ALZHEIMERS SJUKDOM DIABETES TYP 3?

Institutionen för fysik, kemi och biologi Examensarbete kandidat Kemisk Biologi/C-uppsats ALZHEIMERS SJUKDOM DIABETES TYP 3? Molekylärfysiologiska länkar och samband från den samlade litteraturen Erik Nicklagård Examensarbetet utfört vid Linköpings Universitet sep/10 - jan/11 LITH-IFM-G-EX--10/2384 SE Linköpings Universitet, Institutionen för fysik, kemi och biologi. 581 83 Linköping

ALZHEIMERS SJUKDOM DIABETES TYP 3? Molekylärfysiologiska länkar och samband från den samlade litteraturen Författare: Erik Nicklagård 1 Handledare och examinator: Professor Per Hammarström 2 1. Kemisk Biologi, Protein Science, Institutionen för Kemi & Biologi, IFM, Linköping 2. Institutionen för Kemi & Biologi, IFM, Linköpings Universitet LITH-IFM-G-EX--10/2384 SE, Examensarbete kandidat Kemisk Biologi C-uppsats, Linköping 2011 Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste formen av demens och kännetecknas av intracellulärt neurofibrillärt trassel (NFT) bestående av proteinet tau och extracellulära plack, uppbyggda av peptiden amyloid beta (Aβ). En växande skara studier har börjat peka mot att AD är en hjärnspecifik typ av diabetes. Insulinresistens följt av hyperinsulinemi och hyperglykemi är kännetecken för diabetes mellitus typ 2 (DMT2) och har visat sig vara en riskfaktor för AD. Insulin, ett hormon som kontrollerar glukoshomeostasen i perifera nervsystemet (PNS) och är viktigt för minne och inlärning, transporteras över blod-hjärnbarriären i en mättnadsbar transportmekanism och dess koncentration i centrala nervsystemet (CNS) minskar vid DMT2 och AD. Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), ett neuronskyddande protein som minskar ogynnsam β-sekretasklyvning av amyloid precursor protein (APP) i amyloidkaskadhypotesen, minskar i koncentration i hjärnan när mycket insulin transporteras in i CNS. γ-sekretas ökar sin aktivitet på APP vid höga halter kolesterol som är vanligt vid DMT2, Aβ fungerar då som en negativ inhibitor till HMG-Coa reduktas (HMGR), enzymet som bildar kolesterol och kan därmed reglera kolesterolhalterna. Regleringssystem för Aβ i blod-hjärnbarriären (BBB) som p-gp, LRP-1 och RAGE rubbas vid DMT2. Aβ och insulin delar samma degraderingssystem, insulin degrading enzyme (IDE), som reglerar halterna Aβ och insulin. Dessutom har Aβ oligomerer visat sig kunna bryta ned insulinreceptorer (IR). Vidare har läkemedel mot diabetes visat sig lindra demens hos AD patienter. I den här rapporten gås de molekylärfysiologiska sambanden igenom i detalj. Slutligen finns det fog för ett samband mellan metabolt syndrom, en riskfaktor för DMT2, och AD.

INNEHÅLLSFÖRTECKNING FÖRKORTNINGAR... 1 INLEDNING... 3 ALZHEIMERS SJUKDOM... 3 Symtom... 3 Plack och neurofibrillärt trassel... 4 APP... 4 Apolipoprotein E... 5 AD Diabetes typ 3?... 5 DIABETES MELLITUS TYP 2... 5 Typ 2 diabetes vanligt hos AD-patienter.... 6 INSULINS/IGF-1:s ROLL I HJÄRNAN... 6 För höga halter insulin i CNS... 8 INSULINRECEPTORER... 9 Insulinreceptorer känsliga för ADDLs... 9 En ond cirkel uppstår?... 10 INSULINS/IGF-1:s BETYDELSE FÖR APP KLYVNING... 10 α-sekretas... 10 β-sekretas... 10 CREB... 11 RENSNING AV Aβ FRÅN CNS... 12 P-GLYKOPROTEIN... 12 RAGE... 12 LRP-1... 13 DEGRADERINGEN MED IDE... 14 DYSLIPIDEMI RISKFAKTOR... 15 LÄKEMEDEL MOT DIABETES HJÄLPER AD PATIENTER... 16 HYPOTETISKT FÖRLOPP FÖR AD DIABETES TYP 3 (Fig. 23)... 17 Hur uppstår insulinresistens i CNS?... 18 DISKUSSION... 19 TACK TILL... 20 REFERENSER:... 20

1

FÖRKORTNINGAR α2m = Alpha-2 macroglobulin Aβ = Amyloid beta peptid AD = Alzheimers sjukdom (Alzheimer s disease) ADDLs = Amyloid-beta derived diffusible ligands AGE = Advanced glycation end products AMPK = AMP aktiverat proteinkinas APP = Amyloid precursor protein ApoE = Apolipoprotein E Asp = Aspartat/Asparginsyra BBB = Blod-hjärnbarriären CREB = camp response element-binding protein CDK5 = Cyclin-dependent kinase 5 CNS = Centrala nervsystemet CSV = Cerebralspinalvätska DMT1 = Diabetes Mellitus typ 1 DMT2 = Diabetes Mellitus typ 2 ER = Endoplasmatiska retikulumet FPG = Fasting plasma glucose GABA = Gammaaminobutyratsyra (γ-aminobutyric acid) Glycer-AGE = Glyceraldehyd Advanced Glycation End Products GS = Glykogensyntas GSK = Glycogen synthase kinase HDL = High-density lipoprotein HMGR = Hydroxy-3-metylglutaryl-CoA reduktas HR = Hazard ratio IAPP = Islet of amyloid polypeptide IDE = Insulin degrading enzyme IGF-1 = Insulin-like growth factor 1 IGF-1R = Insulin-like growth factor 1 receptor IR = Insulinreceptor IRS = Insulinreceptorsubstrat kda = KiloDalton LDL = Low-density lipoprotein LRP-1 = Low density lipoprotein receptor-related protein 1 MCI = Mild kognitiv svikt (Mild cognitive impairment) NASH = Non-alcoholic steatohepatitis NDEA = N-Nitrosodietylamin NFT = Neurofibrillärt trassel P-GP = P-Glykoprotein PKB = Proteinkinas B PI3 = Fosfatidylinositol-3-kinas (Phosphoinositide 3-kinase) PNS = Perifera nervsystemet PPARγ = peroxisome proliferator-activated receptor gamma PS = Presenelin RAGE = Receptor for advanced glycation end products ROS = Reaktiva syreradikaler (Reactive oxygen species). SM = Sphingomyelin TNFα = Tumor necrosis factor alpha Ser = Serin Thr = Treonin (Threonine) 1

