Aequorin 5 Februari 2012 Aequorea Victoria (Haddock, 1999). Maria Nilsson Apotekarprogrammet, termin åtta. Biologiskt Aktiva Naturprodukter i Läkemedelsutveckling 7,5 p Handledare, Lars Bohlin Inst. f. Läkemedelskemi, Avd. f. farmakognosi Uppsala Universitet 1
Sammanfattning Jag har valt att skriva om aequorin som är ett bioluminiscent fotoprotein och utvinns ur maneterna Aequorea victoria eller Aequorea victoria. Aequorin är ett kalcium känsligt proteinet och när aequorin utsätts för kalcium kommer den att genomgå en konformationsändring och utsända ett blått ljus. Därför används proteinet idag ofta som prob eller biomarkör för att kunna detektera biologiska aktiviteter genom att utnyttja dess kalcium känslighet. 1961 upptäcktes proteinet Aequorin för första gången av professor Shimomura och 1985 klonades proteinet för första gången. För denna upptäckt fick Shimomura nobelpriset år 2008 i kemi. Aequorin och dess egenskap att bioluminiscera har fått en ökad betydelse för drug screening i läkemedelsutveckling. Bioluminiscens är en ny lämplig detektions teknik som passar för high throughput screening då metoden snabbt kan detektera analyter och är mycket känslig. 2
Innehållsförteckning Framsida 1 Sammanfattning 2 Innehållsförteckning..3 Historisk bakgrund. 4 Forskningens begynnande av Aequorin.4 Biologisk aktivitet 4-7 Extraktion och isolering... 8 Aequorin och Läkemedelsutveckling...8-10 Slutsats. 10 Referenslista. 11-12 3
Historisk bakgrund Doktor Osamu Shimomura född i Japan, Kyoto tog sin Apotekarexamen i japan, för att sedan arbeta som professor i biologi vid Princeton Universitet. Det var 1961 som Shimomura upptäckte proteinet aequorin och GFP (green fluorescerande protein) i maneten Aequorea aeuqorea och 1962 som extrakten pressades ut för första gången från 10000 maneter. Många substanser tillsattes manet extrakten men ändå syntes ingen luminiscens. Det var när Shimomura tillsatte havsvatten till aequorin extrakten som en plötslig luminiscens uppstod. Då förstod Shimomura att det var kalcium som behövdes för att luminiscens skulle kunna uppstå. Nu ville Shimomura identifiera strukturen på kromoforen som orsakade denna luminiscens och mekanismen för hur luminiscens uppstod. För att kunna struktur bestämma kromoforen krävdes 100-200mg extrakt från Aequorea aeuqorea maneten vilket motsvarade 50000 maneter. Operation Jellyfish startades och äntligen år 1973 kunde kromoforen strukturbestämmas. 1985 klonades för första gången proteinet aequorin. Upptäckten, extraktionen och klonandet av proteinet aequorinet gav Osamu Shimomura och hans kollegor Martin Chalfie och Roger Y. Tsien Nobelpriset i kemi år 2008. Forskningens begynnande av Aequorin Det började med att Doktor Frank Johnson visade en burk frystorkad från den självlysande maneten Aequorea aequorea för Shimomura och sa att om pulvret blandades med vatten skulle ett starkt ljus avges. Johnson frågade om Shimomura ville vidareforska kring manetens luminiscens. Shimomura blandade ut pulvret med vatten men med resultatet att inget ljus syntes. Dock var han fortfarande nyfiken på detta med självlysande maneter och började forska kring dessa självlysande maneter för att sedan upptäcka fotoproteinet aequorea (Shimomura, 1995; Roda, 2003; Tsuji, 2010). 4
Biologisk aktivitet Aequorin är ett kalcium känsligt fotoprotein som kan hittas i maneterna Aequorea aequorea och Aequorea victoria. I denna manet kan även proteinet GFP (green flourescens protein) hittas. När GFP proteinet utsätts för ultraviolett ljus kommer den att utsända ett grönt fluorescerande ljus. Det som sker i maneten är följande, proteinet aequorin utsätts för kalcium och kan på så sätt utstråla ett blått ultraviolett ljus. Detta blåa ljus når proteinet GFP och GFP proteinet kan i sin tur utstråla ett grönt ljus. Aequorin proteinet är bioluminiscerande alltså, en biokemisk reaktion sker och framkallar ett ljus. Proteinet GFP har existerat i mer än hundrasextio miljoner år i den bioluminiscerande maneten Aequorea victoria och den lever i vattnet på Nordamerikas kust. Aequorin proteinet är helt ofarligt och används därför ofta som prob för att monitorera intracellulära nivåer av fritt kalcium (Head et al., 2000). Figur 1. Aequorin molekylen avger blått ljus i närvaro av Ca 2+ som i GFP omvandlas till grönt ljus (Zimmer, 2011). 5
