandskar, pipetter med aerosolresistenta spetsar kapabla att leverera volymerna 10 µl, 100 µl, 500 µl, 600 µl och 1 ml, 1 % (v/v) natriumhypoklorit med Alconox*, sterila behållare kapabla av att hålla alikvoter av de 3 MCI-buffertarna, timer, tuberkulocidal desinficering, absorberande vadd/gasväv, kalibrerad termometer. *Tillsätt 7,5 g Alconox per 1 L 1% (vol/vol) natriumhypoklorit och blanda. Gör i ordning en färsk blandning dagligen. 1

Förvaring och hantering: ctb reagens måste förvaras vid 2 33 C. Oöppnade reagensförpackningar får ej användas efter utgångsdatum. Efter att påsen öppnats är mikrobrunnarna hållbara i 4 veckor, förutsatt att påsen är ordentligt försluten, eller fram till utgångsdatum, beroende på vilket som inträffar först. Får ej frysas. Mycobacteria Culture Identification (MCI, Odlingsidentifikation av mykobakterier) provberedningsreagens kan förvaras vid 2 33 ºC. Reagenserna får ej användas efter utgångsdatum. Får ej frysas. Mycobacteria Culture Identification (MCI, Odlingsidentifikation av mykobakterier) kontroller kan förvaras vid 2 33 ºC. Använd ej kontroller efter utgångsdatumet. Får ej frysas. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSBEAKTANDEN För in vitro-diagnostik. 1. Steg för hantering och preparering av prover genom värmeinaktivering skall ske i ett biologiskt säkerhetsskåp (Biological Safety Cabinet, BSC) klass II. Centrifugering av prov före värmeinaktiveringssteget skall endast utföras med användning av den aerosolinnehållande rotorn. Den aerosolinneslutande rotorn bör endast öppnas i det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). Använd endast standardrotorn vid centrifugering av prov efter värmeinaktivering utanför det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). 2. Även om särskilt avdelade arbetsområden inte behövs eftersom BD ProbeTec ET-systemets design reducerar risken för kontaminering med amplifieringsprodukter i testområdet, krävs dock andra försiktighetsåtgärder för att förhindra kontaminering; i synnerhet kontaminering av odlingar under preparering eller överföring. 3. Byt inte ut och blanda inte mikrobrunnar, kontroller eller prepareringsreagenser från satser med olika partinummer. 4. Iakttag vedertagna laboratorieförfaranden vid bortskaffning av använda pipettspetsar, provrör, primningsskydd samt annat engångsmaterial. 5. Använd endast BD ProbeTec ET pipetteringsinstrument och BD ProbeTec ET pipettspetsar för överföring av preparerade prover till primningsmikrobrunnarna och för överföring av prover från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna. 6. Reagenspåsarna med oanvända primningsmikrobrunnar och amplifieringsmikrobrunnar MÅSTE återförslutas noggrant efter att de öppnats. Kontrollera att desickanten finns med innan reagenspåsarna försluts. 7. Plattan med amplifieringsmikrobrunnar MÅSTE förseglas ordentligt med hjälp av amplifieringsförseglingen innan plattan flyttas från BD ProbeTec ET primnings- och förvärmare till BD ProbeTec ET-instrumentet. Försegling är nödvändig för att förhindra kontamination av instrumentet och arbetsområdet med amplifieringsprodukterna. Förseglingsmaterialet får ej avlägsnas från mikrobrunnarna vid något tillfälle. 8. I händelse av att en testplatta överskrider 6 kolumner (> 48 prov och kontroller), måste en HEL karta av amplifieringsförsegling, inkluderat med tillbehörssatsen, användas för att förhindra kontamination. 9. För att förhindra kontaminering av arbetsmiljön med amplifieringsprodukter, använd de tillhandahållna påsarna för avyttring av de förseglade amplifieringsmikrobrunnarna efter avslutad analysering. 10. BYT HANDSKAR vid specificerade steg under preparering och analys av prover, så att kontaminering av proverna undviks. Om handskarna kommer i kontakt med prover skall de omedelbart bytas så att kontaminering av andra prover undviks. 11. I händelse av att arbetsområdet eller utrustningen kontamineras av prover eller kontroller skall det kontaminerade området omsorgsfullt rengöras med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox och sköljas noga med avjoniserat/destillerat vatten. Låt ytorna torka fullständigt innan du fortsätter med arbetet. 12. Rengör dagligen hela arbetsområdet - arbetsbänkar och instrumentytor - med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Skölj noga med avjoniserat/destillerat vatten. Låt ytorna torka fullständigt innan du fortsätter med testningen. 13. Restvätska i primningsmikrobrunnarna (efter överföring av vätska från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna) utgör en källa till kontaminering av provet. Försegla primningsmikrobrunnarna noga med en plattförseglare innan de bortskaffas. 14. Placera inte fingrar eller händer i sonikeringsbadet när ultraljudet är PÅ. Detta kan orsaka obehag och möjlig hudirritation. Skada på mujkvävnad kan också uppträda på lång sikt. 15. Använd ej en kvicksilvertermometer för att kontrollera sonikeringsbadets temperatur. En digital termometer tillhandahålls för detta syfte. 16. Kontakta Teknisk service om det händer något ovanligt, såsom spill i BD ProbeTec ET-instrumentet eller DNAkontamination som inte kan åtgärdas med hjälp av rengöring. 17. Om du använder en laboratorieugn för allmänt bruk ska du följa användarhandboken för ugnen för lämpliga anvisningar om drift och säkerhetsåtgärder. 18. Tillämpa fastställd laboratoriepraxis för hantering av prov under och/eller efter värmeinaktivering. Varning H302 Skadligt vid förtäring. H315 Irriterar huden. H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H335 Kan orsaka irritation i luftvägarna. P280 Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. P264 Tvätta grundligt efter användning. P312 Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. P403+P233 Förvaras på väl ventilerad plats. Förpackningen ska förvaras väl tillsluten. P501 Innehållet/behållaren ska kasseras i enlighet med lokala/regionala/ nationella/internationella bestämmelser. 2