2

INLEDNING Metabolt syndrom, Alzheimers sjukdom (AD = Alzheimer s Disease) och diabetes typ 2 (DMT2) har de senaste åren ökat kraftigt i världen. Metabolt syndrom är ett samlingsnamn på riskfaktorer för att utveckla hjärt-kärlsjukdom och DMT2 med ett metabolt ursprung. Riskfaktorerna är fetma(centralt), försämrad blodfettsprofil, högt blodtryck och insulinresistens. I Storbritannien kostar demens samhället runt 17 miljoner pund varje år, eller ungefär 25 tusen pund per person och förekomsten av sjukdomen förväntas öka kraftigt (Fig. 2) 25. Att förstå riskfaktorer för AD och hur sjukdomen uppstår på ett fysiologiskt och molekylärt plan är därför av yttersta vikt för att kunna förebygga eller bota sjukdomen. Det har på senare år framkommit en mängd litteratur i ämnet som pekar mot att Alzheimer är en hjärnspecifik diabetes. Den här rapporten går igenom kopplingen med diabetes och dess biokemiska komplikationer som bland annat hyperglykemi, hyperinsulinemi och perifer insulinresistens. ALZHEIMERS SJUKDOM AD är den vanligaste formen av demens i västvärlden och förekomsten av den ökar accelerationsartat 3,40. Detta är bekymmersamt då AD är en mycket dyr sjukdom för samhället, i till exempel USA har den år 2000 räknats som det tredje dyraste sjukdomstillståndet efter hjärtsjukdom och cancer och är där den sjunde vanligaste dödsorsaken 24,40. Dödligheten i AD har också ökat procentuellt åren 2000-2006 jämfört med andra folksjukdomar där den minskat (Fig. 1). Figur 1. Beskrivning av dödligheten I AD jämt emot andra sjukdomar från Alzheimer's disease facts and figures av Alzheimer's Association, 2010 40. Y-axeln visar dödsorsak och X- axeln visar procentuell minskning eller ökning. Figur 2. Antalet personer med sporadisk AD i Storbritannien (yaxel) och det projicerade antalet fram till 2051 (x-axel), från Dementia UK The full report (Knapp, M., Prince, M. et al. 2007) 25 Symtom De första symtomen som uppstår när man drabbas är vanligtvis försämrat korttidsminne och degenereringen börjar förmodligen i hippocampus där minnen formas. Språket som formas i hypotalamus brukar vara nästa attribut som drabbas och det blir svårare att hitta rätt ord, detta följt av degenerering av frontallobens logiska del vilket påverkar planerings- och problemlösningsförmåga. Minskad aptit vilken styrs av hypotalamus gör att patienten under hela sjukdomsförloppet tappar kraftigt i vikt. Sedermera drabbas känslocentrat i limbiska systemet och humörsvängningar uppstår och tilltar varvid humöret blir allt svårare att kontrollera. Förnuft och vett minskar gradvis och till slut försvinner även långtidsminnet. Patienten minns då inte de mest fundamentala sakerna som till exempel sina nära och kära. Koordinationen blir sämre och slutligen har sjukdomsförloppet nått det stadiet där patienten inte längre kan ta hand om sig själv och är helt och hållet beroende av vård. Patienten dör för 3

det mesta cirka 7-8 år efter diagnos, inte sällan av en extern faktor som till exempel infektion. Plack och neurofibrillärt trassel Plack och neurofibrillärt trassel, NFT, är karaktäristiskt i AD-hjärnor 26. Amyloid beta (Aβ), en peptid på 40-42 (43) aminosyror som produceras genom hela livet, aggregerar och bildar extracellulära fibriller som placken består av 29. Aβ42 är mer aggregeringsbenäget än den kortare varianten på 40 aa på grund av sin mer hydrofoba c-terminal. Placken består av fibriller där själva fibrillaxeln är uppbyggd av betasträngar med parallella betaflak som korsar varandra 4. Men det är förmodligen inte dessa karaktäristiska fibriller som utgör den toxiska formen utan de oligomerer, även kallade ADDLs (Abeta-derived diffusible ligands) som bildas från den monomera formen av Aβ42 27. Glenner och Wong var de första som isolerade Aβ i mitten av 80-talet, men placken upptäcktes av Alois Alzheimer redan 1906 142-143. ADDLs var länge ett in vitro fenomen men anses nu vara en orsak till skadorna som uppstår i hjärnan hos AD individer. I en studie av Dimitra et al. 2005, har man använt nanopartiklar för att detektera dessa förmodade AD patogener hos AD patienter i CSV 30. In vivo hos friska människor kan antagligen chaperonsystem förhindra att ADDLs uppstår i för stor utsträckning 31. Giftigheten av oligomererna ifrågasätts i en studie från 2009 av Hardy J, som menar att en fysiologisk roll för amyloiderna inte kan uteslutas 166. Hyperfosforylering av Tau, ett protein som stabiliserar mikrotubuli i nervceller, kan bilda NFT intracellulärt vilket är ett förlopp förknippat med AD 7. Bland annat kan mikroglia aktiveras vid oligomeriseringen av tau vilket leder till inflammation 163. NFT har länge ansetts vara en konsekvens av Aβ aggregeringen i amyloidkaskadhypotesen 6. Med amyloidkaskadhypotesen menar man kort sagt att mer Aβ bildas på grund av ökad β-sekretasklyvning av APP vilket leder till aggregering och skadliga oligomerer. En obalans mellan produktion och rensning som det initiala förloppet (mer om i nästa stycke). Problemet med denna hypotes, som också är den största av de som finns, är att man ofta inte tar hänsyn till att det många gånger är en mutation i APP som framkallat AD och ökade Aβ koncentrationer hos den modellorganism man undersöker. Nya studier tyder på att tau aggregering är det initiala förloppet 162-163. Dels på grund av att tau kan hyperfosforyleras vilket kan aktivera mikrogliaceller som leder till kraftiga inflammatoriska signaler. Men även på grund av en klyvning av caspas 3 vid Asp421 på tau. Detta kan också leda till aggregering. Förmodligen ger klyvningen ett nukleerings-center vilket kan öka risken för aggregering av proteinet 162. Själva klyvningen orsakas av hyperglykemi. APP Aβ bildas från Amyloid precursor protein (APP), ett 695, 751, eller 770 aminosyror stort intracellulärt protein som klipps av tre särskilda sekretaser, α, β och γ 8. Man vet att fyra gener är sammankopplade till AD vilket också ger genetisk evidens för Aβs roll i AD 32. Två presenelin(ps)mutationer som påverkar γ-sekretasklyvning och vilka är de valigaste i familjär AD. Dessa mutationer leder till ökat Aβ42/40 ratio. Ett flertal mutationer (ett 20-tal) har hittats i APP, både i och utanför Aβregionen som kan leda till antingen mer Aβ42 (som med sin mer hydrofobiska karaktär har större benägenhet att självassociera) men mindre Aβ40, eller ökad produktion av både Aβ40-42. Till sist apoe4 allelen som är en av de största riskfaktorerna för AD tillsammans med åldrande 36-37,40. Upp emot 50 % av AD patienter bär på apoe4 allelen 37. 1-5 procent av Alzheimersfallen är familjära 37-39, de familjära fallen är autosomalt dominanta och beror på punktmutationer i antingen APP-, PSIeller II-genenerna 37. Resten, 95-99 procent, är sporadiska fall och presenterar symptom vid ungefär 65 års ålder eller äldre. Den troliga siffran familjära fall är förmodligen mindre än så. Färre än 0,1 procent är nog mer likt sanningen då det bara är cirka 2000 familjer i världen som bär på mutationerna 165. 4

Apolipoprotein E Apolipoprotein E (ApoE) är 34 kda stort kolesterol- och triglyceridbärande protein som finns både i hjärnan och i serum. Tre olika alleler finns för detta protein; ε2, ε3 och ε4, där ε4 är en riskfaktor för AD och ε3 har en skyddande effekt (Tab. 1). Expression av Apoε4 har visat sig kunna öka depositionen av Aβ och hyperfosofrylering av tau 33-35. Om man har dubbel uppsättning ε4 ökar risken för AD med ungefär 12 gånger. Apoε4 har med arg-arg vid pos 112 och 158 inte möjlighet att bilda disulfidmedierad multimerisering som ε2 och ε3, vilket tros vara en anledning till den ökade risken för AD med ε4, dock är det oklart varför. För 500 000 år sedan hade förmodligen alla människor ApoE4 allelen. En siffra som evolutionen idag har fått ner till runt en fjärdedel. Detta har utvecklat våra hjärnor som till stor del består av kolesterol, vilket ApoE transporterar. Förmodligen som ett resultat av ökade kolesterolhalter i kroppen. Ungefär hälften av de individer som drabbas av AD har minst en ε4 allel. ApoE kan mediera rensning av Aβ från centrala nervsystemet (CNS) över blod-hjärnbarriären (BBB) till perifera nervsystemet (PNS) med hjälp av LDL receptor-related protein 1 (LRP-1) 144. Denna rensning över BBB till det perifera leder till degradering av Aβ i lever och njurar. ApoE verkar också vara nödvändigt för att astrocyter ska kunna binda och internalisera Aβ lagringar för nedbrytning in vitro 1. Allel Sidokedja 112 Sidokedja 158 ε2 Cys Cys ε3 Cys Arg ε4 Arg Arg Tabell 1. ApoEs olika isoformer beroende på sidokedjedja 112 och 158 där ε4 är en riskfaktor för AD. AD Diabetes typ 3? Ny evidens pekar mot att det finns ett samband mellan AD och diabetes, att AD kan vara en form av insulinresistens i hjärnan 41-47. Många av de vanligaste kännetecknen i fetma och DMT2; hyperglykemi, hyperinsulinemi och hyperkolesterolemi har visat sig vara en riskfaktor för AD 9,28. Dessa faktorer bidrar till dyslipidemi (hög halt små täta LDL partiklar och lågt HDL kolesterol, samt höga triglycerid-koncentrationer i serum), något som är förknippat med högre risk för progression av AD 133-134. Är Alzheimers sjukdom diabetes mellitus typ 3? DIABETES MELLITUS TYP 2 Cirka 285 miljoner människor i världen bedöms lida av diabetes (typ 1 och 2) idag (Fig. 3), en siffra som beräknas stiga till ungefär 439 miljoner år 2030 49. På bara de tre senaste åren har DM ökat med 40 miljoner 49. Blindhet, amputationer, cancer, hjärtsjukdom och förtida död är några konsekvenser vid diabetes på grund av de komplikationer som kan uppstå 10-13. Figur 3. Förekomst av diabetes i världen år 2000 i miljoner och det uppskattade antalet 2030 (från Hossain P et al. 109 ). DMT2 yttrar sig i form av kronisk hyperglykemi på grund av insulinresistens i det perifera nervsystemet, såsom lever- muskel- och fettceller, samt förlust av betaceller i bukspottskörteln 50-52. Diagnosen för DMT2 bekräftas vanligtvis av hyperinsulinemi med hyperglykemi och insulinresistens med betacellsförlust som är centralt för sjukdomen. Islet Amyloid Polypeptide (IAPP) även kallad amylin, är ett protein upptäckt av Westermark et al. 1987 51, som utsöndras tillsammans med insulin i ett molratio (IAPP:Insulin) på ungefär 1:100 53. Risken för självaggregering av IAPP blir större när mer insulin måste utsöndras för att kompensera för hyperglykemi samt 5

