Vitaliteten hos biologiska växtskyddsmedel, del II

LANDSKAP TRÄDGÅRD JORDBRUK Rapportserie Vitaliteten hos biologiska växtskyddsmedel, del II Vitality in biopesticides, part II Partnerskap Alnarp Anders TS Nilsson, Christina Johansson och Sven Axel Svensson Område Jordbruk odlingssystem, teknik och produktkvalitet, SLU Alnarp Sveriges lantbruksuniversitet Fakulteten för landskapsplanering, trädgårds- och jordbruksvetenskap Rapport 2011:18 ISSN 1654-5427 ISBN 978-91-86373-69-6 Alnarp 2011

2

LANDSKAP TRÄDGÅRD JORDBRUK Rapportserie Vitaliteten hos biologiska växtskyddsmedel, del II Vitality in biopesticides, part II Partnerskap Alnarp Anders TS Nilsson, Christina Johansson och Sven Axel Svensson Område Jordbruk odlingssystem, teknik och produktkvalitet, SLU Alnarp Sveriges lantbruksuniversitet Fakulteten för landskapsplanering, trädgårds- och jordbruksvetenskap Rapport 2011:18 ISSN 1654-5427 ISBN 978-91-86373-69-6 Alnarp 2011

Innehåll Förord... 3 Sammanfattning... 5 Summary... 6 1. Inledning... 7 1.1 Bakgrund... 7 1.2 Syfte... 8 2. Material och metod... 8 2.1 Försöksplan... 8 2.2 Växtmedium... 11 2.3 Spädningsförfarande... 11 2.4 Placering av preparat på agarplattor... 11 2.5 Inkubation... 12 2.6 Avläsning... 12 3. Resultat... 12 3.1 Antal koloniformande enheter i spädningarna... 12 4. Diskussion... 17 4.1 Bakgrund... 17 4.2 Vad har vi kommit fram till?... 18 4.3 Varför välja 100 CFU per platta?... 18 4.4 Biologisk effekt... 19 4.5 Fortfarande oklara skillnader mellan labben... 19 5. Slutsatser... 20 6. Referenser... 20 Alla foton i rapporten är tagna av Anders TS Nilsson, Område Jordbruk - odlingssystem, teknik och produktkvalitet, SLU Alnarp. Dock är mikroskopbilden tagen av Malin Hultberg, forskarassistent, Område Hortikultur, SLU Alnarp. Mikroskop: Nikon Eclipse 50 I. Omslagsbilden illustrerar de stora variationerna som kan uppträda i ett vitalitetstest. På samtliga agarplattor förväntades 100 kolonibildande enheter (CFU), om utgångsmaterial och groning hade varit fullgod. De övre två raderna visar ett normalt resultat, men med låg vitalitet. De nedre raderna visar den stora variation, och avvikande resultat från förväntat, som ibland kunde uppträda inom en och samma utspädning. Foto: Anders TS Nilsson 1

2

Förord Föreliggande delrapport har syftet att redovisa den andra delen av projektet Biologiska växtskyddsmedel - vitalitetsundersökning. Första delen omfattade analyser av Preferal och Botanigard, främst genomförda vid kommersiella laboratorier. Resultatet uppvisade så stora variationer i analysresultat mellan laboratorier, analystillfälle och upprepningar, att det ansågs viktigt att närmare utreda de otillfredsställande resultaten. (Nilsson et al., 2010) I denna andra studie har vitaliteten hos preparatet Botanigard ES studerats betydligt grundligare och ett förslag på provningsprocedur presenteras. Partnerskap Alnarp har finansierat arbetet (projekt nr PA 335). Projektet har motfinansierats av Jordbruksverket. Klara Löfkvist, HIR Malmöhus AB, Borgeby, har bidragit med viktiga erfarenheter om användningen av biologiska bekämpningsmedel samt deltagit i diskussioner runt planering, utförande och resultat i projektet. Malin Hultberg, Område Hortikultur, SLU Alnarp, har varit till stor hjälp vid tolkningen av resultatet samt med mikroskopifotografering. Jan-Eric Englund, Område Jordbruk, SLU Alnarp, har biträtt med statistisk fackkunskap och beräkningshjälp. Slutligen vill vi nämna det stöd vi fått av Jørgen Eilenberg, Institut for Jordbrug og Økologi, Det Biovetenskabelige Fakultet, Københavns Universitet, Danmark. Studien har bedrivits vid Område Jordbruk- odlingssystem, teknik och produktkvalitet, SLU Alnarp, som också har utfört vitalitetstesterna och stått för resultatsammanställning, analys och rapportering. Alnarp i mars 2011 Sven Axel Svensson Projektledare Område Jordbruk SLU Alnarp Erik Steen Jensen Områdeschef Område Jordbruk SLU Alnarp 3

