Khellin Figur 1: Ammi visnaga Lam. (Alchemy-works, 2009). Azadeh Karami Biologiska aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling 7,5 hp Apotekarprogrammet VT 2011 Handledare: Christina Wedén Institutionen för läkemedelskemi Uppsala universitet 1
Innehållsförteckning Historisk bakgrund...3 Hur och varför projektet startade...4 Metodbeskrivning för extraktion och isolering av substansen...5 Beskrivning av biologisk aktivitet...6 Läkemedelsutveckling...7 Klinisk effekt och användning...7 Referenslista...9, 10 2
Historisk bakgrund Khellin C14H12O5 är en organisk förening som har sitt ursprung i växten Ammi Visnaga (L.). A. Visnaga finns i medelhavet och i mellanöstern och även i Sydamerika och i södra Sverige förekommer den sporadiskt. Man odlar växten för att kunna framställa naturläkemedel ur den och det är mest frukten som används för läkemedelsframställning (Samuelsson, 2004). I Egypten använde man frukten till att koka en dekokt som kunde verka som en diuretikum vid behandling av renalt kolik (Darwish Sayed, 1980). Figur 2: Ammi visnaga (foto från B.J. Fields hemsida Herbal medicine ) Man har länge använt A. Visnaga för att få fram khellin inom traditionella medicineringar som har visat effekt mot till exempel magkramper, astma, diabetes, kärlkramp angina pectoris och smärta i njurarna samt urinvägar som har glatt muskulaturspasm och kramp som orsak(darwish Sayed, 1980; Samuelsson, 2004).nu för tiden använder man khellin sparsamt för att den har svåra biverkningar (Samuelsson, 2004). Man kallar även växten för toothpick plant eftersom man kan använda de torkade stjälkarna som tandpetare. I A.visnagas frukten finns två ämnen: visnagin 0,05-0,1 % och 0,5-1% khellin (se figur 3) (Samuelsson, 2004). 3
Det var under 1946 som en medarbetare på G.V. Anreps laboratorium som hade njuråkomma och angina pectoris fick en kur av A.visnaga frön och förbättrades och detta ledde till att A. visnaga börjades användas inom den moderna läkemedelsindustrin och man tog fram khellin ur A. visnaga (Anrep 1947). Man har använts khellin även för utveckling av medel mot allergi och astma. Khellin är ett kristallint pulver som är färglöst till svag gulaktigt och har bitter smak med smältpunkten mellan 150-155 C. Khellin har lipofila egenskaper och är löslig i etanol, saltsyra och kloroform men inte löslig i vatten (Deutsches Arzneibuch, 1964). Hur och varför projektet startade Khellin är en ren kristallin derivat av växten A.visnaga som växer vild i de östra medelhavsområdena och den kallas Khella på arabiska. Redan från antiken kände man de medicinska egenskaperna hos A. Visnaga. Den infödda befolkningen använde ett avkok av A. visnaga frön som ett kramplösande medel för att behandla renal kolik på grund av växtens diuretiska verkan (Harold et al., 1951). Detta var ett vanligt problem i Egypten till följd av njursten bildning i samband med snäckfeber. En studie i universitet i Kairo år 1930 visade att khellin hade relaxerande effekt på de glatta muskulaturerna. Det visade att växten har både diuretisk effekt och relaxerande effekt på urinvägarna som gör att man får en förbättring av njurkolik vid khellin behandling. De kristaller som Ibrahim Mustapha fick fram år 1879 fick namnet khellin (från El Kellah, det moriska namnet på växten) och år 1938 erhöll Ernst Späth khellin i form av rena kristallen och klarlagde khellins struktur. Mycket av intresse i khellin var riktad mot dess effekt på hjärtat, efter en serendipitious observation med Gleb von Arnep, en professor i farmakologi i Kairo. En av hans laboratorieassistenter använde khellin för att behandla sin njurkolik men även hans angina försvann, Anrep inledde därefter prövningar av khellin på kransliknande blodflödet hos hundar, följt av en klinisk studie hos patienter med kärlkramp. Anrep föreslog att khellin hade positiva effekter när det ges via munnen som ledde till att i allmänhet var man positiv till användningen av khellin, tills en studie i USA visade att angina patienter som fått behandling med khellin alla hade upplevt toxiska symtom som en följd av detta så man försökte att hitta mindre toxiska analoger (Sneader, 2005). 4
