Cellskada och manipulering av cellers känslighet för stress

Cellskada och manipulering av cellers känslighet för stress Bakgrund En cellskada kan uppstå på många olika sätt, till exempel exponering för kemikalier, värme, kyla, hypoxi, ischemi eller strålning. Hur allvarlig skadan blir beror på vilket typ av stimuli och dess styrka och varaktighet. I denna laboration studeras oxidativ stress som är en typ av negativ påverkan och uppstår på grund av reaktiva syrederivat till exempel syreradikaler och väteperoxid. Om celler utsätts för någon av dessa leder detta till oxidation av olika cellulära komponenter som påverkar funktionen hos makromolekyler (DNA, proteiner, lipider, kolhydrater). En viss bildning av reaktiva syreradikaler sker hela tiden i alla celler. Under normal metabolism bildas det reaktiva syrederivat ifrån 1 % av allt syre som metaboliseras. Antioxidanter är ämnen som kan skydda celler mot oxidativ stress genom att stoppa reaktionerna som skapar fria syreradikaler. Normalt finns det även en skyddsmekanism som utgörs av enzymet SOD (superoxiddismutas) som omvandlar superoxidradikaler till väteperoxid (mindre reaktiv). Reaktionen som bildar fria syreradikaler ser ut som nedan: O 2 ---> O 2 --->O 2 2- ---> HO ---> H 2 O Ett annat sätt att minska skadligheten av reaktiva syrederivat är att hålla koncentrationerna av fria järnjoner låga genom att använda en järnkelerare som binder upp fria järnjoner. Detta eftersom väteperoxid kan göra skada genom att reagera med fria järnjoner via Fentonreaktionen där en hydroxylradikal bildas. Se nedan: H 2 O 2 + Fe 2+ ---> HO + OH - + Fe 3+ Oxidativ stress påverkar ofta cellmembraners funktion via en process som heter lipidperoxidering. Detta kan man studera genom att mäta ATP-nivån i celler eftersom mitokondriers förmåga att producera ATP minskar om membranet är skadat. Man kan även mäta utbredningen av lipidperoxidering genom att mäta nivåer av aldehyder (malondialdehyd, 4-hydroxyalkenaler) som bildas när cellmembran bryts ned. Hypotes Totalt skulle 10 olika prover med olika tillsatser undersökas. I de prover där väteperoxid tillsattes tros cellerna utsättas för oxidativ stress genom att skapa reaktiva syrederivat enligt formeln ovan. Skadligheten på cellerna förväntas öka i de cellodlingsskålar där både järn och väteperoxid har tillsatts då Fenton-reaktionen bör ske. I proverna med järn, järnkelerare och 1

väteperoxid tros de två första neutralisera varandra och att det endast kommer vara väteperoxid som utövar skadlig effekt. Endast järn bör verka skadligt på cellerna medan järnkelerare och antioxidant tillsatt utan väteperoxid bör ha liten påverkan på cellerna. I de prover där antioxidant och järnkelerare har kombinerats med väteperoxid var för sig förmodas dessa kunna dämpa den negativa effekten av väteperoxid. I proverna med både antioxidant och järnkelerare samt väteperoxid tros skadan bli mindre än i de enskilda proverna men i vilken grad är det svårt att säga. Material 22 st cellodlingsskålar (2x10 + 2) N-acetylcystein (antioxidant) Desferrioxamin (järnkelerare, som binder upp fria metalljoner) Järn Bilder från fluorescencemikroskop Trypanblått PBS (Phosphate-Buffered-Saline) Triklorättiksyra Tris-EDTA-buffert N-methyl-2-phenylindole ATP-standard MDA-standard Cellskrapa Metod Tillfälle 1 Tillsats av modulatorer av oxidativ stress Uppgiften är att förbereda 20 stycken cellodlingsskålar med olika tillsatser som kan påverka celler vid oxidativ stress. De modulatorer som användes var N-acetylcystein (antioxidant), desferrioxamin (järnkelerare) och järnklorid (fria järnjoner). Innan laboration förbereddes en uppställning för vilka modulatorer som skulle tillsättas till de olika cellodlingsskålarna. Se nedan. 1. kontroll (ingen tillsats) 2. järnklorid 3. järnkelerare 4. antioxidant 5. väteperoxid 6. järnkelerare+järn+väteperoxid 7. antioxidant+väteperoxid 8. järn+väteperoxid 9. järnkelerare+väteperoxid 10. antioxidant+järnkelerare+väteperoxid Volymen för modulatorerna räknades ut med hjälp av formeln; 2