4

Sammanfattning Biologiska växtskyddsmedel har en viktig position vid produktion av trädgårdsprodukter, eftersom de ger en liten påverkan på den omgivande miljön samt motverkar uppkomsten av resistens mot kemiska växtskyddsmedel hos skadegörare. Användningen har ökat i prydnadsväxter, bär- och fruktproduktion. Eftersom biologiska växtskyddsmedel är levande organismer kan en del faktorer påverka slutresultatet efter bekämpning. Det kan vara frågan om preparatets ålder, lagring, användningsmetod, spridningsutrustning m.m. Variationer förekommer dessutom i den biologiska tillverkningsprocessen, något som kan medföra skillnader mellan olika batcher (tillverkningsomgångar). Projektets syfte, i del 2, har varit att, så objektivt som möjligt, ange en tillförlitlig metod för att bedöma vitaliteten hos preparatet Botanigard ES. Vid studien har sex identiska försök utförts i SLU:s laboratorium, för att få en uppfattning om den interna spridningen inom den egna metoden. Försöken har upprepats under så lika förhållanden som möjligt vad gäller temperatur och ph på spädvattnet, omröringsförhållanden, uppmätning, applicering och inkubation. Projektet visade att det går att uppnå en säker och acceptabel repeterbarhet vid vitalitetstest på laboratorium. De nya kunskaperna om metodik och repeterbarhet kan dock inte fullt ut förklara de stora variationerna i resultat mellan olika kommersiella laboratorier, som redovisats i tidigare projekt. En förklaring till de stora och slumpmässiga variationerna vi sett i detta projekt kan hänföras de lipofila egenskaperna hos sporerna, eftersom de tenderar att bilda klumpar i lösningen och motverkar en jämn utstrykning på agarplattorna. Exakt hur en sådan klump av sporer utvecklas på en agarplatta känner vi inte riktigt till. De slutliga resultaten visade en god repeterbarhet för det studerade partiet av Botanigard ES vid dessa testomgångar. Slutsatserna är att vi kan visa på en tillförlitlig metod att bedöma vitaliteten hos Botanigard ES. Det krävs dock ett antal upprepningar av testomgångarna för att erhålla tillförlitliga resultat som inte avviker p g a klumpbildning. Vitaliteten var dock låg i förhållande till vad som angavs på förpackningen; endast 16,8 ± 4,8 % av förväntat resultat. Detta är testresultat på laboratoriet och på agarplattor, men då appliceringsnivå och inträngning i verkliga bekämpningssituationer uppvisar stora variationer, är resultatet iögonfallande. Frågan kvarstår om vad detta betyder för behandlingens biologiska effekt. Den statistiska analysen visade i detta försök att både spädningsnivån 50 och 100 CFU ger tillräcklig noggrannhet och kan fungera som underlag för vitalitetsberäkningarna. Viktiga mått och steg i utförandet av testet, för att undvika felaktiga resultat: Utför noggrann omröring och uppmätning Genomför en preliminär spädningsserie för att finna en utspädningsnivå som ger ett lämpligt antal CFU per platta Håll uppsikt på avvikelser, som kan tyda på lipofila klumpar Genomför ett flertal testomgångar för att erhålla användbara resultat och minst 5 replikat för varje spädningsnivå 5