Metodbeskrivning för extraktion och separation av Man kan använda flera olika metoder för att extrahera khellin ur A. visnaga och den vanligaste metoden är att göra en tinktur eller te genom att dra khellin i etanol eftersom den är lipofil och löslig i etanol. Man ska torka fruktrena med luft och sedan finfördela växtmaterialet dem som i sin tur kommer att homogeniseras i en blandning som består av lika mycket vatten och ättiksyra. Det homogeniserade materialet ska centrifugeras i 20000 r under 20 minuter och man tar supernatanten och resten ska man extrahera en gång till med en blandning som består av lika mycket vatten och ättiksyra och sedan centrifugerar man igen och man tar supernatanten tillvara. På så sätt får man ett extrakt som består av khellin och i en viss mängd visnagin (Franchi et al., 1985). Detta extrakt kan man sedan separera genom Reversed Phase HPLC med metanol som mobil fas för att få fram khellin (Martelli et al., 1984). Figur 3: Visnagin t.v. och Khellin t.h. (Pubchem compounds, 2005) Man har utvecklat en metod som är bättre, enklare, mer selektivt och mer känsligt för att separera khellin och visnagin i A.visgana frukten. Denna metod är en RP-HPLC med hjälp av en intern standardiserad teknik med en C18 kolon och en mobil fas som består av vatten: metanol: acetonitril (49: 49: 2) och med ett flöde som är 1,5 ml/min. Med en spektrofotometer inställd på 250 nm kan man upptäcka samt analysera khellin och visnagin. Resultatet av RP-HPLC analysen visar en relativ standardavvikelse på <0,04 % vilket är bra jämfört med de analytiska metoder som använts för kvantifiering av khellin i olika läkemedelsformer såsom tabletter, suppositorium och ampuller med 5
den relativa standardavvikelsen 1,4, 1,7, 1,2 %. Analysen kan göras i mindre än 13 minuter och det krävs så lite som 10 ng khellin (El-Domiaty, 1992). I en studie visade Günaydin och Erim att man kan använda CE (kapillärelektrofores) för att identifiera och bestämma khellin och visnagin i A.visnaga. Eftersom khellin och visnagin är ickejoniska så man kan använda MEKC (micell elektrokinetisk kromatografi) för att analysera dem. Man använder metanol och acetonitril som organiska modifierare och som surfaktant tillsätter man SDS (natrium dodecylsulfat) till den mobila fasen och beroende på de ämnenas integration med micellerna i SDS så får de olika retentionstider. Med elektrofores har man kortare analystid och det behövs mindre reagens jämfort med HPLC (Günaydn och Erim, 2002). I en studie av Günaydn och Beyazit som gjordes år 2004 kunde de analysera kvantitativt khellin med hjälp av UV-spektrometri och GC (gaskromatografi). Man extraherade de substanserna från torkade A.visnagas frukter med soxhlet och metanol som mobil fas under 30 timmar och sedan har man återupplöste man substanserna i en blandning av vatten och etanol. Sedan följdes med en extraktion med hexan och därefter kloroform. Slutligen eluerade man extraktet ur kloroform med hjälp av en kromatografisk metod som hade kiselgel som kolonn och först hexan som mobil fas och sedan kloroform/aceton (Günaydin och Beyazit, 2004). I en annan studie av Zgórka et al. visar man att även en kombination av SPE (fastfasextraktion) och HPLC kan användas för att kvantifiera de ingående substanserna i A.visnagas. Metoden har visat sig snabbare och effektivare jämfört med HPLC och ger en bättre reproducerbarhet (Zgórka et al., 1998). Beskrivning av biologisk aktivitet Traditionellt har man använt frukten av A. visnaga för att relaxera glatt muskulatur och för att lindra kramper i kroppen (Anrep 1947) och dessutom har man studerat khellin i behandling av psoriasis och vitiligo (Valkova et al., 2004). Förut tyckte man att de terapeutiska effekterna av furokumariner och furochromones plus UV-A ljus berodde på att de bildade foto addukter i cellkärnan med DNAt men enligt en studie av Di Stefano et al. Verkar det vara på grund av membran effekt systemet. Man visar att i HeLa celler, khellin i kombination med UVA ljus hämmar NaF-stimulerade adenylat cyklas aktivitet och ökar GTPas aktiviteten vilket inte ses i samma experiment med 8-metoxipsoralen (8-MOP) i kombination med UVA ljus. Detta resultat tyder på att HeLa celler är ett mål för khellin och inte för 8-MOP (Di Stefano et al., 1995). 6