C 1 *V 1 =C 2 *V 2 C 1 = koncentration före V 1 = volym före (den variabel vi räknar ut) C 2 = koncentration efter V 2 = volym efter (2ml) För att få ut V 1 V 1 = (C 2 *V 2 )/C 1 Modulator Stamlösning Slutkoncentration Järnklorid (FeCl 3 ) 2 μl 30 mm 30 μm Desferrioxamin 20 μl 100 mm 1 mm N-acetylcystein 2 μl 1 M 1 mm Tabell 1 Modulatorerna tillsattes i cellodlingsskålarna och ställdes in i cellodlingsskåpet. I skåpet är det 37 grader och 5 procent CO 2, för att efterlikna miljön som är i människokroppen. Kärnmorfologi vid apoptotisk celldöd Nästa uppgift var att studera morfologiska förändringar av cellkärnan vid apoptos. Handledarna hade innan förberett preparat och bilder för olika kombinationer av modulatorer och oxidativ stress. Med hjälp av dessa kunde man studera dessa i fluorescencemikroskop för att sedan räkna ut en procentsats på hur många celler som har gått i apoptos i de olika preparaten. Bilden visar cellkärnor som har behandlats med järn. De kärnor som är inringade har bedömts gått i apoptos. Detta eftersom de är mindre, deformerade och lyser starkare. Figur 1 Viabilitetstest nekrotisk celldöd Vi studerade också nekrotiska celler genom att använda en infärgning, trypanblått. När cellen är nekrotisk, dvs trasigt cellmembran, kan färgen läcka in till kärnan och detta gör det då lätt att se skillnad på en frisk respektive skadad cell. Två cellodlingsskålar hade gjorts iordning innan laborationen, en kontroll och en där väteperoxid hade satts till. Mediet sögs upp med hjälp av pipett. Trypanblått sattes till i båda skålarna och dessa fick inkubera i rumstemperatur under en minut. Efter detta sögs färgen upp och tvättades bort med hjälp av PBS (två gånger). En liten del PBS fick vara kvar för att cellerna inte skulle torka. Efter detta studerades cellerna i ljusmikroskop. Vid studerandet av nekrotiska celler såg man att cellerna som hade behandlats med väteperoxid färgade in med trypanblått ganska svagt. Cellkärnorna syntes tydligt men de var ganska få till antalet. Kontrollcellerna hade inget tecken på infärgning. 3

Tillfälle 2 Exponering för väteperoxid samt studera järninnehåll Skålarna odlas i en inkubatorn som skall spegla miljöförhållandena i människokroppen. Inledningsvis studerade cellerna i ljusmikroskop för att undersöka deras morfologi. Odlingsmediet pipetterades bort från skålarna för att ersättas av 1 ml PBS (Phosphate-Buffered- Saline) i skål 1-4 och 1 ml väteperoxid utblandad med PBS i skål 5-10 (se skålnummer i tabellen ovan). Därefter inkuberades skålarna åter under 60 minuter. Därpå pipetterades all PBS och väteperoxid bort ur skålarna. Efter detta tillsattes 500 µl 2,5 % triklorättiksyra (TCA) varpå cellerna lyserade. Med hjälp av en cellskrapa kunde de lyserade cellerna sedan skrapas loss. Vätskan i skålarna pipetterades till provrören som sedan frystes in. Cellernas järninnehåll studerades i ett ljusmikroskop samt kvantifiering av cellernas järninnehåll gjordes. Detta gjordes genom att räkna ut andelen järninnehållande celler (som har färgats in med blått) utav det totala antalet. Cellerna i de olika proverna var sedan tidigare behandlade med järn samt tillsats av järnkelerare och antioxidant. Tillfälle 3 ATP-analys med hjälp av chemiluminiscence Inledningsvis sögs odlingsmedlet bort från samtliga provskålar. Därefter tillsattes 1 ml PBS till skål nummer 1-4 och lika mycket väteperoxid till skål nummer 5-10. Proverna inkuberades i en timme. Efter detta pipetterades all PBS respektive väteperoxid upp ur skålarna och tillsattes till eppendorfrör. Därpå skrapas skålarna med cellskrapa för att lysera cellerna varpå 200 μl vatten blandades med cellerna i skålarna och pipetterades till eppendorfrören. Därefter lades rören på kylning till nästa tillfälle. ATP-mätning För att kunna räkna ut ATP-nivåerna studerades reaktionsformeln enligt nedan: D-luciferin + ATP + O2 -> oxyluciferin + PPi + AMP + CO2 + ljus 780 μl Tris-EDTA-buffert och 200 μl ATP tillsattes till 10 provrör. Luminometern ställdes in för bakgrunds luminiscens genom att ett av mätrören sattes i luminometern och nollställdes med hänsyn till blandningen. Därpå tillsattes 20 μl vortexat prov (PBS och väteperoxid) från eppendorfrören och sattes i maskinen för att mäta ATP-koncentrationen. Därefter tillsattes 10 μl ATP-standard till blandningen som sedan vortexades och sattes i maskinen för mätning. Slutligen beräknades provernas ATP-koncentration enligt: ATP prov =10^(-7) x I prov /((I prov + standard )-I prov ) Formeln grundar sig på att koncentrationen ATP är proportionell mot det antal fotoner som luminometern skickar ut. 4