Fara H302 Skadligt vid förtäring. H314 Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. P280 Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. P264 Tvätta grundligt efter användning. P301+P312 VID FÖRTÄRING: Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren ska kasseras i enlighet med lokala/regionala/nationella/internationella bestämmelser. FÖRFARANDEN FÖR ODLINGSBEREDNING OBS! Det följande förfarandet för odlingsberedning ger tillräckligt med prov för att utföra tre tester för odlingsidentifikation. A. Förberedande av beredning av odlingsprov - utanför BSC 1. Provberedningens buffertar måste vara vid rumstemperatur och välblandade före användning. För att undvika kontamination av buffertlager, alikvotera tillräckliga volymer av buffertar till lämpliga sterila behållare enligt följande: a. MCI tvättbuffert 1 2 ml per säker odlingskoloni som ska analyseras, 1 ml per flytande tillväxtmedia som ska beredas samt 1 2 ml extra för att underlätta pipettering. b. MCI lyseringsbuffert 2 0,1 ml per odling och kontroller som ska beredas samt 0,5 1 ml extra för att underlätta pipettering. c. MCI neutraliseringsbuffert 3 0,6 ml per odling och kontroller som ska beredas samt 0,5 1 ml extra för att underlätta pipettering. d. Undvik kontaminering av buffertar, häll ej tillbaka överbliven buffert i flaskorna. 2. Använd etiketter som tillhandahålls med provrören och märk två 2 ml-provrör för varje säker odlingskoloni som ska beredas och ett 2 ml-rör för varje flytande odling som ska beredas. 3. Avlägsna locken från provrören och dispensera 1,0 ml MCI tvättbuffert 1 till varje rör. Sätt på provrörslocken igen. 4. Flytta provrören till det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). B. Beredning av positiva odlingar för analys med BD ProbeTec ET ctb - inne i BSC OBS! Som en förberedelse för provdekantering, iordningställ en behållare för flytande biologiskt riskavfall. 1. För att reducera olika inokulat av organismer från fasta mediakulturer, säkerställ att tillväxt av prov, vortexblandning av berett rör och spädningsförfarandet är korrekt utförda. För fasta media, utför följande steg: a. Med användande av en steril 1 µl odlingsslynga av plast, överför material från en enda koloni från odlingsplattan/snedagarröret till det första märkta provberedningsröret innehållande 1 ml MCI tvättbuffert 1. b. Virvla slyngan i bufferten under 5 sek. för att avlägsna organismer från slyngan. Kassera slyngan. c. Sätt lock på provberedningsröret och vortexblanda under 5 sek. d. Genom användande av en aerosolresistent spets, överför 10 µl från det första provröret till det andra provröret. Sätt på locken på rören igen och kassera det första provröret. e. Upprepa stegen a-d för varje ren kultur. Analysering utförs med det andra provröret. Gå till steg 3. 2. För varje flytande odling, utför följande steg: a. Blanda innehållet i odlingskärlet under 5 sek. för att säkerställa en homogen blandning av organismer i de flytande odlingsmedierna. Bered en odling i taget. b. Med användande av en aerosolresistent spets, överför 500 µl av det flytande mediet till ett korrekt märkt provrör innehållande 1 ml MCI tvättbuffert 1. c. Sätt på locket ordentligt på röret. d. Upprepa stegen a-c för varje flytande odling som ska analyseras. 3. BYT HANDSKAR. 4. Vortexblanda varje provrör i 5 sek. 5. Sätt varje rör i den aerosolinneslutande rotorn och sätt fast det aerosolinneslutande locket ordentligt. Torka av rotorns utsida men handdukar eller gasväv fuktad med en antimikrobiell lösning. 6. Överför den aerosolinneslutande rotorn till mikrocentrifugen. Centrifugera rören vid 12 200 x g i 3 min. OBS! De specificerade centrifugeringsförhållandena måste följas eftersom otillräcklig centrifugering kan orsaka falskt negativa resultat. 7. Omedelbart efter centrifugering, avlägsna rotorn försiktigt från mikrocentrifugen (utan att ha sönder aerosolens täta försegling) och sätt tillbaka rotorn i det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). 8. Avlägsna det aerosolinneslutande locket och proverna omedelbart från rotorn med iakttagande av försiktighet för att minimera återblandning av supernatanten och sedimentet. 9. Tag av locket från det första röret och dekantera supernatanten i behållaren för flytande avfall i det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). Använd en jämn inverterande rörelse och avsluta med en nedåtgående snärt av det inverterade röret. OBS! Sedimentet kan lossna med tiden. Utför stegen 7, 8 och 9 utan fördröjning. 10. Sätt tillbaka locket ordentligt och placera röret i 2 ml-provrörsstället. 3

11. Upprepa stegen 9 och 10 för alla prover. 12. BYT HANDSKAR. C.1. Provuppvärmning - BD ProbeTec ET-ugn ANMÄRKNINGAR: Se till att provrörslocken är ordentligt fastsatta. Före uppvärmning av proven i ugnen, inspektera provrörslocken för att bekräfta att O-ringarna sitter riktigt. Om O-ringarna är sneda eller saknas, ersätt dem med ett nytt lock. Se BD ProbeTec ET-systemets användarhandbok för fullständiga användarinstruktioner, inklusive relevanta försiktighetsåtgärder och varningar. 1. Sätt 2 ml-provrörsstället i ugnen och stäng dörren. 2. Välj RUN (KÖR) #01. Tryck på OK. 3. Tryck på START för att börja körningen. 4. När körningen startar, utför följande steg: a. Förbered BD ProbeTec ET sonikeringsbad. Detta inkluderar: (1) Placera sonikeringsbadets insats i badet. (2) Fyll på sonikeringsbadet med hett kranvatten till linjen Maximum. (OBS! Avjoniserat vatten bör ej användas). (3) Ställ in temperaturen på 65 C och sätt på uppvärmaren. (4) Kör ultraljudet i 60 min. (förvalsinställning) med sonikeringsbadets skydd på. b. Sätt fast standardrotorn i mikrocentrifugen. 5. Efter 15 min. in i uppvärmningscykeln, kontrollera och registrera ugnens yttre termometer för att säkerställa att temperaturen är 95 C. 6. I slutet av körningen, kommer en signal att höras och LCDn kommer att visa att körningen är DONE (KLAR). Lossa på dörrlåset genom att trycka på OPEN DOOR (ÖPPNA DÖRR)-knappen och avlägsna 2 ml-provrörsstället. OBS! Eventuella mykobakterier som finns i provrören är nu icke-viabla och efterföljande manipulationer kan ske utanför det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). Proverna måste ännu behandlas som potentiellt smittförande. C.2. Provuppvärmning - laboratorieugn för allmänt bruk OBS! Se till att provrörslocken är ordentligt fastsatta. Innan uppvärmning av prover i ugnen ska du visuellt inspektera provrörslocken för att bekräfta att O-ringarna sitter riktigt. Om O-ringen är sned eller saknas, ersätt den med ett nytt lock. Se användarhandboken för ugnen för fullständiga användarinstruktioner, inklusive relevanta försiktighetsåtgärder och varningar. 1. Sätt 2 ml-provrörsstället i ugnen och stäng luckan. 2. Provtemperaturen måste uppnå 101 ± 1 C under minst 30 min och högst 35 min. Följ lämpliga tids- och temperaturanvisningar för inkubation. 