Struktur Aequorin molekylen består av fyra helix- loop- helix domäner där tre av dem kan binda en kalcium molekyl. Molekylen består av co- faktorn coelenterazine som är ett luciferase och ett apoprotein (189 aminosyror) samt av molekylärt syre. När kalcium tillsätts genomgår molekylen en konformationsändring då coelenterazine oxiderar till coelenteramide samtidigt som CO 2 och ett blått ljus på 470 Nm frisätts. På grund av den låga bakgrundssignalen kan mycket låga nivåer detekteras och metoden har en hög känslighet. Detta har utnyttjats vid biologiska och analytiska undersökningar t.ex. vid olika assays och detektion av intracellulär kalcium (Head et al., 2000). Figur 2. Aequorin molekyl (PDB, 2012). För att denna intramolekylära reaktion ska kunna ske krävs närvaro av molekylärt syre. Coelenterazine existerar i molekylen som peroxiderad form där peroxidasgruppen sitter på molekylens andra kol. Genom vätebindningar som binder hydroperoxiden till tyrosin 184 som i sin tur binder med vätebindningar till histidin 169 kan hydroperoxiden stabiliseras. Vätebindnings interaktioner mellan samtliga aminosyrorna är viktig för molekylens luminiscens aktivitet (Head et al., 2000). 6
Figur 3. Tre stycken EF händer har bundit Ca 2+ molekyler hos Apoaequorin ovan (PDB, 2012). Aequorins fyra EF händer som är arrangerade i par ger den en globulär form. Även när proteinet är i sitt kalcium fria tillstånd så kan detta liknas vid när calmodulin binder en molekyl i närvaro av kalcium. EF händerna skapar en hydrofob kärna i mitten där coelenterazine binder och har en volym på 600Å 3. Håligheten där coelenterazine binder är sluten och kan liknas vid en sfär med radien 1,4 Å. I håligheten finns det ett lysin och dess N- terminal är involverad i protein interaktionerna. Längs håligheten finns samtliga hydrofoba sidokedjor med 3 histidin, 3 tyrosin, 2 treonin och ett lysin. Histidinerna och tyrosinerna är organiserade i tre par där varje par är länkad till en tryptofan. Varje länk, Histidin- tyrosin- tryptofan har betydelse för proteinets funktion men man vet inte de specifika funktionerna för dessa. Teoretiska syntetiska modeller har studerats med coelenterazine analoger och deras förmåga att reagera med apoaequorin. Genom dessa teoretiska försök har man bl.a. funnit att aromatringar som är bundna till kol sex och kol två på coelenterazine är nödvändig för denna reaktion. Det har visats att endast två av de kalcium bindande enheterna behöver binda kalcium för att en reaktion ska kunna ske. Studier har även visat att när glycin på en EF hand byttes ut mot en arginin försvann förmågan för molekylen att luminiscera i närvaro av kalcium (Head et al., 2000). 7
Extraktion och isolering av Aequorin Shimomura extraherade Aequorin molekyler på ett annorlunda sätt än idag, manetens ringar klämdes och en substans kunde erhållas från maneterna. Dock krävs väldigt många maneter för att få ut en större mängd substans. Idag kan rekombinant aequorin extraheras från apoaequorin som uttrycks i Escherichia coli celler. För att få aequorin från apoaequorin cellerna kan cellerna inkuberats med buffertlösning innehållande coelenterazine. För att isolera den extraherade aequorin kan detta ske i två steg, med anjonskromatografi och hydrofoba interaktions kromatografi (Shimomura och Inouye, 1999). Aequorin och Läkemedelsutveckling På