Summary Biological plant protection products have an important position in the production of horticultural products. They provide a low environmental impact, and prevent the emergence of resistance of pests to chemical pesticides. The use of biopesticides against pests has increased in ornamental plants, berries and vegetables. Since biopesticides are living organisms, different factors affect the final activity after spraying, for example the age and storage history of the product, application method, application equipment, etc. Variations also occur in the biological production process, which could lead to differences among production batches. The purpose of the project was to study, as objective as possible, how various factors affect the vitality of one of the most common biological pesticides; Botanigard ES (Beauveria bassiana), and in that way to suggest a reliable method for assessing the vitality of the product. Six identical experiments were performed in SLU's laboratory, in order to determine the internal variation of the test method. The experiments were repeated under uniform conditions, with regard to test factors such as temperature and ph of dilution water, stirring conditions, dilution rate, measurement, application, incubation, etc. The project showed that it is possible to accomplish reliable and acceptable repeatability in laboratory vitality testing. However, the new insights about repeatability obtained by performing these test procedures still could not fully explain the large variations in results among different commercial laboratories, as was experienced in an earlier project. One explanation of the previous large and apparently random variations in test results among laboratories could be related to the lipophilic properties of the spores, as they tend to form clumps in the test liquid, preventing an equal distribution in the petri dishes. We don t know exactly how such a clump of spores develops on an agar plate. Conclusions are that the procedures described here produced a good repeatability for the studied batch of Botanigard ES. However, the vitality in relation to what was expressed on the label was low; only 16,8 ± 4,8 % of expected. These are results of laboratory studies, but still striking, because we have realized that other factors that affect activity to biopesticides, such as application rate and penetration, could differ greatly in real life situations. The question remains: what does this mean for the efficacy of the treatment? In this project, the statistical analysis showed that both a dilution level of 50 and 100 CFU provide sufficient accuracy and can be used for the calculations. Important measures in performing the test, to avoid erratic results: Perform accurate mixing and dispensing Make a preliminary dilution series to find a level of dilution providing an appropriate number of CFU per plate Watch for abnormal results, indicating lipophilic clumps Perform a number of repetitions and use at least five replicates to obtain useful results. 6

1. Inledning 1.1 Bakgrund Biologiska växtskyddsmedel har en viktig position vid produktion av trädgårdsprodukter, eftersom de ger en liten påverkan på den omgivande miljön samt motverkar resistens mot kemiska växtskyddsmedel. Ett antal sådana växtskyddsmedel är registrerade och används oftast i växthusproduktion (SJV, 2010a; SJV, 2010b ; Nedstam, pers inf, 2008). Dessa preparat används, tillsammans med olika förebyggande åtgärder, i bär- och grönsaksproduktion och har också ett berättigande i jordbruksgrödor, även om de är mycket sällan förekommande där idag. Dessa växtskyddsprodukter kan förhoppningsvis bli ett viktigare inslag i det integrerade växtskyddet för olika jordbruksgrödor. En förutsättning är att de kan användas på ett sätt så att de får en tillfredställande och dokumenterad säker effekt i de odlingssystem där de används. Produkterna innehåller aktiva mikroorganismer. De kan vara baserade på bakterier såsom Bacilllus thuringiensis och Streptomyces griseoviridis. Andra kan vara baserade på sporer av insektspatogena svampar som Beauveria bassiana och Verticillium levanii. Det används även virus och svampar, t.ex. Cydia pomonella granulovirus som används mot äpplevecklare i fruktodling, Trichoderma ssp. för att bekämpa svampsjukdomar och Metarhizium anisopliae för att bekämpa skadeinsekter. Preparaten kan också innehålla olika tillsatser för optimering av formulering och spridningsegenskaper. Krav på en vetenskaplig dokumentation av preparatens biologiska effekt ligger till grund för godkännande och borde inte behöva ifrågasättas. Det finns emellertid alltid en risk för att en del faktorer i praktiken kan påverka slutresultatet efter sprutning, eftersom biologiska växtskyddsmedel är levande organismer. Man kan nämna preparatets ålder, lagring, miljöfaktorer, användningsmetod, spridningsutrustning, kontaminering, m.m. Variationer förekommer dessutom i den biologiska tillverkningsprocessen, något som kan medföra skillnader mellan olika batcher (tillverkningsomgångar). Inom trädgårdsnäringen råder det delade meningar om effekten hos dessa växtskyddsmedel. Enligt en intervjuundersökning om växtskyddsmedlet BotaniGard, gjord 2008 av Klara Löfkvist på HIR Malmöhus, har man bland julstjärneodlare en positiv inställning till preparatet, men är osäker på effekten (SJV, 2010a; SJV, 2010b). Den biologiska bekämpningen används frekvent, men i många fall sker en kompletterande kemisk bekämpning. Variationer i vitalitet hos biologiska växtskyddsmedel har också tidigare redovisats (Danmarks Miljöstyrelse, 2005). I samband med bekämpningsförsök vid SLU Alnarp med BotaniGard mot mjöllöss, gjordes inledande vitalitetsundersökningar under hösten 2008. Dessa gav resultat med stora avvikelser mot förväntat resultat, något som ledde till diskussioner om förväntad biologisk effekt av biologiska växtskyddsmedel (Svensson et al., 2008). Resultaten från tidigare studie (del 1), där ett antal kommersiella laboratorier undersökte vitaliteten hos biologiska växtskyddmedel, visade att det förekom stora variationer i analysresultat mellan laboratorier, analystillfällen och replikat (Nilsson et al., 2010). De stora variationerna medförde att laboratorierna t ex inte kunde notera skillnader mellan prov av kurant produkt och prov med inblandning av avdödat material. Ett laboratorium fick oväntat höga resultat, där tillväxten var betydligt högre än vad tillverkaren angett. Även SLU Alnarp fick i sina egna försök och i enstaka spädningar i en testomgång liknande resultat. Exempelvis 7