Tillfälle 4 Mätning av lipidperoxidering Det här tillfället gick ut på att få fram koncentrationen av MDA/HAE då detta är ett mått på mängden oxidativ skada i cellerna. När oxidering av fosfolipider i cellernas membran sker bildas aldehyder som till exempel MDA och HAE. Prover till en standardkurva skapades genom att olika koncentrationer av MDA-standard (malondialdehyd) tillsattes till sex olika provrör. Sedan användes provrören som gjorts under tillfälle 3 genom att en liten mängd pipetterades till ett nytt provrör. Sedan tillsattes reagenserna R1 (N-methyl-2-phenylindole) och R2. R1 och R2 tillsattes även till standardproverna. Alla dessa inkuberades sedan i 45 C i 60 minuter. Proverna centrifugerades sedan för att få en klar supernatant, som sedan pipetterades till en 96- hålsplatta för spektrofotometrisk absorbansmätning. Koncentrationen beräknades sedan av MDA/HAE i proverna utifrån standardkurvan. Resultat Tillfälle 1 Andelen celler som bedömdes gått i apoptos: Modulatorer Totalt antal celler Antal apoptotiska celler Apoptosfrekvens i % Kontroll 63 6 9,5 Väteperoxid 32 25 78 Antioxidant 55 5 9,1 Antioxidant + järn + järnkelerare + väteperoxid Antioxidant + järn + väteperoxid 48 13 27,1 9 7 77,8 Antioxidant + väteperoxid 33 12 36,4 5

Antioxidant + väteperoxid + järnkelerare 69 12 17,4 Järn 60 18 30 Järn + järnkelerare 50 3 4,4 Järn + väteperoxid 7 6 85,7 Tabell 2 Järnkelerare + väteperoxid 72 6 8,3 Figur 2 6

Tillfälle 2 Andelen fritt järn i celler behandlade med olika modulatorer: 50% Andel celler med järn 40% 30% 20% 10% 0% Järn Järn+Antioxidant Järn+Järnkelerare Kontroll Figur 3 Tillfälle 3 Koncentration ATP i cellprover med olika modulatorer: Figur 4 7