insulinresistens och aggregaten tros kunna vara skadliga för betacellerna 52. En molekylär trafikstockning kan då inträffa som gör att bukspottskörteln får svårare att få fram insulin samtidigt som betacellsförlust uppstår (Fig. 4). Upp till 80 % av betacellsfunktionen kan ha gått förlorad när man får diagnosen 50. individerna hade signifikant högre koncentration av IAPP än sina respektive kontroller. Figur 4. Betaceller i Langerska öar inkuberade med a) mänskligt IAPP aggregat vilket lett till betacellsförlust i bukspottskörteln och b) kontroll, utan IAPP aggregat. Båda bilderna är detekterade med konfokalmikroskop, (Ritzel 2007 23 ). Typ 2 diabetes vanligt hos ADpatienter. Det finns en ökad risk för mild kognitiv svikt (MCI = Mild cognitive impairment) eller demens hos patienter med DMT2 54,56,58. Vid MCI ses diffus plack men det är inte alltid detta leder till AD. Studier motsäger varandra till viss del vad det gäller ökad risk för AD hos DMT2 patienter, men de flesta studier pekar på en ökad risk för AD vid DMT2 92-95,104. Bland dessa en svensk studie från 2008 som pekade på att det fanns en ökad risk för AD om man hade diabetesliknande symptom i medelåldern 55. I en klinisk studie av Janson et al. 2004 visade man att AD patienter hade signifikant mer DMT2 och Impaired Fasting Glucose (IFG), än sina kontroller (Fig. 5) 57. Man visade också att Fasting Plasma Glucose (FPG), ökade snabbare hos AD patienter än hos icke AD patienter. Hos DMT2 patienter syntes ett samband mellan densiteten av diffus plack eller neuritisk plack i hjärnan och med hur länge man hade haft DMT2, men något signifikant samband med DMT2 och utveckla AD sågs inte. När samma forskargrupp jämförde mängden IAPP amyloider i en patologisk studie, syntes en klar skillnad mellan både AD versus icke AD och DMT2 kontra icke DMT2 (Fig. 5) 57. Både AD patienterna och DMT2 Figur 5. Från Janson et al 2004 57. Visar a) förekomst av DMT2 (t.v.) och IFG (t.h.) i AD-patienter och friska kontroller. b) fastevärde på glukos (y-axel) mot ålder (y-axel) hos ADpatienter vs friska kontroller. c) Frekvens av IAPP amyloider (yaxel) hos DMT2- och AD-patienter vs friska kontroller (x-axel). d) Omfattning av IAPP amyloider (y-axel) hos DMT2- och ADpatienter vs friska kontroller (x-axel). En spekulativ anledning till att det kan vara svårt att se högre prevalens av AD hos DMT2 patienter kan vara den ökade risken för hjärtsjukdom och cancer vid diabetes 10-13. Det vill säga patienterna dör innan de får AD. Denna slutsats dras bland annat i Hisayamastudien från 2010 9. I den studien som innefattade 135 obduktionsobjekt från södra Japan fastslog man att hyperglykemi, hyperinsulinemi och insulinresistens är riskfaktorer för AD. Andra menar att DMT2 i sig kanske inte är tillräckligt för att orsaka AD utan istället är en kofaktor i sjukdomsförloppet 46. INSULINS/IGF-1:s ROLL I HJÄRNAN Insulin och insulin-like growth factor 1 (IGF-1) är strukturellt relaterade proteiner som har en annorlunda roll i centrala nervsystemet än i det perifera. I det perifera nervsystemet sänker insulin blodsockret medan det i det centrala höjer det 59. Glukagon, ett konträrt hormon till insulin som produceras i bukspottskörtelns α- celler, höjer den perifera halten glukos när insulin sänkt det till runt fastevärdet 147. De båda 6

hormonerna reglerar på så sätt kroppens blodsockerhomeostas. Glukoshomeostasen i hjärnan är av yttersta vikt och insulinsignalering har stor betydelse för energimetabolismen i form av ATP produktion. Däremot är det oklart om glukosupptaget regleras med insulin hos nervceller (som i muskelceller) (Fig. 7 & 8), eller om de eventuellt är mer beroende av en jämviktsreglering av ATP och GLUT8 transportörer 158. Hos AD-patienter minskar blodflödet av glukos och det celebrala glukosanvändandet kan reduceras med 45 % och i de senare stadierna med 65 % 46. Figur 8. I en nervcell reglerar förmodligen inte insulin glukosmetabolismen i samma utsträckning som i en muskelcell, utan GLUT8 migrerar till cellytan på grund av jämviktsreglering av ATP. GSK3β hålls mindre aktiv med en indirekt signalering av insulinreceptorerna. Om GSK3β är för aktivt riskerar tau att förlora sitt posttranslationella jämviktsläge och hyperfosforyleras. Detta kan minska stabiliteten på mikrotubuli eller leda till aggregering av tau. Bild ursprungligen av Sakamoto 112, modifierad av författaren. Insulin har visat sig viktigt för minne, inlärning och normal kognitiv funtion 21,44. Oberoende av de perifera glukosnivåerna så kan en tillfällig ökning av insulin kan ha en kognitivt ökande effekt 61-62. Detta beror förmodligen på att koncentrationerna av neurotransmittorer som acetylkolin, noradrenalin, och dopamin i CNS kan regleras av insulin 63-64, samt att gammaaminosmörsyra (GABA = gammaaminobutyric acid) och glutamat receptorer inhiberas 21. Acetylkolin, noradrenalin, och dopamin har kognitiv betydelse, till exempel vid experiment på möss har man sett en alternering av insulinreceptorexpression då inlärning sker 65.* *= Dessa slutsatser (ref 61-65) finns mer utförligt sammanfattade i Neumann et al. 2008 41. Figur 7. Schematisk bild av Sakamoto 112 över insulinsignaleringen i en muskelcell. Insulin binder till sin receptor som fosforyleras och aktiverar bland annat insulinreceptorsubstrat (IRS). IRS aktiveringen leder till PI3K/Akt signalering vilket inaktiverar GSK3β och förhindrar således hyperfosforylering av tau. Vidare kan glykogensyntas (GS) katalysera glukos-6-fosfat, ursprungligen glukos, till glykogen. Akt aktivering krävs för att den insulinkänsliga glukostransportören GLUT4 ska kunna släppa in glukos i cellen. Vid insulinresistens är denna funktion nedsatt. I en nervcell reglerar förmodligen inte insulin glukosmetabolismen i samma utsträckning, utan GLUT8 migrerar till cellytan på grund av jämviktsreglering av ATP. Insulin bildas i bukspottskörteln medan IGF-1 bildas i levern. Bevis finns för att insulin produceras i det centrala nervsystemet, men mycket tyder på att det mesta insulinet kommer ifrån det perifera nervsystemet, det vill säga från bukspottkörtelns produktion 59,80-81. Både insulin och IGF-1 binder till insulin- och IGF-1- receptorer som tillhör familjen tyrosinkinasreceptorer. IGF-1 har skyddande effekter på neuroner och bildas i högre grad i hjärnan än insulin 82. Till skillnad från insulin så ökar transporten av IGF-1 över BBB vid höga halter perifert 59-60. Höga perifera halter insulin däremot minskar transporten i en mättnadsbar transportmekanism 14-16,59. Perifer insulinresistens kan leda till tillfälliga stadier av hyperinsulinemi för att överbrygga hyperglykemi, detta minskar transporten av insulin in till hjärnan till i princip noll på grund av att insulinnivåerna i CNS ökat 59. Vid DMT2 ökar transporten men vid AD så minskar den, detta stämmer överens med den minskning av cerebralspinalvätska (CSV)-/plasmainsulin- 7