hade en spädning som visade över 250 % av förväntat resultat framställts från en lösning som visade 95 % av förväntat resultat. Detta väckte då frågan om skillnaden i resultat berodde på svårigheten att mäta upp och applicera ett homogent prov, eller om det fanns andra faktorer som inverkade. Sådana faktorer skulle kunna vara inverkan av vattnets temperatur och ph, omröring vid provpreparering, samt inkubationsförhållanden som temperatur, ljustillgång och luftfuktighet. Den ursprungliga målsättningen, inför del 1, i projektet var att undersöka faktorer som påverkar vitaliteten, samt att ge råd till odlarna angående hantering av de biologiska preparaten. Under arbetet med del 1 av projektet insåg vi att det krävdes en tillförlitlig metod för att bedöma vitaliteten hos preparaten. Det fanns därför skäl att gå vidare med att undersöka vilka variationer som kunde uppstå inom samma preparat vid samma analys och vid konstanta förhållanden, samt att undersöka svårigheten att mäta upp och applicera ett homogent prov. 1.2 Syfte Projektets syfte, under del 2, har varit att på ett så objektivt sätt som möjligt undersöka de variationer som uppstår vid vitalitetstest på ett och samma laboratorium, med ett och samma preparat och vid konstanta förhållanden. 2. Material och metod 2.1 Försöksplan Projektet omfattade ett antal studier av vitaliteten hos Botanigard ES (Beauveria bassiana) genom odling i petriskålar med potatisdextrosagar. Bestämning av vitaliteten hos svampbaserade biologiska växtskyddsmedel görs vanligen genom fastställandet av antalet levande kolonibildande sporer (Colony Forming Units, CFU) per ml eller g preparat. Efter en lämplig utspädning appliceras en liten mängd av proven på agarplattor. Inkubation i en odlingskammare leder till att sporerna gror. Därefter avräknas antalet bildade kolonier per agarplatta och jämförs med det teoretiskt beräknade, förväntade antalet. I studien har ett relativtal beräknats som anger procent vitalitet eller procent livsdugliga sporer av den för formuleringen angivna koncentrationen. Vitalitetstest har utförts med Botanigard ES (Beauveria bassiana), batch nr ESO 090206, med ett bäst-före-datum: 2010-02-28. På förpackningen angavs att preparatet skulle innehålla 2 x 10 10 CFU per ml emulsion. Mätningarna i SLU:s laboratorium omfattade ett antal identiska testomgångar. Vid varje sådan omgång togs ett prov ur en och samma förpackning. Vitalitetstesterna utfördes mellan 2009-08-14 och 2009-08-28. Huvudförsöket omfattade sex identiska testomgångar. I varje omgång framställdes en spädningsserie, för att få en förväntad koncentration på 50, 100 respektive 250 CFU per agarplatta. För varje spädningsnivå inom respektive testomgång, användes åtta plattor (replikat) (se Figur 1, Figur 2 och Formel 1). 8