3. Utför följande steg medan proverna värms upp i ugnen: a. Förbered BD ProbeTec ET-ultraljudsbad. Detta inkluderar: (1) Placera ultraljudsbadets insats i badet. (2) Fyll på ultraljudsbadet med hett kranvatten till linjen Maximum. (OBS! Avjoniserat vatten ska inte användas.) (3) Ställ in temperaturen på 65 C och sätt på uppvärmaren. (4) Kör ultraljudet i 60 min (förvalsinställning) med ultraljudsbadets skydd på. b. Sätt fast standardrotorn i mikrocentrifugen. 4. Ta bort 2 ml-provrörsstället i slutet av ugnens uppvärmningscykel. VARNING! Hantera inte heta provrörsställ utan lämplig personlig skyddsutrustning. Om du gör det kan du få brännskador. OBS! Eventuella mykobakterier som finns i provrören är nu icke-viabla och efterföljande manipulationer kan ske utanför det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). Proverna måste ännu behandlas som potentiellt smittförande. D. Provlysering - BD ProbeTec ET-sonikeringsbad VARNING! Placera inte fingrar eller händer i sonikeringsbadet när ultraljudet är PÅ. Detta kan orsaka obehag och möjlig hudirritation. Skada på mujkvävnad kan också uppträda på lång sikt. VARNING! Använd ej en kvicksilvertermometer för att kontrollera sonikeringsbadets temperatur. En digital termometer tillhandahålls för detta syfte. OBS! Se BD ProbeTec ET-systemets användarhandbok för fullständiga användarinstruktioner, inklusive relevanta försiktighetsåtgärder och varningar. 1. Sätt provrören i mikrocentrifugen med standardrotorn. 2. Stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. 3. Avlägsna rören från centrifugen och undersök om det finns kondensation i rörlocken. Om kondensation finns, upprepa centrifugeringen. 4. Sätt tillbaka rören i 2 ml-provstället. 5. Tag av locket på det första röret. Med användning av ett pipetteringsinstrument med en aerosolresistent pipettspets, dispensera 100 µl MCI lyseringsbuffert 2 till röret. Byt ut och sätt på locket ordentligt på provröret. 4

6. Upprepa proceduren för alla proverna med användning av en ny spets för varje prov. 7. BYT HANDSKAR. 8. Vortexblanda varje prov i 5 sek. När rören sätts tillbaka i 2 ml-provrörsstället, kontrollera att dessa är ordentligt lockförsedda och tryck fast röret så att dess kant sitter i den utstansade skåran på stället. Detta orienterar rören riktigt för maximal exponering för ultraljudsenergin. 9. Stäng AV ultraljudet och bekräfta att vattennivån ligger mellan linjerna Minimum och Maximum på sonikeringsbadets insats. Avlägsna eller sätt till varmt kranvatten vid behov. Kontrollera sonikeringsbadets temperatur med den digitala termometern för att säkerställa att temperaturen är 65 ± 5 C. Avlägsna termometern från badet. 10. Överför 2 ml-provrörsstället till sonikeringsbadets insats. Byt ut sonikeringsbadets skydd. 11. Ställ sonikeringsbadets timer på 45 min., sätt PÅ ultraljudet. 12. I slutet av sonikeringen, stäng AV sonikeringsbadet och tag bort 2 ml-provrörsstället. Placera stället på absorberande pappershanddukar för att torka. E. Neutralisering av prov 1. Sätt provrören i mikrocentrifugen med standardrotorn. 2. Stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. 3. Avlägsna rören från centrifugen och undersök om det finns kondensation i rörlocken. Om kondensation finns, upprepa centrifugeringen. 4. Sätt rören i det genomskinliga pipetteringsstället. 5. Tag av locket på det första röret. Med användning av ett pipetteringsinstrument med en aerosolresistent pipettspets, dispensera 600 µl MCI neutraliseringsbuffert 3 till röret. Byt ut och sätt på locket ordentligt på provröret. 6. Upprepa proceduren för alla prover med användning av en ny spets för varje rör. 7. BYT HANDSKAR. 8. Vortexblanda varje rör i 5 sek. 9. Pulscentrifugera rören genom att följa stegen 1 3 ovan. 10. Sätt tillbaka rören i det genomskinliga pipetteringsstället. 11. De preparerade proverna är nu klara för analysering på BD ProbeTec ET-systemet. OBS! Om analysering inte sker på en gång, kan de preparerade proverna förvaras enligt följande: a. Vid 18 33 C i upp till 12 h. b. Vid 2 8 C i upp till 5 dagar. Proverna måste vortexblandas i 5 sek. och återuppvärmas i BD ProbeTec ETugnen eller laboratorieugnen för allmänt bruk som kan värma provet till 101 ± 1 C under minst 30 min och högst 35 min, innan analysering. c. Frysta vid -20 C eller kallare (ej-cykliskt) i upp till 3 månader. Frysta prover måste tinas vid rumstemperatur, vortexblandas i 5 sek. och återuppvärmas i BD ProbeTec ET-ugnen eller laboratorieugnen för allmänt bruk som kan värma provet till 101 ± 1 C under minst 30 min och högst 35 min, innan analysering. d. Efter att rören har återuppvärmts (i stegen b och c ovan) sätt rören i mikrocentrifugen med standardrotorn. Stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. Avlägsna rören från centrifugen och undersök om det finns kondensation i rörlocken. Om kondensation finns, upprepa centrifugeringen. Sätt rören i det genomskinliga pipetteringsstället. Proverna är nu klara för analysering på BD ProbeTec ET-systemet. TESTFÖRFARANDE A. Förberedelse av instrumentet 1. Sätt på instrumentet och tillåt uppvärmning före start av analysen. a. Uppvärmning och stabilisering av primnings- och förvärmaren tar cirka 90 min. Inställd temperatur för primningsdelen i primnings- och förvärmaren är 72,5 ºC. Inställd temperatur för förvärmningsdelen i primnings- och förvärmaren är 54 ºC. b. BD ProbeTec ET-instrumentet styrs av programvaran och tar cirka 30 min. att värma upp. 2. Temperaturer för primnings- och förvärmaren måste kontrolleras innan analysen påbörjas. Termometern för värmarens primningsdel skall visa ett värde mellan 72 73 C. Termometern för värmarens förvärmardel skall visa ett värde mellan 53,5 54,5 C. 3. Kontrollera temperaturen som visas på BD ProbeTec ET-skärmen. Termometern skall visa ett värde mellan 47,5 55,0 C. B. BD ProbeTec ET pipetteringsinstrument. Se BD ProbeTec ET-systemets användarhandbok för utförliga informationer om funktionerna hos knappsatsen till BD ProbeTec ET pipetteringsinstrument. Följande program krävs för att utföra Mycobacterium tuberculosis-komplexets (ctb)-analys. Program 1 ombesörjer överföring av vätska från de preparerade proverna till ctb-primningsmikrobrunnarna. Program 5 ombesörjer överföring av vätska från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna. 5