koncentration ratio som setts i både obduktionsstudier och hos levande ADpatienter 59. Ratiot minskar också ju längre sjukdomsförloppet fortgår 84. Kronisk hyperinsulinemi utan hyperglykemi, vilket är ett prediabetiskt stadie, kommer i slutänden leda till minskade koncentrationer insulin i CNS på grund av mättnadssystemet i BBB 83. För höga halter insulin i CNS Även om insulin är viktigt för neural överlevnad i hjärnan så är för höga nivåer i CNS neurotoxiskt och höga nivåer perifert korrelerar med höga nivåer i CNS 41. Hyperfosforylering av tau, som kan leda till NFT ökar signifikant i CNS på möss då de behandlas med höga eller låga doser insulin. I en studie av Freude et al 2005, kunde man 10 min efter injektionen av insulin se en tydlig fosforylering av ser202 i tau i CNS 17. Ser202 kunde fosforyleras indirekt av insulin genom Akt-, Erk-2-vägen (Fig. 8). Andra in vitro studier har visat att Erk-2 kan fosforylera tau 18-19. Vid samma behandling på NIRKO-möss där de neurala insulinreceptorerna slagits ut såg man ingen fosforylering av tau 17. Nedströmssignaler av Akt, Erk-2 och GSK3β (GSK = glycogen synthase kinase) aktivering kunde alltså inte ske utan insulinreceptor. Det fanns en korrelation mellan de perifera insulinnivåerna och fosforylerat tau vid ser202. Studien visade även att den mesta insulinsignaleringen skedde i hippocampus och hypotalamus där signaleringen mest ägde rum i neuroner, inte gliaceller. Ingen fosforylering av thr231 kunde påvisas i studien (Fig. 9). Detta kan bero på att insulin i sig kan stimulera insulinreceptorn som med signalvägarna PI3K och PKB kan fosforylera ser9 på GSK3β (Fig. 8) 75-76. GSK3β är neurospecifik och har apoptotiska egenskaper hos neuroner då den aktiveras, men skyddande effekter då den är inaktiverad. Vid fosforylering av ser9 är GSK3β inaktiverad och kan således inte aktivera tau 74. Figur 9. Fosforyleringssites på tau med korresponderande antikroppar, från Freude et al. 2005 17. Insulinet ledde till fosforylering av ser202 men som väntat inte thr231. Hyperfosforylering av ser202 på tau, något som kan leda till NFT, är en tänkbar möjlighet vid höga insulinnivåer i serum som vid DMT2. Minskad fosforylering av tau på ser202 sker med diabetetsläkemedel som Troglitazon 66-67, Troglitazon uppreglerar PPARγ-genen (PPAR = peroxisome proliferator-activated receptors). PPARγ migrerar till DNA i cellkärnan, och aktiverar bland annat transkription av insulinreceptorer när den blir aktiverad av en agonist. Troglitazon gav signifikant minskad fosforylering av tau vid ser202 och ser396/404. Dessa aminosyror i tau vet man brukar vara fosforylerade vid AD och andra neurodegenerativa sjukdomar 5. Uppreglering av PPARγ har även visat sig ha en Aβ-rensande effekt, men mekanismerna bakom denna rensning är inte helt klarlagda. En del teorier som ökad enzymaktivitet för att bryta ner Aβ har lagts fram 68. En intressant notis är att curcumin, det ämne i gurkmeja som indier hävdar är anledningen till deras låga förekomst av AD, är en förmodad agonist till PPARγ och tros kunna minska Aβ depositioner i astrocyter 69. Andra förklaringar till curcumins effekt, som att ämnet direkt hindrar Aβ fibrillbildning, kan förmodligen tyckas mer träffande 70. Hyperinsulinemi, ett kännetecken vid fetma och DMT2, är enligt flera studier en riskfaktor för både neuritiska plack och AD 9,28. Den neuroskyddande effekten av Insulin/IGF-1 kommer från aktivering av tyrosin kinaser som fosforylerar insulinreceptorsubstratproteiner (IRS) 45,71. IRS stimulerar glukostransport genom fosfatidylinositol-3 (PI3) och aktivering av Proteinkinas B (PKB), även kallad akt. PKB 8

inhiberar glukokortikoidinducerad apoptos genom inaktivering av GSK3β 72-74 *. Vidare så skyddar PKB även neuroner mot toxininducerad död och skyddar PC12 celler mot Aβ inducerad död 77-79 *. För höga halter av perifert insulin, det vill säga hyperinsulinemi kan ge en minskande transport av IGF-1 över BBB vilket skulle kunna leda till en minskning av IGF-1s skyddande effekt 60. *= Dessa slutsatser (ref 72-73, 77-79 ) finns även mer utförligt sammanfattande i de la Monte 2009 46 resp. Neumann et al. 2008 41. Luchsinger et al. visade i en studie från att hyperinsulinemi gav ökad risk för AD och minnesförsämringar (Fig. 10) 28. aktiverar olika signaler i cellen, till exempel extracellulärt glukosupptag. I PNS kan nedsatt IR funktion leda till fetma, högt blodtryck och DMT2 131, men i CNS verkar inte IR ha någon funktion för att reglera glukoshalten utan förmedlar istället signaler för minne och inlärning 21,65. Insulinreceptorer känsliga för ADDLs Zhao et al. visade i en studie från 2008 en slående minskning av denditriska insulinreceptorer vid exponering av ADDLs på hippocampusneuroner in vitro (Fig. 11) 42. Dessutom såg man en minskad kapacitet för IR tyrosin autofosforylering, något som är förknippat med insulinresistens. PKB är ett enzym specifikt för ser-/thr-fosforylering nedströms från insulinreceptorn med reglerande PI3K aktivitet. ADDLs inducerade fosforylering av ser473 på PKB vilket gav en negativ feedback loop då det hämmade aktiviteten av insulinreceptorerna. Detta är ett förlopp som är känt från andra insulinresistenssjukdomar till exempel Nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Figur 10. Hyperinsulinemi och den ökade risken för AD eller minnesförsämringar, från Luchsinger et al. 2004 28. Y-axeln visar relativa risken (HR = Hazard ratio) för AD mot insulinkvartil på x- axeln. Ju mer insulin, ju högre risk för AD. INSULINRECEPTORER Insulinreceptorer (IR) har hittats överallt i hjärnan, både i gliaceller och i neuroner. Högst koncentration av IR bindning till insulin har setts i hippocampus, hypotalamus, cerebrala kortex och cerebellum 44. IR tillhör familjen tyrosinkinasreceptorer och består av två alfasubenheter (IRα) och två betasubenheter (IRβ). Insulin reglerar sin effekt genom receptorn som fosforylerar proteiner intracellulärt när insulin binder in, vilket i sin tur Figur 11. Zhao et al 2007 42 visade hur man kvantifierat ADDL bindning och dess effekt på neurala insulinreceptorer. A) NU2 antikropp mot ADDL. B) Immunofärgning av alfasubenheten på insulinreceptorn. C) Sammanfogning av A & B. D) ADDLs toxiska inverkan på IRs. Kvantifieringsresultat från 50 olika bilder som togs fram med immunofluoroscens. Aktiverade IGF-1- och insulinreceptorer hos friska individer verkar kunna minska extracellulära koncentrationer av ADDLs med hjälp av insulin degrading enzyme (IDE). 9