1 ml 0,25 ml 50 ml FÖRPACKNING 2 x 10 10 CFU/ml 999 ml 1000 ml 1 20 ml + 50ml 2 + 80ml 3 50 ml 0,1 ml 0,1 ml appliceras på varje agarplatta och stryks ut + 50ml 4 2 A Förväntat antal: 250 CFU per platta 0,1 ml 0,1 ml appliceras på varje agarplatta och stryks ut 3 B Förväntat antal: 100 CFU per platta 0,1 ml 0,1 ml appliceras på varje agarplatta och stryks ut 4 C Förväntat antal: 50 CFU per platta Figur 1. Schematisk figur, som visar spädningsförfarandet för en testomgång. Förväntad koncentration i behållare 1: 5 000 CFU per ml; 2: 2 500 CFU per ml; 3: 1 000 CFU per ml samt 4: 500 CFU per ml. Genom att ta ut 0,1 ml från behållare 2, 3 och 4 erhålls 250, 100 respektive 50 CFU per platta. 9

50 100 250 Figur 2. Förväntat antal CFU per platta = 50 övre, 100 mellersta och 250 nedre raden. Figuren visar plattor efter 4 dagars inkubation, med sporer som har grott. 6 testomgångar 3 spädningar per testomgång 8 plattor (replikat) per spädning => => totalt 144 plattor Formel 1. Beräkning av antalet plattor. Förpackningen med Botanigard ES förvarades i kyl och skakades noggrant före provtagning. Provet hade därför samma temperatur vid samtliga testomgångar. Vi visste sedan tidigare att pipettering av den trögflytande vätskan kunde medföra problem, framförallt vid tömning av pipettspetsen. Vi lät därför pipettspetsen följa med vid prepareringen av den första lösningen. Pipetten fick också rinna av innan den tömts i spädvattnet, för att så lite som möjligt skulle fastna på utsidan av pipettspetsen och följa med till spädvattnet. Vid efterföljande spädningar var lösningarna mindre trögflytande och problemet med att sporer fastnade i pipettspetsen var betydligt mindre. Vi sköljde här pipettspetsen noggrant i spädvattnet cirka tre gånger. Procedurerna var detsamma vid alla testomgångar. Det rådde osäkerhet om resultatet skulle kunna påverkas av olika sätt att rackla ut provet på agarplattorna. Sporer ansågs nämligen kunna fastna på racklan och följa med till nästa platta. Studier genomfördes därför, dels med en och samma rackla för hela spädningen, dels med byte av rackla mellan varje platta. Vi undersökte också effekten av att skölja av racklan med avjoniserat vatten mellan varje agarplatta. Det hade också förts fram åsikter om att UV-ljus under inkubationen skulle kunna påverka groningen negativt. Av denna anledning gjordes några extra experiment. Samtliga extraprov gjordes med prov från testomgång 4 och 6. Slutligen har lösningarna från testomgång 5 och 6 också studerats i ljusmikroskop för att undersöka om sporerna kan ansamlas i klumpbildningar. 10

2.2 Växtmedium Agarplattorna tillverkades genom att 39 g Potato Dextrose Agar (PDA) blandades i 1000 ml avjoniserat vatten under omröring. Därefter autoklaverades agarn i 20 minuter i 121 C. Den autoklaverade agarn hälldes på petriskålar av plast, och fick svalna med halvöppna lock för att reducera kondensbildningen. Agarplattorna förvarades i rumstemperatur tills placering av preparaten utförts. Detta gav följande koncentration av komponenter i g per 1000 ml agar: Potatisextrakt 4,0 Dextros 20,0 Agar 15,0 ph 5,6 (± 0,2) erhölls 2.3 Spädningsförfarande Preparatets koncentration uppgavs i förpackningens innehållsförteckning till 2 x 10 10 CFU per ml. Med syfte att hitta de mest tillförlitliga resultaten gjordes en separat spädningsserie för varje testomgång, med tre CFU-koncentrationer (se Figur 1). Preparatet skakades under en minut, därefter pipetterades 1 ml i 999 ml kranvatten för att erhålla 2 x 10 7 CFU per ml. Blandningen rördes om med magnetomrörare i 5 minuter och fick stå i 30 minuter innan fortsatt spädning. Pipettspetsen fick ligga med i lösningen under omröring och vila 5 + 30 min. Lösningen rördes om igen direkt före nästa spädning. Av denna lösning späddes 0,25 ml till 1000 ml, vilket resulterade i ett förväntat innehåll på 5000 CFU per ml (lösning (1) i Figur 1). Därefter bereddes lösningarna 2, 3 och 4 enligt: 50 ml av lösning (1) späddes till 100 ml 2500 CFU per ml i lösning (2) 20 ml av lösning (1) späddes till 100 ml 1000 CFU per ml i lösning (3) 50 ml av lösning (3) späddes till 100 ml 500 CFU per ml i lösning (4) Spädningarna har gjorts med hjälp av 100 ml och 1000 ml mätcylindrar. De mindre vätskemängderna (upp till 1 ml) har pipetterats upp. Pipettspetsen har då sköljts två till tre gånger i spädvattnet för att säkerställa att all lösning kommit ur pipettspetsen. Temperaturen på spädvattnet har under försöken legat mellan 20 och 21 C och ph på cirka 8,0. 2.4 Placering av preparat på agarplattor Arbetet har utförts under sterila förhållanden för att utesluta störning av andra mikroorganismer. Lösningarna rördes om med magnetomrörare i 5 minuter före pipettering. 0,1ml lösning ströks ut per agarplatta och med 8 stycken replikat (plattor) per spädning (se Figur 1 och Figur 3). Efter utplacering av 0,1 ml på agarplatta blev förväntat antal CFU per platta och spädningsserie: A. 0,1 ml av lösning (2) 250 CFU per platta B. 0,1 ml av lösning (3) 100 CFU per platta C. 0,1 ml av lösning (4) 50 CFU per platta 11