I en annan studie av Di Stefano et al. visar man för första gången att khellin som är en furochromone strukturellt besläktad med furokumariner med foto terapeutisk effekt och används för behandling av vitiligo och psoriasis. Den kan framkalla ett intracellulärt svar genom Gi alpha proteinet (Di Stefano et al., 1996). Läkemedelsutveckling I USA använde man i början av 1900 khellin som bronkdilaterande medel men eftersom med överdosering fick man mycket biverkningar i form av kräkning och illamående så förbjöds detta i USA men under 1950 började forskarna i Europa att forska och hitta nya medel mot angina pectoris och astma ur khellin (Fabricant och Farnsworth, 2001). Visnagin och khellin har fotobiologisk aktivitet mot olika levande organismer inklusive virus, bakterier och svampar vilket ledde till en ingående studie av foto fysikaliska egenskaper hos dessa naturligt förekommande furanochromones. Man använde photoacoustic kalorimetri, laser-flashfotolys och fluorescens teknik i lösningsmedel med olika polaritet och i vatten, inklusive vesiklar och miceller. Resultatet visade att hastighetskonstanten för visnagin och khellin är stark beroende av lösningsmedelet dvs. dess förmåga för att bilda vätebindningar och polariteten (Borges et al., 1998). Klinisk effekt och användning Vitiligo är en idiopatisk leukoderma, ofta progressivt, som orsakar förstörelse av melanocyterna. Trots mycket forskning har man inte hittat en klar orsak för sjukdomen och de prevalenta hypotesrena omfattar bland annat genetiska, neurala, virus, autoimmuna och tillväxtfaktor brist som har varit grunden för behandlingen av sjukdomen. Olika metoder används för att förbättra åter pigmenetring av huden. Khellin har en kemisk struktur som liknar psoralen och det har rapporterats som ett effektivt läkemedel för behandling av vitiligo i samband med ultraviolett-a strålning (Hossani- Madani och Halder, 2010). Khellin har föreslagits som ett botemedel för behandling av vitiligo eftersom det har fototerapeutiska egenskaper som liknar de psoralen men saknar deras fototoxiska verkan och hellre inte DNA mutations. Syftet med studien var att utvärdera effekten av en roman gel formulering av Khellin, baserat på ett vatten/2-propanol/propylene glykol (WPG) ternära system för att öka dess löslighet i aktuella ljusterapi av Vitiligo. Tretio sex patienter som hade olika typer av vitiligo genomgick en 6 7
månaders behandling och resultatet visade en förbättring hos patienterna genom att khellin underlättade tillgången till läkemedlet i huden (Orecchia et al., 1998). En befintlig behandlig för vitiligo för att få åter pigmentering av huden, är både lokal behandling (KUVA) och systematisk behandling (PUVA). PUVA kan ge allvarliga biverkningar, vilket har varit anledning till vidare forskning för att kunna hitta nya och lika effektiva foto kemo terapeutiska alternativa behandlingar. En av dem ämnena som kan användas i KUVA behandling är khellin. Man gjorde en pilotstudie på 33 patienter för att kunna jämföra PUVA och KUVA behandlingar med varandra i termer av graden av repigmentering, behandlingstid, totalt UVA dos, antalet förfaranden, och biverkningar och utvärdera effektiviteten för khellin behandlingen. Lokala KUVA kräver längre behandlingstid och det behövs högre doser av UVA och man fick bättre åter pigmentering hos yngre patienter och det har inte observerats biverkningar med KUVA behandling. I PUVA har man observerat biverkningar i form av klåda och gastrointestinala störningar. Resultaten tyder på att lokala KUVA behandlingar kan effektivt inducera åter pigmentering av de hud område som är drabbade av vitiligo jämfört med den som man uppnår vid systematisk PUVA behandling med förutsättning att behandlingstiden är tillräckligt lång (Valkova et al., 2004). I en studie av Carlie et al. har man bevisat att khellin aktiveras av UVA och stimulerar melanocyt spridningen och man kan förbättra nuvarande behandlingen för vitiglo och psoriasis med hjälp av användning av khellin (Carlie et al., 2003). Enligt Tritrungtasna et al. har man vissa uppgifter som tyder på att khellin kan främja ny hårväxt i samband med UVA behandling hos patienter som lider av alopecia areata. Khellin gör huden känsligare till UVA vilket leder till ett bättre resultat av behandlingen(tritrungtasna et al., 1993). 8