Utför nedanstående steg för att programmera pipetteringsinstrumentet: Program 1: 1. Slå PÅ pipetteringsinstrumentet. Pipetteringsinstrumentet avger ett pip, ZERO och därefter programversion visas snabbt, varefter ytterligare ett pip avges. 2. Tryck på den blå Prog (program)-knappen. Tryck på knappen Vol (volym) tills 1 visas, för att välja Program 1. Tryck på Enter (för in). 3. Håll knappen Prog intryckt tills programmeringsfunktionen öppnas. Fortsätt att hålla knappen Prog intryckt och tryck samtidigt på knappen för specialfunktioner med hjälp av en pipettspets eller änden på ett gem. 4. Tryck på knappen Fill (fyll). Tryck på upp-pilen tills 200 visas. Tryck på Enter. 5. Tryck på knappen Disp (dispensera). Tryck på upp-pilen tills 150 visas. Tryck på Enter. 6. Tryck på Enter en gång till för att spara programmet och lämna denna funktion. Ett pip bör nu höras som bekräftelse på att programmeringen är klar. 7. Kontrollera din programmering genom att trycka på utlösaren så att du stegar framåt ett steg i taget. Ställ in aspirerings-/dispenseringshastigheten med hjälp av knappen Vol efterhand som du stegar dig fram. För varje steg visas hastighetsindikatorn (Speed). Använd Vol -knappen för att ställa in hastighetsindikatorn så att den visar 2 fyrkanter för stegen Fill och Disp och 3 fyrkanter för Purge. Program 5: 1. Tryck på Prog -knappen. Tryck på knappen Vol (volym) tills 5 visas, för att välja Program 5. Tryck på Enter. 2. Håll knappen Prog intryckt tills programmeringsfunktionen öppnas. Fortsätt att hålla knappen Prog intryckt och tryck samtidigt på knappen för specialfunktioner med hjälp av en pipettspets eller änden på ett gem. 3. Tryck på knappen Fill (fyll). Tryck på upp-pilen tills 100 visas. Tryck på Enter. 4. Tryck på Disp. Tryck på upp-pilen tills 100 visas. Tryck på Enter. 5. Tryck på Mix (Blanda). Tryck på upp-pilen tills 50 visas. Tryck på Enter. 6. Tryck på Enter en gång till för att spara programmet och lämna denna funktion. Ett pip bör nu höras som bekräftelse på att programmeringen är klar. 7. Kontrollera din programmering genom att trycka på utlösaren så att du stegar framåt ett steg i taget. Ställ in aspirerings-/dispenserings-/blandningshastigheten med hjälp av knappen Vol efterhand som du stegar dig fram. För varje steg visas hastighetsindikatorn (Speed). Använd Vol -knappen för att ställa in hastighetsindikatorn så att den visar 2 fyrkanter för funktionerna aspirering och dispensering. Använd Vol - knappen för att ställa in hastigheten för blandningen så att den visar 3 fyrkanter. Granskning av program Programmen bör granskas innan testförfarandet påbörjas. För att granska programmen skall pipetteringsinstrumentet först slås PÅ. Tryck på den blå Prog (program)-knappen. Tryck på knappen Vol (volym) tills rätt programnummer visas. Tryck på Enter -knappen. Använd pipetteringsutlösaren för att stega dig fram ett steg i taget genom programmet. Program 1: Detta program aspirerar 200 µl och dispenserar 150 µl. Pipetteringsinstrumentets display bör visa följande: Fill (Fyll) på 200 µl SII Dispense (Dispensera) 150 µl SII Program 5 granskas på samma sätt: Program 5: I detta program aspireras 100 µl, 100 µl dispenseras och 50 µl blandas tre gånger. Pipetteringsinstrumentets display bör visa följande: Fill (Fyll) på 100 µl SII Dispense (Dispensera) 100 µl SII Mix (Blanda) 50 µl SII I Zero (blinkar) C. Plattans layout Plattlayoutrapporten genereras av BD ProbeTec ET-instrumentet efter att analystyp(er), provdata, kontrollpartinummer och satspartinummer loggats in i systemet. Plattlayoutrapporten visar hur proverna och kontrollerna är placerade på varje platta som skall testas. Denna orientering används för både plattan med primningsmikrobrunnar och plattan med amplifieringsmikrobrunnar. Primningsmikrobrunnarna för ctb-analysen utgörs av enfärgade vita mikrostrips. Amplifieringsmikrobrunnarna utgörs av vitrandiga mikrostrips. D. Beredning av analyskontroller OBS! BD ProbeTec ET MCI kontroller, MCI lyseringsbuffert 2 och MCI neutraliseringsbuffert 3 bör vara vid rumstemperatur före användning. Använd buffertarna som tidigare alikvoterades för provberedning. Blanda ordentligt före användning. 1. Bered ett rör med negativ MCI-kontroll och ett rör med positiv MCI-kontroll för varje omgång (platta) som skall testas. Om en platta innehåller mer än ett ctb-reagenspartinummer måste kontroller testas tillsammans med varje enskilt parti. 2. Ta av locket från röret med negativ kontroll. a. Med användning av en ny pipett, dispensera 100 µl MCI-lyseringsbuffert 2. b. Med användning av en ny pipett, dispensera 600 µl MCI-neutraliseringsbuffert 3. 6

3. Sätt tillbaka locket ordentligt på röret och vortexblanda i 5 sek. 4. Ta av locket från röret med den positiva kontrollen. a. Med användning av en ny pipett, dispensera 100 µl MCI-lyseringsbuffert 2. b. Med användning av en ny pipett, dispensera 600 µl MCI-neutraliseringsbuffert 3. 5. Sätt tillbaka locket ordentligt på röret och vortexblanda i 5 sek. 6. Sätt kontrollrören i mikrocentrifugen med standardrotorn. Stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. Avlägsna rören från centrifugen och sätt dem i det genomskinliga pipetteringsstället. E. Testförfarande 1. Avlägsna och kassera locken från provrören och kontrollerna för första körningen. 2. BYT HANDSKAR. 3. Förbered primningsmikrobrunnsplattan med hjälp av plattlayoutrapporten som en guide. 4. Försegla åter primningsmikrobrunnpåsen på följande sätt: a. Lägg påsen på en plan yta. Håll den öppna änden platt med ena handen. b. Tryck och för samtidigt fingrarna längs förseglingens utsida från ena änden av påsen till den andra. c. Kontrollera att påsen är förseglad. 5. Välj Program 1 på BD ProbeTec ET-pipetteringsinstrumentet. 6. Plocka upp pipettspetsarna. Expandera pipetteringsinstrumentet genom att dra ut distanseringsratten hela vägen. OBS! När proverna aspireras, undvik försiktigt pelleterat debris, vilket kan täppa till pipettspetsarna och påverka testresultaten. OBS! Kontrollera att spetsarna sitter väl fast på pipetteringsinstrumentet så att läckage förhindras. 7. Aspirera 200 µl från den första kolumnen med prover. 8. Fäll varligt ihop pipetteringsinstrumentet, snudda med pipettspetsarna mot brunnarnas sidor och dispensera 150 µl i den första kolumnen med primningsmikrobrunnar (1 A-H). OBS! För att säkerställa att noggrannheten och precisionen upprätthålls och för att undvika kontaminering är det viktigt att vätskan dispenseras mot mikrobrunnarnas innerväggar. 9. Kasta spetsarna. Tryck in pipetteringsutlösaren för att återställa pipetteringsinstrumentet. 