Ett annat experiment av samma forskargrupp visade att insulinreceptorn kan trigga ADDL internalisering för nedbrytning till monomert Aβ, och att IGF-1 receptorn verkade genom att hålla kvar ADDLs på membranytan så att degradering av oligomererna kunde ske 22. Man behandlade en odödlig nervcelllinje som uttryckte både insulin- och IGF-1-receptorer med ADDLs. Både insulin- och IGF-1- receptorerna hade skyddande funktioner för synapser. När man istället transfekterade nervcellerna med insulin-receptorer från insulinresistenta patienter, ökade nivåerna av ADDLs och förvärrade deras aggregering. Dessa resistenta receptorer gav alltså inte någon skyddande effekt utan tillståndet förvärrades istället. En ond cirkel uppstår? Om det stämmer att ADDLs är skadliga för IR in vivo, skulle detta kunna vara en stark indikering till det fortsatta AD förloppet genom att en ond cirkel uppstår. Färre IR på grund av ADDLs skulle i princip leda till ännu mer Aβ sedermera ADDLs följt av färre IR. Det här skulle i så fall vara det yttersta beviset för att Alzheimers sjukdom är en typ av hjärnspecifik typ av diabetes. Hypotesen kan till viss del backas upp med det faktum att man i CHO celler från kinesiska hamstrar visat att Aβ kan, dels inhibera effekten av insulin för att producera lösligt AβPPα (vilket är viktigt för neural överlevnad), och dels kan blockera autofosforyleringen av insulinreceptorer (Fig. 12) 85. Figur 12. Aβs påverkan på insulinreceptorer från Ling et al. 2002 85 A) Effekten av insulin för utsöndringen av lösligt AβPP där ökande insulinkoncentrationer gav ökad utsöndring. B) Andel utsöndring av lösligt AβPP när överuttryckta insulinreceptorer behandlades med insulin eller i frånvaro av insulin, med Aβ1-40, Aβ40-1 eller dessa peptider i kombination med insulin. C) Autofosforyleringen av IRs där Aβ1-40 klart störde insulins effekt. Aβ40-1 (med motsatt sekvens) användes som kontroll. INSULINS/IGF-1:s BETYDELSE FÖR APP KLYVNING α-sekretas APP klyvs i normala fall av alfasekretas extracellulärt till ett stort lösligt AβPP fragment, AβPPα, vilket har neuroskyddande egenskaper 145-146. Den nya C-terminaldelen av APP, C83, klyvs sedan i transmembranregionen av γ- sekretas till två peptider, P3 och AICD. P3 sägs vara ofarlig men är mer aggregeringbenägen än Aβ och bildas också i högre grad (5-10 gånger mer P3 än Aβ bildas i en frisk människa). Någon fysiologisk roll för peptiden har emellertid inte hittats. α-sekretas klyvningssäte befinner sig inom Aβ domänen på APP och leder således inte till Aβ peptider. β-sekretas Fullängds APP kan även klyvas av β-sekretas (BACE = β site APP cleaving enzyme), ett membranprotein som när det klyver APP bildar ett längre C-terminalfragment än vid α- sekretasklyvningen. Ett 12 kda karboxylfragment, C99 som när det sedan klyvs av γ- 10

sekretas kan generera Aβ40-42. Detta är den så kallade patogena vägen mot AD (Fig. 13). BACE-1, till skillnad från BACE-2 och BACE-3, är det sekretas som har skadlig effekt. Att ett ökat uttryck av BACE-1 leder till större risk för AD är mer eller mindre accepterat idag. IGF-1 är som tidigare nämnts en viktig neurotrofisk faktor och minskar BACE-1s expresson i PC12 celler genom signalering via PI3K/Akt- och MAPK/ERK1/2-vägar 20. För låga halter IGF-1 i serum har visat sig öka Aβ koncentrationen i CNS hos möss, och låga halter av IGF-1 i serum är vanligt vid både övervikt och diabetes 110,127. Aβ och det lösliga AβPPα bildas alltså från två olika mekanismvägar. Det har visat sig viktigt för neural överlevnad att lösligt AβPPα frisläpps. I SH-SY5Y celler har man visat att insulin höjer koncentrationen av lösligt AβPPα samtidigt som ackumuleringen av intracellulärt Aβ minskar. Eventuellt kan kronisk hyperinsulinemi, som i längden leder till en minskning av CNS insulin, hämma denna skyddande effekt. Figur 13. Illustration från Kojro & Postina 2009 som beskriver skillnaden mellan α-sekretas och BACE-1 klyvning 2. BACE-1 klyvning kan leda till den patogena utvecklingen av AD eftersom ett C99 fragment bildas som kan klyvas till Aβ40-42. Med α sekretasklyvning är inte detta möjligt då ett C83 fragment bildas som förhindrar att γ-sekretas klipper aggregeringsbenäget Aβ40-42. α-sekretas har högre affinitet för APP än BACE-1 men i vissa mutationer som den svenska (K670N/M671L i APP) kan BACE-1 istället få högre affinitet. CREB En annan intressant iakttagelse är att camp response element-binding protein (CREB), i en studie av Qi et al, 2009 har visat sig kunna ge perifer insulinresistens hos möss 151. CREB är en transkriptionsfaktor som hjälper till att höja blodsockret vid fasta genom att minska glukosupptaget när kroppen går över till fettförbränning. I studien blev risken för insulinresistens större om mössen var fetare än normalviktiga vilket berodde på att proteinet var mer aktivt då, även när mössen inte fastade. Detta ledde till sämre glukosupptag och sedermera insulinresistens. I både PNS och CNS är det katekolaminer som styr uttrycket av CREB 151. Hos AD patienter är koncentrationerna av katekolaminer som noradrenalin, adrenalin och dopamin minskade i korrelation med den kognitiva störningen 152. I PNS mobiliseras triglycerider för fettförbränning samtidigt som GLUT4 transportörernas uttryck minskar och i CNS är proteinet viktigt för minnesbildning och neural plasticitet. Vid diabetes är proteinet uttryckt i högre grad och bidrar på så sätt till hyperglykemi och hyperinsulinemi. BACE-1 genen som kodar för β-sekretas har flera potentiella promotorsekvenser där CREB kan binda in för transkription 153. Om CREB är mer aktiverat som vid DMT2, bör uttrycket av BACE-1 potentiellt kunna ökas. Aβ42, den längre varianten av amyloidpeptiderna, kan inaktivera CREB. Hypotetiskt skulle alltså mer aktiverat CREB kunna leda till högre koncentrationer Aβ42. Det har i en opublicerad studie från Karolinska Institutet, föreslagits att CREB fosforyleringen ökar då de intracellulära kalciumkoncentrationerna blir för höga. Detta som en konsekvens av ökad inbindning av Aβ oligomerer till α-7 nikotinreceptorerna. De mekanismvägar som förklarar detta inkluderar även PI3K. Ett protein inblandat i mekanismvägen för autofosforylering av insulinreceptorn. Vid skadade nervceller har man sett att CREB är mättat med fosforyleringar medan friska nervceller har ett jämviktsläge av posttranslationella modifieringar. Dessutom är uttrycket av glukostransportörer nedreglerat i AD 164. 11