grund av aequorins höga känslighet för kalcium och dess ofarliga egenskaper utnyttjas molekylen ofta som prob vid bestämning av intracellulära kalcium nivåer. När det bioluminiscerande aequorin proteinet utnyttjas i olika assays t.ex. immunoassays konjugeras det ihop med analyten som är av intresse. Aequorin proteinet kan antingen konjugeras ihop kemiskt eller via gen sammanslagning. Vid kemisk sammanslagning konjugeras den intressanta analyten ihop med aequorin med hjälp av reaktiva grupper som finns på vissa aminosyror. T.ex. finns det fria aminogrupper av sulfhydryl eller lysin på aequorin. Vid gen sammanslagning slås DNA sekvensen för analyten av intresse ihop med gensekvensen för apoaequorin genom dess N- terminal (C- terminalen behöver vara intakt då den står fören del av molekylens aktivitet). En fördel med gen sammanslagning jämfört med kemisk konjugering är att det är enklare att reproducera och det är mindre steg till för att kunna protein isolera. När man lyckades klona apoaequorin och uttryckte proteinet i Escherichia coli har rekombinanta aequorin kunnat massproduceras. Fördelar med aequorin som markör Metoder med aequorin som biosensor har många fördelar jämfört med andra metoder för att undersöka biologiska aktiviteter, nedan nämns samtliga. 1. Aequorin proteinet är nästan okänslig för ph förändringar. 8
2. Aequorin finns inte naturligt i däggdjur. 3. Aequorin har visat en försumbar toxicitet i däggdjur. 4. Det är möjligt att bestämma destination för aequorin I olika sub cellulära områden där den kan mäta lokala kalciumnivåer förändringar. 5. Det är möjligt att syntetisera coelenterazines med olika grad av affinitet till kalcium och nivåer av kalcium från 10 7 till 10 3 M kan mätas. 6. På grund av den låga energin som krävs för emission och proteinets låga stabilitet är det svårt att imitera signaler som kommer från aequorin. 7. Varje aequorin molekyl kan endast ge ett enda emissions spektra per kalcium bindning på grund av att coelenterazinen (molekylens substrat) binder väldigt sakta. Metoden att använda aequorin protein som mätning av biosensor har alltså många fördelar vid mätning av intracellulära kalciumnivåer och har tagit över andra metoder som NIR (Bakayan et al., 2011). Tillämpning i läkemedelsutveckling Ett exempel där aequorin används som markör är i en studie där G- protein kopplade receptorer (GPCR) karakteriseras. För att utvärdera en GCPR funktion mäts ofta kalciumnivåer. Det finns många fördelar med att använda aequorin då GCPR ska studeras vilket har resulterat i att studier på cell linjer minskat. För att kunna utföra studier på GCPR med hjälp av aequorin som kalcium prob är det nödvändigt att cellsystemet uttrycker både apoaequorin och GPCR. Detta har utförts genom att använda stabila cellinjer eller genom att använda virala vektorer som kodar för apoaequorin eller transfekterade plasmider. Genom att använda transfekterade apoaequorin proteiner kan mycket tid sparas då stabila celler kräver sex till nio månader av förberedning. I denna studie har humana muskarina receptorer transfekterats med en plasmid som kodar för apoaequorin proteiner (Jones et al., 2010). Ett annat exempel där aequorin utnyttjats som biosensor är i studien, Bioluminescence for angiotensin II using aequorin as a label (Qu et al., 2007). Höga nivåer av angiotensin 2 kan ge allvarliga biverkningar som högt blodtryck och hjärtinsufficiens genom att angiotensin II binder till typ 1 receptorer. I denna studie har man mätt halt av angiotensin II i human plasma med aequorin som biomarkör i en bioluminiscens 9