10. Plocka upp nya spetsar, expandera pipetteringsinstrumentet och aspirera 200 µl från den andra kolumnen med prover. 11. Fäll varligt ihop pipetteringsinstrumentet, snudda med pipettspetsarna mot brunnarnas sidor och dispensera 150 µl i den andra kolumnen med primningsmikrobrunnar (2 A-H). OBS! Pipetteringsinstrumentet får inte fällas ihop över proverna eller mikrobrunnarna, eftersom detta kan orsaka kontaminering. Plötsliga rörelser kan ge upphov till bildning av droppar eller aerosoler. 12. Kasta spetsarna. OBS! Kasta spetsarna försiktigt så att droppar och aerosoler som kan kontaminera arbetsområdet undviks. 13. Fortsätt att överföra de återstående proverna i analysomgången. 14. Täck över primningsmikrobrunnarna med primningsskyddet och inkubera plattorna vid rumstemperatur i minst 20 min. (Kan inkuberas i upp till 6 h) OBS! Förslut de preparerade proverna med nya lock. BYT HANDSKAR. 15. När primningsinkuberingen är avslutad skall plattan med amplifieringsmikrobrunnar göras i ordning. Konfigurera amplifieringsmikrobrunnarna på en platta enligt plattlayoutrapporten (på samma sätt som primningsplattan). Försegla åter amplifieringsmikrobrunnpåsen enligt anvisningarna i steg #4. 16. Ta av skyddet från plattan med primningsmikrobrunnar och sätt in plattan i primningsvärmaren. Sätt OMEDELBART in plattan med amplifieringsmikrobrunnar i förvärmaren. 17. Ställ in timern på 10 min. (OBS! Korrekt tid för detta steg är ytterst viktigt.) 18. Välj program 5 på pipetteringsinstrumentet efter den 10 min. långa (+/- 1 min.) inkuberingen. 19. Plocka omedelbart upp pipettspetsar och överför 100 µl från kolumn 1 på plattan med primningsmikrobrunnar till kolumn 1 på plattan med amplifieringsmikrobrunnar. Snudda med pipettspetsarna vid brunnarnas sidor och dispensera vätskan. Låt pipetteringsinstrumentet automatiskt blanda vätskan i brunnarna efter utförd dispensering. 20. Kasta spetsarna. Plocka upp nya spetsar och fortsätt att överföra reaktionsblandningen från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna, kolumn för kolumn, med nya pipettspetsar för varje kolumn. 21. När den sista kolumnen har överförts, avlägsna fodret från en amplifieringsförsegling. (En ½ plattförsegling kommer att täcka upp till 6 kolumner. Om plattan har mer än 6 kolumner MÅSTE en hel amplifieringsförsegling användas.) Håll i förseglingens kanter och placera den över mikrobrunnarna. Använd styranordningarna på förvärmaren som vägledning vid påsättning av förseglingen. Tryck ned förseglingen så att samtliga mikrobrunnar är fullständigt förseglade. 22. Vid BD ProbeTec ET-användargränssnittet, ta ut hållaren, öppna dörren och lyft upp plattskyddet. Överför OMEDELBART (inom 30 sek.) den förseglade plattan med amplifieringsmikrobrunnar till BD ProbeTec ETinstrumentet och starta analysomgången. (För detaljerade anvisningar hänvisas till användarhandboken för BD ProbeTec ET-systemet.) 7

23. Slutför följande del av rengöringsproceduren efter att analysomgången satts igång: a. Försegla plattan med primningsmikrobrunnarna med en amplifieringsförsegling och avlägsna plattan från primnings- och förvärmaren. (Använd den värmeresistenta handsken för att avlägsna plattan - temperaturen överskrider 70 C.) b. Låt plattan svalna av på bänken under 5 min. Kassera primningsmikrobrunnarna i en behållare för biologiskt riskavfall. c. Rengör metallplattan: Skölj plattan med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Skölj plattan med destillerat eller avjoniserat vatten. Linda in plattan i en ren handduk och låt den torka fullständigt innan den återanvänds. 24. När analysomgången är avslutad genereras en utskrift av analysresultaten. 25. Flytta ut platthållaren ur stativet, öppna dörren och avlägsna plattan. Stäng dörren och för plattstativet tillbaka in i instrumentet. 26. Ta upp de förseglade amplifieringsmikrobrunnarna från plattan. VIKTIGT! Förseglingsmaterialet får ej avlägsnas från mikrobrunnarna. De förseglade mikrobrunnarna kan enkelt avlägsnas från plattan som en enhet genom att man håller i förseglingens över- och nederdel och lyfter brunnarna rakt upp och ut ur plattan. Lägg in de förseglade mikrobrunnarna i avfallspåsen. Försegla påsen. 27. Rengör metallplattan: Skölj plattan med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Skölj plattan med destillerat eller avjoniserat vatten. Linda in plattan i en ren handduk och låt den torka fullständigt innan den återanvänds. 28. Utför följande rengöringsprocedurer efter att den sista analysomgången för dagen är avslutad: a. Rengör arbetsbänkarna med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Låt lösningen ligga kvar på arbetsytorna under 2 3 min., torka sedan med destillerat eller avjoniserat vatten. b. Rengör provrörsstället och det genomskinliga pipetteringsstället genom att sänka ned det i 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox i max. 60 sek. Skölj noggrant med destillerat eller avjoniserat vatten och låt lufttorka. c. Rengör de yttre ytorna på primnings- och förvärmaren samt BD ProbeTec ET-instrumentet med 1 % (vol/ vol) natirumhypoklorit med Alconox. Torka ytorna med destillerat eller avjoniserat vatten. d. Rengör pipetteringsinstrumentets handtag (ENDAST HANDTAGET) med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit. Torka handtaget med destillerat eller avjoniserat vatten och torka torrt med en ren handduk. e. Återuppladda pipetteringsinstrumentet. f. Bortskaffa de förseglade avfallspåsarna och påsen med biologiskt riskavfall enligt fastställda rutiner för bortskaffande av kontaminerat biologiskt avfall. KVALITETSKONTROLL BD ProbeTec ET MCI-kontrollset tillhandahålls separat. En positiv och en negativ kontroll måste inkluderas i varje analysomgång samt för varje nytt reagenspartinummer. Kontrollerna kan utplaceras slumpartat. Den MCI-positiva kontrollen används för att övervaka reagensmisslyckande, slutförande av viktiga procedurmoment (pipettering och inkuberingar), amplifiering och detektion. Den MCI-negativa kontrollen används för att övervaka kontaminering av reagens och/eller omgivning. För att provresultaten skall kunna rapporteras måste analysresultatet för de MCIpositiva och MCI-negativa kontrollerna utfalla positivt respektive negativt. Om resultaten för kontrollerna inte utfaller som förväntat betraktas analysomgången som ogiltig och patientresultaten rapporteras inte av instrumentet. Om kvalitetskontrollen