RENSNING AV Aβ FRÅN CNS Rensningen av Aβ från CNS sker i diverse olika steg. Några huvudkomponenter i BBB är p- glykoprotein (p-gp), receptor for advanced glycation end products (RAGE) och low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP-1). Nedbrytningen i CNS sker primärt med två enzymer, insulin degrading enzyme (IDE) och neprilysin (NEP). ApoE och alfa-2- makroglobulin (α2m) fungerar som chaperoner för att transportera ut Aβ ur BBB (Fig.14). RAGE RAGE har visat sig vara en receptor för transport av Aβ över BBB till CNS (men ej åt andra hållet) 88. RAGE uttrycks bland annat i endotelceller som i BBB och i neuroner. När receptorn i ett in vitro experiment aktiverades med olika kompetitiva metoder så ökade transporten av både Aβ1-40 & 1-42 över BBB in till CNS 90 (Fig. 15). Både vid AD och DMT2 ökar uttrycket av RAGE i neuroner och gliaceller 91. Hyperstimulering av RAGE på grund av ökade halter av advanced glycation of end-products (AGE) eller Aβ kan leda till cellinducerad död 98. Lokala ackumulationer av AGEs som i till exempel DMT2 kan leda till oxidativ stress och minskad BBB funktion. Hyperglykemi som är ett typiskt kännetecken hos DMT2 individer, har visat sig uppreglera RAGE i gliaceller in vivo och inducera inflammation 96. Det beror sannolikt på den ökade koncentrationen AGEs som ses vid hyperglykemi hos DMT2 patienter 96. Figur 14. Schematisk bild som visar Aβ inströmningen till CNS från PNS med assistans av RAGE och dess transport med clusterin till mikroglia för nedbrytning. P-GP hindrar gifter och andra skadliga ämnen från att transporteras in i CNS. LRP-1 ansvarar för utströmningen av Aβ till lever och njurar för degradering och hjälps av transportproteinerna α2m och ApoE. NEP och IDE är enzymer som bryter ner monomert Aβ. NEP kan även bryta ner dimerer och trimerer av Aβ. Bild modifierad av författaren, ursprungligen från Zlokovic & Frangione, 2003 86 Den tidigare nämnda risken för AD vid hyperglykemi, skulle kunna bero på att AGEs binder till sin receptor och uppreglerar β sekretasklyvning av APP, en klyvning associerad med det patogena sjukdomsförloppet i AD.* *=Detta förklaras mer ingående av Guglielmotto M. et al. 2010 97. P-GLYKOPROTEIN P-GP, ett 170 kda stort glykoprotein, är ett ATP bindande kassettransportörprotein som begränsar transporten av Aβ över BBB in till hjärnan 88. Proteinet är också viktigt för att förhindra toxifiering av CNS och kan ses som ett naturligt detoxifiseringssystem i BBB 89. När uttrycket av p-gp minskar i BBB, vilket det har visat sig göra i diabetesinducerade möss, kan dysfunktion i CNS uppstå. Insulinterapi i diabetesmössen visade sig ha en viktig roll för att uppreglera P-GP 87. Detta förhindrar att mer Aβ tar sig in i CNS. Det är alltså viktigt att ha en korrekt nivå av insulin i CNS för att bevara BBBs funktion. Figur 15. Från Yan et al. 1997 som visar ökad kärlexpression av RAGE i DMT2 (t.v.) vs normal expression i äldre friska kontroller (t.h.) 90. 12

Fruktos och glukos pekas ut som orsaker för den ökande bildningen glyceraldehyd-derived AGEs (Glycer-AGE), som är en toxisk variant av AGEs, i en studie av Takeuchi & Yamagishi från 2009 161. Författarna visade att glycer-age koncentrationer, som är förhöjda hos DMT2 patienter, kunde inducera apoptos hos nervceller och att den neurotoxiska effekten av DMT2 serum kunde hindras med antikroppar mot just glycer-age. Inbindning av glycer-ages hos RAGE kan leda till reaktiva syreradikaler (ROS) (Fig. 16). För att glycer-ages ska bildas behövs glukos eller fruktos. Vid höga halter glukos använder sig kroppen av polyolvägen och bildar sorbitol och sedermera fruktos. Polyolvägen är starkt förknippat med skador på kapillärer och ger även en högre halt glycer-age. ApoE och α2m 100. Både ApoE och α2m levererar Aβ till LRP-1. In en studie av Hong et al. 2009 visade man att den här utrensaren av Aβ nedreglerades signifikativt i streptozotocininducerade diabetiska möss 99. Den LRP-1 medierade Aβ transporten ut ur CNS minskade inte de första veckorna men efter 6 veckor kunde en tydlig skillnad i Aβ rensning ses (Fig. 17). Man vet att IR och LRP-1 interagerar med varandra så möjligtvis regleras rensningen med insulin 101. Detta föreslås också i en studie av Tamaki et al från 2007, där man visar att plasmainsulin ansvarar för rensning av både lipider och Aβ i levern genom intracellulär translokalisering till plasmamembranet, där LRP-1 kan reglera hepatiskt upptag med cirkulerande blod 160. IR signaleringen med IRS och PI3 leder till själva translokaliseringen av LRP-1 och denna funktion blir nedsatt vid insulinresistens vilket på så sätt kan leda till ackumulering av Aβ. Figur 16. Takeuchi & Yamagishi från 2008 161. Fruktos och glukos ger glyceraldehyd som leder till högre koncentration glycer- AGEs. Dessa kan aktivera RAGE som ger ett ökat uttryck av reaktiva syreradikaler (ROS). ROS är starkt inflammatoriska. Sorbitol bildas från glukos genom polyolvägen vid DMT2 och ger höga halter fruktos, dessa kan även komma från fruktdrycker. LRP-1 Low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP-1), ett protein kodat av LRP-1 genen är ansvarigt för rensning av Aβ från CNS. LRP-1 transporterar Aβ genom BBB ut i serum för degradering i lever och njurar. Proteinet består delvis av en lätt β-kedja som är lokaliserad i cytoplasman. Genom membranet på cellerna kopplas β-kedjan ihop med en extracellulär α- kedja. α-kedjan består av fyra domäner som innehåller ett cysteinrikt, ligandbindande kluster. Dessa kan binda in bland annat Aβ levererade av kolesterolliknande transportmolekyler som Figur 17. 125 I-Abeta40-rensning i streptozotocininducerade diabetesmöss från Hong et al 2009 99. A) N t/n 0 är halten kvarvarande radioaktivitet I hjärnan (x100 för att räkna ut procenten) på y-axeln mot antal veckor på x-axeln. Plasmanivåerna av [C14]inulin (en referensmarkör) är markerade som vita staplar och Aβ som svarta. B) Plasmakoncentration av Aβ efter 1-6 veckor. C) Expressionen av 13

LRP1 i cerebrala kapillärer efter 1-6 veckor, bestämda med immunoblot. DEGRADERINGEN MED IDE Aβ och insulin delar samma degraderingssystem, insulin degrading enzyme (IDE) (Fig. 18). Enzymet är ett metalloendopeptidas som degraderar aggregeringsbenägna monomerer som Aβ och insulin. IDE uttrycks överallt i kroppen och håller på så sätt nere nivåerna av insulin i blodet, den högsta expressionen av IDE ses i lever, testiklar, muskler och hjärna. När insulin och Aβ internaliseras kan IDE bryta ner sina substrat i peroxisomer eller i cytoplasman. I CSV och på cellytor har man också lokaliserat IDE, vilket tyder på att IDE har en funktion extracellulärt under fysiologiska förhållanden. Figur 18. Från Shen et al. 2006 103. Tertiärstrukturen av IDE med sina fyra subenheter. Den lila pricken visar zinkjon som är nödvändig för enzymatisk aktivitet. Orange färg visar insulins betadomän. Den katalytiska mekanismen efter vilken Aβ/insulin bryts ned av IDE har av Bora et al. 2010 föreslagits vara uppdelad i tre steg: 1. En zinkbunden vattenmolekyl aktiveras (Fig. 19). 2. En gem-diol intermediär bildas. 3. Klyvning av peptidbindning sker varav Lys28-Gly29 är det mest effektiva klyvningssätet på Aβ 102. Figur 19. Aktiva ytan på IDE, glu189, his108 och his112 som tillsammans med en zinkatom aktiverar en vattenmolekyl för att bilda en gem-diol intermediär 102. Vid knockout av IDE genen på möss har man sett en ökning av endogent Aβ i hjärnan, och när man överuttrycker IDE så minskar koncentrationen Aβ 107. Dessutom, efter att ha deleterat IDE genen uppstod hyperinsulinemi och glukosintolerans, vanliga kännetecken för DMT2 107. IDE reglerar halterna av insulin samt Aβ och en viss minskning av Aβ degradering sker ju äldre man blir 107,108. Vid AD är IDE kraftigt nedreglerat och har man APOE4 allelen kommer detta bidra till nedregleringen 106. IDE är negativt reglerat av insulin, höga halter insulin leder till minskade koncentrationer IDE. När cellen delar på sig på grund av en tillväxtfaktor som insulin utsöndras inte längre IDE. Sekretionen av IDE sker i hjärnan, primärt från mikrogliaceller och degraderar alltså Aβ extracellulärt. Enligt föreslagna hypoteser kan IDE inte bryta ner Aβ om för mycket insulin finns närvarande, detta på grund av ett kompetitivt förhållande substaten emellan, där insulin har högre affinitet för IDE än Aβ (Fig. 20a) 105. Detta skulle då leda till högre halter Aβ i hjärnan och ökad risk för ADDLs, något som är förenat med lokal ackumulering av kalcium, ökad cyclin-dependent kinase 5 (CDK5) aktivitet och hyperfosforylering av tau 128. Sporadisk AD i avsaknad av ApoE4 allelen kan orsakas av variationer i intronerna och kringliggande sekvenser i IDE genen (Fig.20b). 14