Figur 3. På agarplattor ströks ut 0,1ml lösning per platta. Av varje spädning gjordes 8 replikat (plattor). 2.5 Inkubation Agarplattorna inkuberades vid 25 C och i 14 timmar ljus och i 10 timmar mörker under 5 dagar. Inkubationen genomfördes i ett och samma värmeskåp med styrd temperatur och ljusintensitet. 2.6 Avläsning Avläsning av antal CFU gjordes genom direkt räkning av antal bildade kolonier. Två avläsningar har gjorts; efter 3 respektive 4 dagar. Valda avräkningstidpunkter är baserade på tidigare försök (Nilsson et al., 2010), för att sporernas tillväxt skulle hinna komma igång men utan att tillväxten blev så stor att avräkningen försvårades. Av erfarenhet vet vi också att efter 3 dagar ökar inte antalet kolonier utan endast tillväxt av de befintliga. 3. Resultat 3.1 Antal koloniformande enheter i spädningarna Huvudresultatet från avräkningarna av antal CFU per agarplatta, uttryckt i absoluta tal, redovisas i Tabell 1, Tabell 2 och Tabell 3. En omräkning har därefter gjorts för att få fram relativtal eller procent groning i förhållande till det förväntade resultatet (baserat på förpackningens uppgifter), se Tabell 4. Figur 4, Figur 5 och Figur 6 visar diagram med relativvärden grupperade efter spädningsnivå. Diagrammen visar samtliga resultat från de 8 replikaten vid varje testomgång och spädning. I testomgång 4, CFU 100, blev tillväxten så stor att räkning blev omöjlig. Resultaten från hela den spädningsnivån har utgått. I testomgång 2, CFU 50, där resultaten p g a handhavandefel blev noll har även resultaten från den spädningsnivån utgått. Avläsningarna efter fyra dagar var genomgående de tydligaste och en mer ingående statistisk bearbetning gjordes av resultat från dessa avläsningar. I bearbetningen ingår ej de orimligt höga värdena, ej heller de där ingen tillväxt alls har uppstått. I Tabell 4 och Tabell 5 redovisas resultatet av vitalitetsberäkningarna och vi kan här se att den undersökta förpackningen av Botanigard ES har en vitalitet på 16,8 ± 4,8 % (baserat på samtliga testomgångar och spädningsnivån CFU 100). 12