Referenslista Alchemy-works URL: http://www.alchemy-works.com/resources/ammi_visnaga.jpg 2011.02.08 Anrep G.V., Kenawy M.R., Barsoum G.S., Misrahy G. Therapeutic Uses of Khellin. The Lancet, 1947, April 26, 557-558. Borges M.L., Latterini L., Elisei F., Silva P.F., Borges R., Becker R.S., Maçanita A.L. Photophysical properties and photobiological activity of the furanochromones visnagin and khellin, 1998, 184-191. Carlie G, Ntusi NB, Hulley PA, Kidson SH. KUVA (khellin plus ultraviolet A) stimulates proliferation and melanogenesis in normal human melanocytes and melanoma cells in vitro. British Journal of Dermatology, 2003, 707-717. Darwish Sayed, M. Traditional Medicine in Health Care. Journal of Ethnopharmacology, 1980, 2, 19-22. Deutsches Arzneibuch (band 3), 7:e utgåvan, Akademie-Verlag, Berlin 1964. Di Stefano A., Trabalzini L., La Gaetana R., Parente L., Lusini P., Martelli P. Khellin, but not 8- methoxypsoralen, inhibits adenylyl cyclase system in HeLa cells, 1995, 162-166. Di Stefano A., La Gaetana R., Bovalini L., Lusini P., Martelli P. Pertussis toxin reverses the inhibition of the adenylyl cyclase system by khellin in HeLa cells, 1996, 105-108. El-Domiaty M. M. Improved high-performance liquid chromatographic determination of khellin and visnagin in Ammi visnaga fruits and pharmaceutical formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1992, 475-478. Fabricant D.S., Farnsworth N.R. The value of Plants Used in Traditional Medicine for Drug Discovery. Environ Health Perspect, 2001, 109(suppl 1), 69-75. Franchi G.G., Bovalini L., Martelli P., Ferri S., Bardellati E.S. High Performance Liquid Chromatography Analysis of the Furanochromones Khellin and Visnagin in Various Organs of Ammi visnaga (L.) Lam. at Different Developmental Stages. Journal of Ethnopharmachology, 1985, 14, 203-212. Günaydin, K. och Erim, F.B. Determination of khellin and visnagin in Ammi visnaga fruits by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 2002, 954, 291-294. 9
Günaydin, K. och Beyazit, N. The chemical investigations on the ripe fruits of ammi visnaga (Lam) Lamarck. growing in Turkey. Natural Product Research 2004, 18, 169-175. Harold L., Osher M.D., Kermit H., Katz M.D., and Donald J. Wagner M.D., Khellin in the Treatment of Angina Pectoris. The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE, 1951, 244, 315-321. Hossani-Madani A.R och Halder R.M. Topical treatment and combination approaches for vitiligo: new insights, new developments, 2010, 57-58. Martelli P., Bovalini L., Ferri S., Franchi G.G. Rapid separation and quantitative determination of khellin and visnagin in Ammi visnaga (L.) Lam. Fruits by highperformance liquid chromatography. Journal of Chromatography, 1984, 301, 297-302. Orecchia G., Tatoni P., Bignamini E., Gazzaniga A., Giordano F., A NEW KHELLIN FORMULATION FOR THE TOPICAL PHOTOCHEMOTERAPY OF VITILIGO. Pigment cell & Melanoma Research, 1998, 253. Pubchem Compound (2005). Sökning på Khellin. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=3828&loc=ec_rcs, 2011.02.08 Pubchem Compound (2005). Sökning på Visnagin. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=6716&loc=ec_rcs, 2011.02.08 Samuelsson G. Drugs of Natural Origin: A Textbook of Pharmacognosy. Apotekarsocieteten, Stockholm 2004, 5:e reviderade upplagan, 240-242. Sneader W. Drug Discovery: a history. University of Strathclyde, Glasgow, UK, 2005,110. Tritrungtasna O., Jerasutus S., Suvanprakorn P. Treatment of alopecia areata with khellin and UVA. Int J Dermatol. 1993, 32. Valkova S., Trashlieva M., Christova P. Treatment of vitiligo with local khellin and UVA: comparison with systemic PUVA. Clin Exp Dermatol, 2004, vol 29, 180-184. Zgórka G., Dragan T., Glowniak K. och Basiura E. Determinations of Furanochromones and pyranocumarins in drugs and Ammi visnaga fruits by combined solid-phase extraction- high performance liquid chromatography and thin-layer chromatography- high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1998, 797, 305-309. 10