Tillfälle 4 gur 5 Fi M Figur 6 8

Diskussion Tillfälle 1 Apoptos vs nekros De resultat som vi fick fram under delen där cellkärnor studerades med hjälp av redan tagna bilder stämde bra överens med vår hypotes. Bilden som visade ett prov med celler som utsatts för väteperoxid hade den näst högsta apoptosfrekvensen enligt vår uträkning. Det prov som hade allra högst apoptosfrekvens var det som hade utsatts för både järn och väteperoxid. Detta stämmer då väl överens med vad vi trodde från början. Provet med endast antioxidant hade en av de lägsta apoptosfrekvenserna vilket också var väntat. Det hade också provet med järn och järnkelerare vilket styrker vår hypotes om att järnkeleraren neutraliserar den skadliga effekten som järn kan ha. När järnkelerare och väteperoxid kombinerades gav det också ett resultat som inte påvisade någon hög frekvens av apoptos. Antioxidant tillsammans med väteperoxid gav en relativt hög apoptosfrekvens vilket inte stämmer överens med vad vi trodde. Detta kan bero på att antioxidanten inte är tillräckligt stark vid vissa koncentrationer av väteperoxid eller att vår beräkning inte var helt korrekt. Provet med antioxidant, järnkelerare och väteperoxid fick högre skadlig effekt än vad vi trodde om man jämför med de övriga resultaten. Det kan vara så att antioxidanten och järnkeleraren inte fungerar tillsammans men mest troligt är det att vi inte har bedömt bilderna helt rätt. Tillfälle 2 Järninnehåll Bilderna som undersöktes gav det resultat som förväntats. Både i kontrollproverna och de prover där järn och järnkelerare tillsattes hade inga celler färgats in med trypanblått. Dessa borde inte visa något heller eftersom cellerna dels lyckats binda upp allt järn själva alternativt fått hjälp av järnkeleraren. I provet där enbart järn tillsattes kunde man se att 40 % av cellerna färgats in och det var alltså fritt järn som cellerna inte klarade att binda upp. Detta stämmer överens med hypotesen. Järn som tillsats gör att cellerna inte har stor förmåga att binda upp allt och det kommer då att finnas kvar fritt. När det kom till det prov som hade tillförts järn och N-acetylcystein (NAC) sågs ett mer förvånande resultat. Det var förväntat att NAC skulle ha en mer hjälpande effekt, alltså hjälpa cellerna att binda upp järnet, dock gav uträkningarna resultatet att 24 % av cellerna var infärgade i blått. Detta innebär att NAC inte har samma förmåga att reducera järnmängden som järnkeleraren hade. Tillfälle 3 ATP-analys I resultatet ser vi endast en förändring i tre av proven. Resterande värden visar inte på en betydande skillnad. De tre proven som uppvisade en större förändring var; Väteperoxid + Antioxidant + Järnkelerare Väteperoxid Väteperoxid + Järn Både resultatet av väteperoxid och väteperoxid + järn följer vår hypotes. Däremot om man tillsätter antioxidant och järnkelerare blev resultatet oväntat, då cellerna hade större värde än kontrollgruppen. Det kan bero av flera faktorer, antingen att väteperoxiden 9

överkompenserades och de fria radikalerna minskade i jämförelse med kontrollgruppen eller fel beroende av metodiken. Att värdet minskar vid tillsättning av väteperoxid och än mer av väteperoxid i kombination med järn är logiskt eftersom det då kommer ske en Fentonreaktion. I reaktionen bildas de fria radikalerna hydroperoxyl och hydroxyradikal vilka kommer inducera celldöd. Det är även logiskt att vi ej ser försämrade resultat vid tillsättning av antioxidant eller järnkelerare då de endast ska motverka fria radikaler. Anledningen till att antioxidanten inte gav ett högre värde än kontrollen kan vara att värdena inte skiljer sig tillräckligt från kontrollen för att det ska kunna avgöras. Tillfälle 4 Lipid peroxidering MDA-koncentrationen i de olika proverna är ett mått på lipidoxidering och därmed ett mått på oxidativ stress. I vår hypotes antog vi att både väteperoxid och järn skulle leda till oxidativ stress, vilket vi får bekräftat av resultatet. Den högsta koncentrationen fick vi i prov 8 som innehöll både järn och väteperoxid, medan prov 5 med enbart väteperoxid hade den näst högsta koncentrationen. I de prover där vi tillsatte antioxidant har vi fått mindre oxidativ stress vilket också var enligt hypotesen. Det visar att antioxidanten har en skyddande förmåga mot väteperoxiden. Även prov 6 med järn, järnkelerare och väteperoxid gick som väntat, där järnkeleraren binder upp järnet och därmed förhindrar Fentonreaktionen från att ske. Detta medför att vi får ett mycket lägre resultat än i prov 8. Våra kontrollprover följer även den hypotesen, med låg oxidativ stress i de fyra första som vi inte tillsatt väteperoxid i, samt en hög oxidativ stress i prov 5 som redan nämnts. Det som förvånade lite var att järnkeleraren var ett så pass bra skydd mot oxidativ stress även i de proven som saknade järn. Detta resultat kan visserligen bero på någon felkälla, men stärks i prov 10 där den tillsammans med antioxidant skyddade mer mot väteperoxiden än i prov 7 där vi enbart hade väteperoxid och antioxidant. Slutsatsen av laborationen är att antioxidanter ger ett skydd mot oxidativ stress. N- acetylcystein som användes är en vattenlöslig antioxidant vilket innebär att dess effekt är relativt kortvarig då det inte kan lagras i kroppen. Den förekommer endast i cytosolen och kommer därför inte kunna ge ett bra skydd mot lipidperoxidering. Med tanken på att det är en reversibel modulator så kommer effekten avtas så fort den tas bort från cellerna. Vidare kan vi konstatera att järnkelerare är väldigt effektiv på att binda upp fritt järn, vilket då ger ett skydd mot skador. Felkällor Det finns många felkällor som man skulle ha kunnat påverka. Det kan alltid ske fel vid pipetteringen av de olika ämnena. Vi kan också ha räknat fel vad gäller koncentrationer och vid beräkning av formler. Under de studier som gjordes av redan färdiga bilder kan bedömningarna vara felaktiga och variera från bild till bild. Vi vet heller inte om vi har räknat korrekt när vi sedan har räknat hur många celler som har gått i apoptos. Den mänskliga faktorn är givetvis alltid en felkälla. 10