inte utfaller med förväntat resultat skall hela analysomgången upprepas med ett nytt set kontroller, nya mikrobrunnar och de preparerade proverna. Om upprepad kvalitetskontroll inte ger förväntade resultat skall Teknisk service kontaktas (se Tolkning av resultat ). Se avsnitt D i TESTFÖRFARANDE för anvisningar om beredning av kontrollerna. Fortsätt med testproceduren enligt anvisningarna i avsnitt E i TESTFÖRFARANDE efter att kontrollerna beretts. En intern amplifieringskontroll (IAC) finns i varje mikrobrunn. IAC innehåller nukleinsyra som amplifieras i närvaro av provmatrix. IAC är utformad för att bekräfta validiteten i amplifieringsreaktionen och identifiera potentiell inhibition från det preparerade provet. Provbearbetningskontroll: För att testa effektiviteten av provberedning, bör en procedurkontroll testas rutinmässigt i enlighet med lokala bestämmelser. Procedurkontrollen består av en lösning med M. tuberculosis-stam H37Ra (t. ex. ATCC 25177). Lösningen bör prepareras enligt följande: 1. Förbered en McFarland nr. 1-suspension av organismen. 2. Späd McFarland-lösningen till 1:100 med Middlebrook 7H9-buljong med glycerol, (t.ex. pipettera 0,1 ml McFarland-lösning till 9,9 ml Middlebrook 7H9-buljiong med glycerol och blanda noggrant). 3. 1,0 ml alikvoter kan frysas vid -20 C eller kallare (ej-cykliskt). 4. Cellsuspensionen bör prepareras som ett rutinprov för analys i BD ProbeTec ET-systemet. Övervakning av förekomst av DNA-kontamination: Innan den första körningen av BD ProbeTec ET-analyserna och åtminstone månatligen därefter, bör det följande testförfarandet utföras för att övervaka arbetsområdet och utrustningens ytor avseende förekomst av DNAkontamination. Övervakning av miljön är av avgörande betydelse för att detektera kontaminering innan sådan hinner utvecklas till ett problem. 8

1. Använd en CultureSwab EZ provtagningspinne för varje område* som skall testas. 2. Märk ett provrör för varje område som ska testas och pipettera 100 µl MCI lyseringsbuffert 2 och 600 µl MCI neutraliseringsbuffert 3 till varje rör. 3. Doppa den första provtagningspinnen i provrörets buffertblandning, och torka av det första området med en bred, svepande rörelse. 4. Stoppa ned provtagningspinnen i buffertblandningen, exprimera provtagningspinnen, sätt på locket på röret och vortexblanda i 5 sek. Kassera provtagningspinnarna. 5. Upprepa ovanstående steg för varje område som skall provtas. 6. Sätt rören i provrörsstället och värm i ugnen (avsnitt C i FÖRFARANDE FÖR ODLINGSBEREDNING ). 7. Använd rena handdukar indränkta med vatten för att avlägsna rester av buffertblandning från provtagningsområdena medan rören värms. 8. Efter uppvärmning, sätt rören i mikrocentrifugen med standardrotorn, stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. 9. Avlägsna rören från centrifugen och undersök om det finns kondensation i locken. Om kondensation finns, upprepa centrifugeringen. 10. Sätt rören i det genomskinliga pipetteringsstället och fortsätt med TESTFÖRFARANDET. *Rekommenderade testområden inkluderar: ugnens yta, sonikeringsbad, provrörsställ, genomskinligt pipetteringsställ, primnings- och förvärmare, svarta mikrobrunnsplattor, pipetteringsinstrumentets handtag, touchtangentinstrument, tangentinstrument och hela arbetsbänken. Vid positivt resultat för ett område skall området rengöras med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Se till att hela området fuktas med blekmedelslösningen och låt den verka på ytan i minst 2 min. eller tills den torkat. Torka vid behov bort överflödig blekmedelslösning med en ren handduk. Torka av området med en ren handduk indränkt med avjoniserat eller destillerat vatten och låt ytan torka. Testa området på nytt. Upprepa förfarandet tills ett negativt resultat erhålls. Kontakta Teknisk service för ytterligare information om det inte går att få bukt med kontaminationen. TOLKNING AV ANALYSRESULTAT ctb aalysresultat Positivt Negativt Ej bestämbart Rekommenderat resultat Probe-analys för odlingsidentifikation positiv för M. tuberculosis-komplexets DNA. Probe-analys för odlingsidentifikation negativ för M. tuberculosis-komplexets DNA. Upprepa probe-analys för odlingsidentifikation från preparerade prover, om det finns tillräckligt med material. Om upprepat resultat är positivt eller negativt, använd lämpligt uttlåtande ovan. Om fortfarande Ej bestämbart, upprepa analysering från positiva odlingar. METODENS BEGRÄNSNINGAR 1. Denna metod har endast testats med isolat som växt på äggbaserat, agarbaserat medium eller flytande tillväxtmedium för mykobakterier. Prestandan vid användning med andra tillväxtmedia har ej utvärderats. Effektiviteten av denna analys har inte visats med direkt testning av prov. 2. BD ProbeTec ET ctb-analysen har e j utvärderats för analysering av AFB-tillväxt i primära blodeller benmärgsodlingar. 3. BD ProbeTec ET ctb-analysen kan ej användas för att differentiera mellan medlemmar av M. tuberculosiskomplexet - M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum och M. microti. Alla species/subspecies av M. Tuberculosis-komplexet har rapporterats ha en IS6110-region. En del varianter saknar insertionssekvensen IS6110 8 och kommer ej att utfalla positiv med BD ProbeTec ET ctb-analysen. 4. Underlåtenhet att följa de beskrivna riktlinjerna för proceduren kan påverka testresultat (t. ex. inkomplett centrifugering, pipettering av pelleterat debris). 5. Flytande odlingar testade med BD ProbeTec ET ctb-analysen kan genomgå subkultur för att isloera blandad mykobakteriell växt och för att bekräfta identifikation av species inom M. tuberculosis-komplexet. 6. Användning av BD ProbeTec ET ctb-analysens odlingsidentifikation skall begränsas till personal med utbildning i analysförfarandet och BD ProbeTec ET-systemet. 7. BD ProbeTec ET ctb-analysens odlingsidentifikation är ej avsedd att ersätta odling i antimikrobiellt resistensbestämningssyfte. 8. BD ProbeTec ET ctb-analysens odlingsidentifikation ger kvalitativa resultat. MOTA-poängens storlek och antalet celler i ett positivt prov är inte korrelerade med varandra. 9. M. tuberculosis-komplexets probe-sekvens, IS6110, är specifik får M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum och M. microti. 10. Om du använder en laboratorieugn för allmänt bruk ska du se till att vätskan i provrören uppnår en temperatur på 101 ± 1 C under minst 30 min för att göra eventuella mykobakterier i proverna icke-viabla. FÖRVÄNTADE RESULTAT Totalt insamlades 366 prover vid fyra geografiskt skilda kliniska studieplatser för att utvärdera BD ProbeTec ET ctbanalysen. Totalt erhölls 722 resultat med BD ProbeTec ET ctb-analysen. Frekvensdistributioner av de initiala MOTApoängerna visas i figur 1 (jämförda med den icke-amplifierade probe-referensmetoden) och figur 2 (jämförda med det slutliga ID-resultatet). 9