immunoassay för att kunna bedöma angiotensin nivåerna med syftet att kunna förebygga högt blodtryck och hjärtinsufficiens. För att kunna utföra detta kopplades C- terminalen på angiotensin II molekylen ihop med N- terminalen på apoaequorin så att ett kombinerat protein bildades. Ett kombinationsprotein för angiotensin 2 och aequorin skapades genom DNA sekvensen från angiotensin 2 och genen som kodade för aequorin proteinet. En plasmid förbereddes som bestod av DNA för en cystein fri mutant av aequorin då denna variant utan cystein har en bättre stabilitet och en starkare bioluminiscens förmåga. En plasmid som innehöll DNA sekvensen som kodade för kombinationsproteinet skapades. Plasmiden som utvecklades integrerades i Escherichia coli celler och proteinet kunde uttryckas (Qu et al., 2007). I studien Aequorin luminescence- based assay for 5- hydroxytryptamine (serotonin) type 3 receptor characterization (Walstab et al., 2007) har Aequorin använts för att detektera 5- HT 3 receptorer (5- hydroxytryptamine (serotonin receptorer) på humana njurceller. Den vanligaste metoden f ör att kunna detektera 5- HT 3 receptorer är med elektrofysiologiska metoder. Då denna metod är mycket långsam och kräver mycket arbete har metoden ersatts av metoden med aequorin och dess bioluminiscens då metoden har flera fördelar en den förra t.ex. är den en snabbare och känsligare metod och den kan användas med HTS. 5- HT 3 receptorer är permeabla för olika Na +, K + och Ca 2+ joner och med hjälp av aequorin proteinet som prob kan in flux av kalcium mätas (Walstab et al., 2007). Slutsats Aequorin baserade assays ersätter många metoder för att karakterisera olika biologiska aktiviteter då den är lätt att reproducera, är inte toxiskt och ger en bra signal utan bakgrundsbrus. Om aequorin proteinet kan konjugeras kemiskt eller uttryckas genetiskt hos en analyt som är av intressen finns det inga begränsningar för vad man kan ta reda på. Och genom att undersöka olika receptorer och andra molekyler av intresse kan det underlätta vid framtagning av nya läkemedelssubstanser. 10
Referenslista Bakayan, A., Vaquero, C., Picazo, F., Llopis, J. (2011). Red Fluorescent Protein- Aequorin Fusions as Improved Bioluminescent Ca 2+ Reporters in Single Cells and Mice. PLoS ONE 6(5): e19520. doi:10.1371/journal.pone.0019520. Haddock, S. (1999). http://www.lifesci.ucsb.edu/~biolum/organism/photo.html Head, J., Inouye, S., Teranishi, K., Shimomura, O. (2000). The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2,3 Å resolution. Nature 405: 372-376. Jones, B., Holskin, B., Meyer, S., Ung, T., Dupriez, V., Flores, S., Burgeon, E., Ator, M., Duzic, E. (2010). Aequorin functional assay for characterization of G- protein coupled receptors: Implementation with cryopreserved transiently transfected cells. Analytical Biochemistry 400: 184-189. Protein Data Bank. (2012). http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do Qu, X., Deo, S., Dikici, E., Ensor, M., Poon, M., Daunert, S. (2007). Bioluminescence immunoassay for angiotensin ll using aequorin as a label. Analytical Biochemistry 371: 154-161. Roda, A., Guardigli, M., Pasini, P., Mirasoli, M. (2003). Bioluminescence and chemiluminescence in drug screening. Analytical Bioanalytical Chemistry 377: 826-833. Shimomura, O. (1995). A Short Story of Aequorin. Biological Bulletin 189: 1-5. 11
Shimomura, O., Inouye, S. (1999). The in Situ Regeneration and Extraction of Recombinant Aequorin from Escherichia coli Cells and the Purification of Extracted Aequorin. Protein Expression and Purification 16: 91-95. Tsuji, F. (2010). Early History, Discovery, and Expression of Aequorea Green Flourescent Protein, With a Note on an Unfinished Experiment. Microscopy Research And Technique 73: 785-796. Walstab, J., Combrink, S., Brüss, M., Göthert, M., Niesler, B., Bönisch, H. (2007). Aequorin luminescence- based assay for 5- hydroxytryptamine (serotonin) type 3 receptor characterization. Analytical Biochemistry 368: 185-192. Zimmer, M. (2011). http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/gfp- ww/shimomura.html 12