bildandet av Aβ40-42 peptider. Aβ aggregat kan binda kolesterol och koncentrationen kolesterol i hjärnan ökar i början av sjukdomen. Kolesterolet i hjärnan transporteras av highdensity lipoprotein (HDL) som frisläpps av ApoE i neuroner. Till skillnad från serum så transporteras inte kolesterol av low-density lipoprotein (LDL) utan bara av HDL. Figur 20. Förslagen mekanism av Qui et al. Där A) Hyperinsulinemi leder till ökad bindning till IDE och minskad bindning av Aβ till IDE 105. För lite IDE finns tillgängligt för att bryta ner Aβ B) Eller alternativt att en genvariant gör att IDE får minskad enzymaktivitet. Ovanstående teorier har ett hål, nämligen att man bortser från att Aβ kan tävla med insulin om IR 148. Detta leder till mindre autofosforylering av IR och då mindre tyrosin kinasaktivitet, vilket borde öka halterna IDE. Det motsatta händer i AD, där man istället ser en minskad koncentration insulin i CNS och ett minskat uttryck av IDE. DYSLIPIDEMI RISKFAKTOR Hyperkolesterolemi är en riskfaktor för både DMT2 och AD. Dock är de biokemiska sambanden fortfarande inte helt utredda. Hjärnan är beroende av kolesterol och cirka 25 % av kroppens totala kolesterolmängd finns där. Kolesterol är viktigt för att bygga upp cellmembran och behålla neuroners vitalitet 138. CNS producerar det mesta kolesterolet självt men en liten perifer tillgång finns ändå. Nyckelenzymet för kolesterolsyntes är ett membranprotein i endoplasmatiska retikulumet (ER), 3-hydroxy-3-metylglutaryl-CoA reduktas (HMGR), som med sitt hastighetsbestämmande steg reglerar kolesterolhomeostasen 139. Vid höga halter kolesterol minskar syntesen av mevalonat, som sedermera kan katalyseras till kolesterol, och vid låga halter kolsterol ökar den. Höga halter kolesterol är förknippat med ökad γ- sekretasaktivitet, vilket ger en ökad risk för I hjärnan blir överskott av kolesterol till 24Shydroxykolesterol (24SHC), en oxysterol som kan penetrera BBB 149. En viss, men liten korrelation mellan 24SHC koncentrationerna i serum och de i CSV finns. Speciellt i början på AD förloppet då en ökning av 24SHC i serum kan ses 149. Ju äldre man blir ju mer ökar syntesen av 24SHC vilket minskar syntesen av kolesterol, något som är förknippat med minskad formbarhet för neuronens membran och ökad tau fosforylering 150. Astrocyter producerar ApoE och dess isoformer har olika förmåga till frisättning av kolesterolbärande HDL partiklar; ε2>ε3>ε4 (och tvärtom för LDL i serum). Förmodligen leder ApoE4s försämrade förmåga att släppa HDL till att neuroner får tillgång till mindre kolesterol. HMGR är en målmolekyl för statiner vilka verkar genom att hämma enzymkomplexet och minska 24SHC i serum och CSV. Dessutom verkar statiner kunna höja det goda kolesterolbärande proteinet HDL både i CNS och i serum. Hyperkolesterolemi är en riskfaktor för AD och statiner har visat sig kunna minska både kolesterolhalten och risken för att utveckla sjukdomen. Däremot tyder det mesta på att läkemedlet inte minskar Aβ koncentrationerna i hjärnan 48. Insulin ökar produktionen av kolesterol genom att fosforylera AMP aktiverat proteinkinas som då aktiverar HMGR (Fig. 21). Glukagon verkar tvärtom på HMGR och hämmar aktiviteten. Hyperkolesterolemi, en dyslipidemi som är vanligt förekommande både hos feta och hos diabetiker, skulle alltså kunna bero på hyperinsulinemi. 15

Figur 22. Negativ feedback av Aβ40 på bildandet av kolesterol och positiv feedback av Aβ42 på bildningen av sphingomyelin som behövs för de myelintäcken som skyddar axonerna på nervceller. Hög sphingomyelinkoncentration hämmar γ sekretas vilket leder till mindre bildning av Aβ40-42. Mekanism föreslagen av Mattson et al. 2005 140. Membranassocierad oxidativ stress (MAOS) ökar ceramidproduktionen. Figur 21. Regleringen av HMGR av King 2010 141. Det defosforylerade stadiet av HMGR är mest aktivt och fosforylering katalyseras med AMP aktiverat proteinkinas (AMPK). AMPK regleras även den med fosforylering, glukagon och adrenalin hämmar syntesen av kolesterol genom att öka aktiviteten av det inhiberade proteinet fosfoprotein fosfatasinhibitor 1 (PPI-1). Insulin stimulerar istället borttagandet av fosfater vilket ökar HMGRs aktivitet. Även vid höga kolesterolhalter minskar HMGRs aktivitet. Det har föreslagits att Aβ40 fungerar som en negativ regulator för kolesterol. Det vill säga Aβ40 minskar aktiviteten på HMGR och på så sätt minskar kolesterolsyntesen 135,137 (Fig. 22). I den mekanismen verkar även Aβ42 som en positiv regulator för sphingomyelin (SM), en lipid vanlig i cellmembran, som är särskilt viktig för att bilda de myelinbäddar som täcker axonerna på nervceller 137. γ-sekretasaktiviteten på APP ökar vid låga koncentrationer SM. Sphingomyelinas är enzymet som katalyserar SM till ceramid och vice versa. Ceramid, också en lipid, kan inducera apoptos vid aktivering från TNFα som hämmar sphingomyelinas, vilket i sin tur ökar ceramidproduktionen 136. Detta leder till minskad SM koncentration och ökande halter aggregeringsbenäget Aβ42. Nya studier pekar på att ofördelaktig BACE-1 klyvning i första hand sker i så kallade lipidflottar och att α sekretasklyvning inte sker där. Dessa flottar är en del av lipidmembranet men består till skillnad från övriga membranet till största del av kolesterol och SM. Den mesta proteinsignaleringen och receptortrafikeringen sker genom dessa flottar. Hhypotesen att kolesterol är en huvudaktör i ADs sjukdomsförlopp finns det fog för. Problemet är att mekanismerna bakom är ofullständigt kända och det finns vissa frågetecken. Det finns till exempel ingen signifikativ korrelation mellan serumhalterna kolesterol och de i CNS. De flesta studierna gjorda på AD patienter och kolesterol bygger dessutom på halter av kolesterol i serum, inte i CSV. De få som finns på CSV tyder på att HDL nivåerna är lägre hos AD patienter än hos friska kontroller och att lågt HDL är en riskfaktor för AD. Dyslipidemi, ett typiskt kännetecken vid metabolt syndrom och DMT2 är en riskfaktor för AD men hur det hela hänger ihop är oklart. Sammanfattningsvis bör omgivningen av lipider ha en stor inverkan på klyvningen av APP eftersom den till störst del sker i membranet. Dessutom är det intressant att se Aβ som en kolesterolregulator, då man tidigare inte haft någon adekvat förklaring på peptidens biologiska roll. LÄKEMEDEL MOT DIABETES HJÄLPER AD PATIENTER Insulinterapi som används på DMT2 patienter har visat sig hjälpa även på AD patienter. I en observationsstudie från Italien av Plastino et al. 2009, där man följde upp insulinterapi hos AD patienter, såg man en signifikativ minskning av kognitiv tillbakagång 129. I en annan obduktions- 16