Närvaro eller frånvaro av Mycobacterium tuberculosis -komplex fastställs genom att jämföra BD ProbeTec ET ctb MOTA-poäng för proven ifråga med de tidigare fastlagda gränsvärdena. MOTA-poängen är ett mått som används för att bedöma storleken på den signal som genereras som resultat av reaktionen. Storleken på MOTA-poängen är inte ett mått på hur stor mängd av organismen som finns närvarande i provet. Alla beräkningar utförs automatiskt av programvaran i instrumentet. Proven som analyserades vid de fyra platserna identifierades med BD ProbeTec ET som positiv, negativ eller ej bestämbar. Analysen för alla ej bestämbara resultat upprepades. Endast ett prov genererade ett obestämbart resultat vid den initiala testningen. Detta prov analyserades som negativt när det upprepades. Jämförda med de slutliga ID-värdena, var medelvärdet för MOTA-poängens positiva resultat 49 804 med en spridning från 242 till 76 610 och med en median på 49 920. Medelvärdet för MOTA-poängens negativa resultat var 2 057 med en spridning från 0 till 71 919 och med en median på 47. MOTA-poängens gränsvärde är 7000. Figur 1: Frekvensdistribution av ctb MOTA-poäng jämförda med icke-amplifierad probe 600 500 473 (-) (+) Frekvens 400 300 200 100 0 < 7 000 Icke-amplifierad probe TB (-) 54 33 1 2 4 7 10 3 Icke-amplifierad probe TB (+) 7 000-19 999 20 000-39 999 MOTA 135 40 000-59 999 60 000-79 999 Frekvensdistribution av ctb MOTA-poäng jämförda med icke-amplifierad probe Referensresultat (Icke-amplifierad probe) < 7 000 7 000 19 999 20 000 39 999 40 000 59 999 60 000 79 999 Mtbc (+) 1 4 33 135 54 Mtbc (-) 473 2 7 10 3 Figur 2: Frekvensdistribution av ctb MOTA-poäng jämförda med slutlig ID 600 (-) (+) 500 473 Frekvens 400 300 200 100 0 < 7 000 Slutlig ID TB (-) 54 33 1 2 4 7 10 3 Slutlig ID TB (+) 7 000-19 999 20 000-39 999 MOTA 135 40 000-59 999 60 000-79 999 10

KLINISKA PRESTANDA Klinisk utvärdering: BD ProbeTec ET ctb-analysen utvärderades vid fyra geografiskt skilda kliniska ställen. Totalt erhölls 722 resultat från 366 prover med BD ProbeTec ET ctb-analysen. Dessa resultat jämfördes med en icke-amplifierad probe-analys och visas i tabell 1, och med en slutlig ID som visas i tabell 2. Icke överensstämmande prover identifierades med en annan metod (referens-id-metoden); antingen biokemiskt, med GLC eller HPLC. Tabell 1: ctb-resultat jämförda med icke-amplifierade probe-resultat ctb-resultat Icke-amplifierad probe (+) Icke-amplifierad probe (-) (+) 226 22 (-) 1 473 Den förväntade sensitiviteten och specificiteten var 99,6% (226/227) respektive 95,6% (473/495) när resultaten jämfördes med de icke-amplifierade probe-resultaten. Den totala procentuella överensstämmelsen var 96,8% (699/722). Tabell 2: ctb-resultat jämförda med slutliga ID-resultat ctb-resultat Slutlig ID (+) Slutlig ID (-) (+) 226 22 (-) 1 473 Den förväntade sensitiviteten och specificiteten var 99,6 % (226/227) respektive 95,6 % (473/495) när resultaten jämfördes med slutlig ID. Den totala procentuella överensstämmelsen var 96,8 % (699/722). Av de 23 icke överensstämmande isolaten, var ett negativt med BD ProbeTec ET ctb-analysen och identifierades med referens-id-metoden som M. tuberculosis-komplex. Inga av de 22 återstående isolaten som var positiva med BD ProbeTec ET ctb-analysen identifierades med referens-id-metoden som M. tuberculosis-komplex. TILLGÄNGLIGHET Kat. nr. Beskrivning 440621 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack, 24 analyser. 440636 BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Specimen Processing Kit. 440635 BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Control Set. 440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (20 primningsskydd, amplifieringsförseglingar och avfallspåsar). 440458 Pipette Tips, 6 x 120. 440661 BD ProbeTec ET Sample Tubes and Caps, 2 ml 200/förpackning 440679 BD ProbeTec ET Sample Tube Caps, 2 ml, 200/förpackning 440681 BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tube Rack 440698 Clear Pipetting Rack. 440478 BD ProbeTec ET Instrument. 440480 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, (120V). 440487 BD ProbeTec ET Pipettor. 441752 Oven Large Convection 230 V. 440689 BD ProbeTec ET Sonic Bath. 11

REFERENSER: 1. Kent, P.T., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. USDHHS, Centers for Disease Control, Atlanta. 2. Walker, G. T., Frasier, M. S., Schram, J. L., Little, M. C., Nadeau, J. G., Malinowski, D. P. 1992. Strand displacement amplification an isothermal, in vitro DNA amplification technique. Nucleic Acids Res. 20(7):1691 1696. 3. Little, M. C., Andrews, J., Moore, R., Bustos, S., Jones, L., Embres, C., Durmowicz, G., Harris, J., Berger, D., Yanson, K., Rostkowski, C., Yursis, D., Price, J., Fort, T., Walters, A., Collis, M., Llorin, O., Wood, J., Failing, F., O Keefe, C., Scrivens, B., Pope, B., Hansen, T., Marino, K., Williams, K., Boenisch, M. 1999. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system, BD ProbeTec ET. Clin. Chem. 45(6): 777 784. 4. Spargo, C. A., Frasier M. S., Van Cleve, M., Wright, D. J., Nycz, C. M., Spears, P. A., Walker, G.T. 1996. Detection of M. tuberculosis DNA using thermophilic strand displacement amplification. Mol. Cell. Probes 10:247 256. 5. Bloodborne Pathogens. Code of Federal Regulations, Title 29, Part 1910.1030, Federal Register 1991, 56:64175-64182. 6. U.S. Dept. of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. 2007. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 5th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2005. Approved Guideline M29-A3. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 3rd ed. CLSI, Wayne, Pa. 8. Yuen, L.K., Ross, B.C., Jackson, K.M. and Dwyer, B. 1993. Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains from Vietnamese patients by southern blot hybridization. J. Clin. Micro. 31:1615-1618. BD Diagnostics teknisk service: utanför USA, kontakta närmaste BD-representant eller besök www.bd.com/ds. 12