Tabell 1. Antal CFU per platta efter 4 dagar i värmeskåp. Förväntat antal: 50 CFU Replikat 1 2 3 4 5 6 7 8 Testomgång 1 7 7 13 12 9 11 11 6 2 * 0 0 0 0 0 0 0 0 3 7 10 9 7 13 5 11 10 4 6 8 8 6 9 10 6 16 5 9 2 3 13 6 4 5 14 6 12 8 5 5 8 6 8 10 *) Att tillväxten blev noll i denna testomgång och spädningsnivå beror troligtvis på ett handhavandefel och därför har resultaten utgått. Tabell 2. Antal CFU per platta efter 4 dagar i värmeskåp. Förväntat antal: 100 CFU Replikat Testomgång 1 2 3 4 5 6 7 8 1 13 17 17 16 20 14 28 25 2 0 15 19 10 12 17 12 12 3 20 10 16 18 19 18 14 63 4* 58 >500 >500 >500 381 291 198 96 5 11 11 16 24 16 17 16 20 6 8 22 11 11 9 12 16 12 *) Att tillväxten blev orimligt stor i denna testomgång och spädningsnivå beror troligtvis på klumpbildning och därför har resultaten utgått. Tabell 3. Antal CFU per platta efter 4 dagar i värmeskåp. Förväntat antal: 250 CFU Replikat Testomgång 1 2 3 4 5 6 7 8 1 54 41 50 56 48 54 42 60 2 47 67 67 63 46 78 68 52 3 37 45 47 51 59 62 35 48 4 30 33 42 39 43 48 52 44 5 37 34 25 39 26 28 31 32 6 35 48 37 40 36 32 41 35 13

Groningsförmåga [%] Groningsförmåga [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Testomgång Figur 4. Groningsförmåga, uttryckt som procent av förväntat antal CFU. Räkningar efter 4 dagar i värmeskåp. Spädningsnivå för att erhålla 50 CFU per platta. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Testomgång Figur 5. Groningsförmåga, uttryckt som procent av förväntat antal CFU. Räkningar efter 4 dagar i värmeskåp. Spädningsnivå för att erhålla 100 CFU per platta. 14

Groningsförmåga [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Testomgång Figur 6. Groningsförmåga, uttryckt som procent av förväntat antal CFU. Räkningar efter 4 dagar i värmeskåp. Spädningsnivå för att erhålla 250 CFU per platta. Tabell 4. Groningsförmåga för de olika testomgångarna och spädningsnivåerna. Samtliga fall gäller avläsning efter fyra dagar i värmekammare. Beteckningar som tidigare, d v s CFU 50: koncentration där 50 CFU per platta skulle motsvara fullständig groning. Stdav = standardavvikelse, SE = Standard Error Spädningsnivå (förväntat resultat) CFU 50 CFU 100 CFU 250 Testomgång Medelvärde Stdav Medelvärde Stdav Medelvärde Stdav 1 9,5 2,6 18,8 5,3 50,6 6,7 2 - - 13,9 3,2 61,0 11,4 3 9,0 2,6 22,2 16,8 48,0 9,5 4 8,6 3,3 - - 41,4 7,3 5 7,0 4,5 16,4 4,3 31,5 5,0 6 7,8 2,4 12,6 4,5 38,0 5,0 Absolut Relativt Absolut Relativt Absolut Relativt Medelvärde 8,4 16,8 16,8 16,8 45,1 18,0 Stdav 1,0 2,0 3,9 3,9 10,4 4,2 SE 0,4 1,7 4,2 Kvantil: 2,8 2,8 2,6 Konfidensintervall: Nedre gräns: 7,1 14,3 12,0 12,0 34,2 13,7 Övre gräns: 9,6 19,2 21,6 21,6 56,0 22,4 ± 2,5 ± 4,8 ± 4,4 15