studie av Beeri et al 2008 visade man att insulinterapi tillsammans med andra diabetesläkemedel gav signifikant lägre densitet neuritiska plack 159. Som tidigare nämnt har diabetesläkemedlet Troglitazon en hämmande effekt på hyperfosforylering av tau. Rosiglitazon, också ett diabetesläkemedel av samma familj, har visat sig ha terapeutisk verkan på AD patienter. Rosiglitazon är precis som Troglitazon en agonist till PPARγ och har testats på patienter med mild AD. I två studier har man gett Rosiglitazon i 6 månader med förbättrat resultat på både minne och kognitiv funktion i jämförelse med placebokontroller 125,132. Läkemedlet hjälpte dock inte på patienter med ApoE4 allelen. Det ska tilläggas att läkemedlet på senare tid visat sig vara skadligt, då det gett hjärtsjukdom hos vissa patienter som använt läkemedlet 126. HYPOTETISKT FÖRLOPP FÖR AD DIABETES TYP 3 (Fig. 23) Det hypotetiska förloppet i ett pre-diabetiskt stadium: Hyperinsulinemi inträffar perifert för att överbrygga hyperglykemi, som leder till temporära stadier av onormalt höga nivåer insulin i CNS. Detta gör att IDEs uttryck minskar vilket är en risk för Aβ ackumulering, dessutom har insulin högre affinitet för IDE än Aβ vilket kan ge minskad degradering av Aβ. Aβ är självaggregeringsbenägen och kan vid högre koncentrationer lättare bilda neurotoxiska ADDLs. Detta skulle kunna tänkas vara en risk för IR-/IGF-1R-resistens. En ökad CDK5 aktivitet äger rum och risken för tau hyperfosforylering blir större. Hyperglykemi leder även till ökad klyvning av tau av caspas 3 och ett nukleringscenter bildas vilket kraftigt ökar risken för aggregering Skyddande IGF-1 som bland annat favoriserar α-sekretasklyvning och förhindrar β-sekretasklyvning, minskar på grund av reducerad transport över BBB då insulinkoncentrationerna är höga. Den minskade halten IGF-1 leder till ökade halter av TNFα som är neurotoxisk och har föreslagits kunna orsaka insulinresistens 127. Dessutom minskar TNFα SM koncentrationen, vilket leder till ökade halter aggregeringsbenäget Aβ42 och ökar koncentrationen ceramid, vilket leder till apoptos. Om hyperinsulinemi fortgår för att överbrygga perifer hyperglykemi för frekvent, och övergår i kronisk hyperinsulinemi, kommer mindre och mindre insulin kunna penetrera BBB på grund av dess mättnadsbara transportsystem. Eftersom insulin i CNS hjälper till att reglera hunger och höjning av blodsockret, kommer en minskad insulinkoncentration i CNS leda till ett ökat födointag och sannolikt fortsatt hyperglykemi, förvärrad hyperinsulinemi och troligen även ökad vikt. Övervikt tillsammans med åldrande är den största risken för att utveckla insulinresistens. Ju mer vikten ökar desto större är risken för insulinresistens och tilltagande fetma. Det innebär att man förmodligen kommer att äta mer för att man är på väg att utveckla fetma. Diabetiker har också relativt högre vikt än friska. Då tappar CREB sitt jämviktläge och är i högre grad fosforylerat vilket ökar risken för perifer insulinresistens. Detta skulle i sin tur kunna leda till ökad BACE-1- och γ-sekretasaktivitet och mer aggregeringsbenäget Aβ42 som fungerar nedreglerande på CREB. Aβ42 genererar dessutom reaktiva syreradikaler (ROS = Reactive oxygen species) vilket kan leda till inflammation i CNS. När den perifera insulinresistensen tilltagit kompenserar bukspottskörteln med ökad produktion av insulin och ökad mängd IAPP. Detta riskerar att leda till förvärrad diabetes och kronisk hyperglykemi, något som resulterar i ökande koncentrationer AGEs och permanent hyperinsulinemi. AGEs aktiverar RAGE i högre grad, vilken uppreglerar β-sekretasklyvning av APP och då ökar risken för stigande Aβ halter i CNS. Det höga uttrycket av RAGE aktiverar även mikroglia som ökar inflammationen i hjärnan. Låg halt insulin i CNS gör att mer Aβ kan ta sig in eftersom p-gps neuroskyddande funktion i BBB hämmas, vilket gör CNS mer sårbart för 17

toxiner och andra skadliga ämnen, som skulle kunna orsaka insulinresistens och inflammation. Förmodligen har den drabbade nu kraftig dyslipidemi vilket leder till högre koncentrationer Aβ40-42. Detta på grund av den kortare peptidens nedreglerande effekt på HMGR när kolesterolhalterna är höga vilket ger en ökad γ sekretasaktivitet, samt den längre variantens inverkan på SM. De låga insulinkoncentrationerna i CNS resulterar vidare i ett minskat uttryck av Aβ rensande LRP-1. Insulinresistens i CNS kan till slut uppstå där ADDLs kan bryta ner IGF- 1R/IRs samtidigt som IDEs minskande förmåga att bryta ner Aβ ökar. Förloppet accelererar med hyperfosforylering av tau vilket leder till oligomerisering av proteinet. Oligomererna aktiverar mikroglia och ökad inflammation och neurodegenerering följer. Insulin i CSV. Detta är förknippat med rubbat glukosupptag, kognitiva problem och AD. Hur uppstår insulinresistens i CNS? Inte bara ADDLs och TNF-α är föreslagna huvudaktörer vid CNS insulinresistens. de la Monte, 2009 har föreslagit att resistensen uppstår på grund av en nitrosamin, N-Nitrosodietylamin (NDEA) 46,123-124. Denna molekyl har liknande struktur som den insulinresistentinducerande molekylen streptozotozin (Fig. 24). Man vet sedan tidigare att NDEA kan orsaka cancer och ge upphov till reaktiva syreradikaler, ROS, vilket kan leda till mitokondriedysfunktion och överexpression av andra proinflammatoriska cytokiner 120-121. Enligt de la Monte orsakar höga doser NDEA risken för cancer, men att det bara behövs små doser för att ge neurodegenerativa komplikationer. NDEA finns i tobak, kosmetika samt processad mat. Tillsatsämnet E250 som används för att hämma botulismbakterier i charkprodukter är natriumnitrit och kan bilda NDEA i kroppen, vilkas nedbrytningsprodukter är cancerogena. Man har kunnat hämma NDEA med vitamin E, en antioxidant som man sett kunnat förebygga AD till viss del 118-119. Figur 23. Förslagen mekanism av Neumann et al. 2008 41 där a) perifer insulinresistens leder till hyperinsulinemi och ökade insulinhalter i CNS. B) Detta leder till minskad mängd IDE som kan bryta ner Aβ på grund av kompetativa förhållanden substraten emellan. C) Ökad mängd Aβ kan leda till ökad CDK5 aktivitet som leder till förhöjd hyperfosforylering av Tau, vidare NFT och neurodegenerering. D) Den ökade mängden monomert Aβ självaggregerar och ger neurotoxiska oligomerer och vidare plack. E) Oligomererna leder till proinflammatoriska cytokiner som binder PPARγ, vilken är ansvarig för reglering av insulinreceptorer (Den här genen uppregleras av diabetesmediciner som riktas mot PPARγ). F) Insulinresistens i CNS skulle kunna leda till minskad P13K aktivitet, minskad PKB signalering som medför ökad GSK3β aktivering vilket ökar hyperfosforylering av tau. Minskad aktivitet av PKB och ökad GSK3β har också kopplats ihop med proapoptotiska vägar. G) Kronisk hyperinsulinemi skulle i slutändan mätta BBB till den grad att transporten över till CNS leder till minskade mängder Figur 24. Streptozotocin och likheten med NDEA. Enligt vissa en orsak till insulinresistens i hjärnan. Diabetes ökar risken för LPS (lipopolysackarid)- inducerad skada i hjärtat och skulle även kunna leda till ökad Aβ transport över BBB. LPS kan binda till p-gp vilket teoretisk skulle kunna ge onormalt höga halter av skadliga gifter i CNS, som sedermera skulle kunna leda till insulinresistens 122. Kan insulin självt orsaka resistens genom stress när det utsöndras? Det har föreslagits att insulin 18