Manufacturer / Производител / Výrobce / Fabrikant / Hersteller / Κατασκευαστής / Fabricante / Tootja / Fabricant / Proizvođać / Gyártó / Fabbricante / Атқарушы / 제조업체 / Gamintojas / Ražotājs / Tilvirker / Producent / Producător / Производитель / Výrobca / Proizvođač / Tillverkare / Üretici / Виробник / 生产厂商 Use by / Използвайте до / Spotřebujte do / Brug før / Verwendbar bis / Χρήση έως / Usar antes de / Kasutada enne / Date de péremption / 사용기한 / Upotrijebiti do / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Дейін пайдалануға / Naudokite iki / Izlietot līdz / Houdbaar tot / Brukes for / Stosować do / Prazo de validade / A se utiliza până la / Использовать до / Použite do / Upotrebiti do / Använd före / Son kullanma tarihi / Використати до\line / 使用截止日期 YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec měsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) ΕΕΕΕ-MM-HH / ΕΕΕΕ-MM (MM = τέλος του μήνα) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fin del mes) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj mjeseca) ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) ЖЖЖЖ-АА-КК / ЖЖЖЖ-АА / (АА = айдың соңы) YYYY-MM-DD/YYYY-MM(MM = 월말 ) MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mėnesio pabaiga) GGGG-MM-DD/GGGG-MM (MM = mēneša beigas) JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesiąca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârşitul lunii) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = конец месяца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj meseca) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet av månaden) YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) РРРР-MM-ДД / РРРР-MM (MM = кінець місяця) YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = 月末 ) Catalog number / Каталожен номер / Katalogové číslo / Katalognummer / Αριθμός καταλόγου / Número de catálogo / Katalooginumber / Numéro catalogue / Kataloški broj / Katalógusszám / Numero di catalogo / Каталог нөмірі / 카탈로그번호 / Katalogo / numeris / Kataloga numurs / Catalogus nummer / Numer katalogowy / Număr de catalog / Номер по каталогу / Katalógové číslo / Kataloški broj / Katalog numarası / Номер за каталогом / 目录号 Authorized Representative in the European Community / Оторизиран представител в Европейската общност / Autorizovaný zástupce pro Evropském společenství / Autoriseret repræsentant i De Europæiske Fællesskaber / Autorisierter Vertreter in der Europäischen Gemeinschaft / Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Représentant autorisé pour la Communauté européenne / Autorizuirani predstavnik u Europskoj uniji / Meghatalmazott képviselő az Európai Közösségben / Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea / Европа қауымдастығындағы уәкілетті өкіл / 유럽공동체의위임대표 / Įgaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Pilnvarotais pārstāvis Eiropas Kopienā / Bevoegde vertegenwoordiger in de Europese Gemeenschap / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo we Wspólnocie Europejskiej / Representante autorizado na Comunidade Europeia / Reprezentantul autorizat pentru Comunitatea Europeană / Уполномоченный представитель в Европейском сообществе / Autorizovaný zástupca v Európskom spoločenstve / Autorizovano predstavništvo u Evropskoj uniji / Auktoriserad representant i Europeiska gemenskapen / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi / Уповноважений представник у країнах ЄС / 欧洲共同体授权代表 In Vitro Diagnostic Medical Device / Медицински уред за диагностика ин витро / Lékařské zařízení určené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medicinska pomagala za In Vitro Dijagnostiku / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medicale per diagnostica in vitro / Жасанды жағдайда жүргізетін медициналық диагностика аспабы / In Vitro Diagnostic 의료기기 / In vitro diagnostikos prietaisas / Medicīnas ierīces, ko lieto in vitro diagnostikā / Medisch hulpmiddel voor in-vitro diagnostiek / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Dispozitiv medical pentru diagnostic in vitro / Медицинский прибор для диагностики in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Medicinski uređaj za in vitro dijagnostiku / Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik / İn Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz / Медичний пристрій для діагностики in vitro / 体外诊断医疗设备 Temperature limitation / Температурни ограничения / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperaturbegrenzung / Περιορισμοί θερμοκρασίας / Limitación de temperatura / Temperatuuri piirang / Limites de température / Dozvoljena temperatura / Hőmérsékleti határ / Limiti di temperatura / Температураны шектеу / 온도제한 / Laikymo temperatūra / Temperatūras ierobežojumi / Temperatuurlimiet / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limites de temperatura / Limite de temperatură / Ограничение температуры / Ohraničenie teploty / Ograničenje temperature / Temperaturgräns / Sıcaklık sınırlaması / Обмеження температури / 温度限制 Batch Code (Lot) / Код на партидата / Kód (číslo) šarže / Batch-kode (lot) / Batch-Code (Charge) / Κωδικός παρτίδας (παρτίδα) / Código de lote (lote) / Partii kood / Numéro de lot / Lot (kod) / Tétel száma (Lot) / Codice batch (lotto) / Топтама коды / 배치코드 ( 로트 ) / Partijos numeris (LOT) / Partijas kods (laidiens) / Lot nummer / Batch-kode (parti) / Kod partii (seria) / Código do lote / Cod de serie (Lot) / Код партии (лот) / Kód série (šarža) / Kod serije / Partinummer (Lot) / Parti Kodu (Lot) / Код партії / 批号 ( 亚批 ) Contains sufficient for <n> tests / Съдържанието е достатъчно за <n> теста / Dostatečné množství pro <n> testů / Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests / Ausreichend für <n> Tests / Περιέχει επαρκή ποσότητα για <n> εξετάσεις / Contenido suficiente para <n> pruebas / Küllaldane <n> testide jaoks / Contenu suffisant pour <n> tests / Sadržaj za <n> testova / <n> teszthez elegendő / Contenuto sufficiente per <n> test / <п> тесттері үшін жеткілікті / <n> 테스트가충분히포함됨 / Pakankamas kiekis atlikti <n> testų / Satur pietiekami <n> pārbaudēm / Inhoud voldoende voor n testen / Innholder tilstrekkelig til <n> tester / Zawiera ilość wystarczającą do <n> testów / Conteúdo suficiente para <n> testes / Conţinut suficient pentru <n> teste / Достаточно для <n> тестов(а) / Obsah vystačí na <n> testov / Sadržaj dovoljan za <n> testova / Innehåller tillräckligt för <n> analyser / <n> test için yeterli malzeme içerir / Вистачить для аналізів: <n> / 足够进行 <n> 次检测 13