Felkällor som vi inte hade kunnat påverka är bland annat att de färdiga bilder som tilldelades skulle kunna vara felaktiga. Vi har ingen uppfattning om bilderna har tagits vid samma tillfälle och därför blir det svårt att jämföra och tolka dem mot varandra. Vissa celler kan redan ha gått i apoptos och då försvunnit vilket gör dem omöjliga att ta med i beräkningen. Bilderna visade också endast ett urval av celler och behöver inte vara representativt för hela cellodlingen. De maskiner som användes under laborationen kan ha varit felkalibrerade eller använts på fel sätt. Inkubatorn kan ha haft fel förhållanden i fall den har öppnats och stängts för mycket. Medicinsk tillämpning Cellskador och cellulärt åldrande är något som inte kan stoppas helt och hållet, dock kan man med olika hjälpmedel göra så att skadan inte blir så allvarlig eller att åldrandet skjuts upp. Slutsatser man kan dra är att antioxidanter och järnkelerare skulle kunna användas som antidot vid olika cellskador som orsakats av väteperoxid. Det finns också en möjlighet att försöka få fram tillskott i form av antioxidanter och järnkelerare som skulle tas i ett preventivt syfte för att minska cellulärt åldrande och risken för allvarliga cellskador. Livsmedel som många människor köper, till exempel mjölk, skulle kunna berikas med dessa ämnen. Med hjälp av kunskaperna om väteperoxid och fria radikaler skulle det vara möjligt att få fram läkemedel som skulle kunna hämma okontrollerad proliferation av celler vid till exempel cancer. Laborationen visar dock att antioxidanter inte är lika bra i alla lägen då cellers naturliga järninnehåll var högre i de som hade preparerats med antioxidanter än de som inte hade fått någon tillsats alls. Därför är det viktigt att gå ut med kunskapen om att antioxidanter inte är bra i hur höga doser som helst. En annan viktig kunskap som man inte ska glömma är att väteperoxid i mycket små doser kan visa sig vara bra för cellens överlevnad. Celler bildar normalt fria radikaler i små mängder och om detta skulle främjas i mycket liten grad skulle det kunna stimulera cellerna till något positivt. Väteperoxid används som läkemedel i form av till exempel Microcid som är en antibakteriell kräm. N-acetylcystein används redan för att generera glutation i kroppen. Detta är väldigt väsentligt vid intoxikationer av läkemedel, till exempel paracetamol. Järnkelerare används också som läkemedel för att behandla järnförgiftningar eller sådana sjukdomar som sekundärt bildar fria järnjoner i kroppen. Detta är patologiskt eftersom järn kommer att lagras in som hemosiderin i olika vävnader och utövar skadeeffekter på olika sätt. Desferal är ett sådant läkemedel. Referenser Internet http://www.fass.se/lif/product?1&usertype=0&nplid=19940923000023, 2014-02-11 Laborationshandledning, https://www.hu.liu.se/lakarprogr/t3/labbhandledning/1.538917/labt3- Cellskada2013.pdf 11

Litteratur Rang, Dale, Ritter, Flower, Henderson, Pharmacology, 2012, Elsevier Övrigt Föreläsning C ll Öll g, 2014-02-11 12