Tabell 5. Groningsförmåga för de olika testomgångarna och spädningsnivåerna. Medelvärden och standardavvikelser för respektive testomgång, uttryckt i relativa tal. Samtliga fall gäller avläsning efter fyra dagar i värmekammare. Beteckningar som tidigare, d v s CFU 50: koncentration där 50 CFU per platta skulle motsvara fullständig groning. Stdav = standardavvikelse. Spädningsnivå (förväntat resultat) uttryckt i relativa tal CFU 50 CFU 100 CFU 250 Testomgång Medelvärde Stdav Medelvärde Stdav Medelvärde Stdav 1 19,0 5,2 18,8 5,3 20,3 2,7 2 - - 13,9 3,2 24,4 4,6 3 18,0 5,1 22,2 16,8 19,2 3,8 4 17,3 6,7 - - 16,6 2,9 5 14,0 9,1 16,4 4,3 12,6 2,0 6 15,5 4,9 12,6 4,5 15,2 2,0 Av Tabell 4 framgår att spridningen för hela experimentet, uttryckt med konfidensintervallet, var minst för den lägsta koncentrationen, d v s spädningsnivån 50 CFU per platta. Tabell 5, som redovisar spridningen hos relativtalen, inom respektive testomgång, visar på motsatsen, nämligen att spridningen var minst för den högsta koncentrationen, d v s spädningsnivån 250 CFU per platta. Figur 7 illustrerar vad som i sällsynta fall kan hända. Här har plattan i replikat nr 2 (testomgång 4 CFU 100) plötsligt fått en mycket stark tillväxt (hög koncentration CFU). Detta fortsätter, dock avtagande, för de efterföljande replikaten. Replikat 2 4 var ej möjliga att räkna. En rimlig förklaring kan vara att en klump av sporer följde med vid pipetteringen av 0,1 ml spädningsvätska till replikat nr 2, för att sedan successivt smetas ut med den använda racklan och minska på de efterföljande replikaten. Denna testomgång ingick ej i den statistiska bearbetningen. Händelsen som beskrivs här är snarare ett undantag än normalfall och har i dessa försök endast inträffat vid ett tillfälle, spädningsninå 100 CFU i testomgång 3. De specialundersökningar som gjordes visade att inga sporer normalt följer med racklan, men när en klump av sporer smetas ut på plattan, och koncentrationen sporer är hög, kan vi inte utesluta att sporer förs vidare till nästa platta med racklan. Det är den enda rimliga förklaringen till det vi ser i Figur 7. Exakt hur en klump av sporer utvecklas på en agarplatta känner vi inte till. De begränsade undersökningar av om UV-ljus påverkade groningen negativt visade inte på några skillnader. 16

1 2 3 4 5 6 7 8 Figur 7. Spädningsnivå 100 CFU per platta. Siffrorna betecknar replikat. Vi misstänkte att de extrema avvikelser vi såg i enstaka spädningar och i enstaka replikat kunde bero på att sporerna klumpade ihop sig. Vi lät därför göra mikroskopsbilder på olika spädningar. Prover för mikroskopering togs ut från de olika spädningarna och direkt efter omröring. Undersökningen av befarad klumpbildning i ljusmikroskop illustreras av Figur 8. Fotot visar tydligt en klump av ett stort antal sporer, parallellt med enstaka sporer i lösningen. Enstaka spor Klump av sporer Figur 8. Klump av sporer (ca 100 µm) att jämföra med enstaka sporer. Koncentrationen i lösningen förväntades vara 2*10 7 CFU per ml. 4. Diskussion 4.1 Bakgrund Utgångspunkten för planeringen av studien var att tidigare resultat från egna analyser av vitalitet visade stora variationer mellan analys av samma prov vid olika tillfällen, men också mellan replikat i samma spädning. Blindtester, utförda vid kommersiella laboratorier, uppvisade minst lika stora variationer. (Nilsson et al., 2010) Vid försöket studerades endast ett och samma preparat med samma metodik upprepad 6 gånger. Spädningsnivåerna valdes utifrån våra tidigare erfarenheter, av test med Botanigard 17

ES, till 50, 100 respektive 250 förväntat antal CFU per platta. Eftersom vi sett att enstaka replikat i tidigare försök kunde ge resultat som var orimligt höga och därmed helt oanvändbara ökade vi antal replikat vid varje spädning från 5 till 8. Målsättningen vid försöket har varit att utföra vitalitetstestet med så god repeterbarhet som möjligt och försöka identifiera orsaken till de avvikelser som kan uppträda. 4.2 Vad har vi kommit fram till? Även denna vitalitetsstudie har visat att enstaka spädningar i en testomgång kan få oförklarligt höga mängder levande sporer (CFU) och att enstaka replikat i en spädning kan visa samma tendens. En förklaring kan vara att sporerna kan bilda större klumpar i suspension och lösningar. Sporerna av Beauveria bassiana är lipofila (dras till fettartade strukturer) och det finns även stöd i litteraturen för teorin att de kan bilda klumpar i vattenbaserade vätskor (DAR, 2008). Att sporerna är lipofila är funktionellt, då detta möjliggör att de kan fästa vid insektens hud för infektion. De lipofila sporerna kan därför även fästa till varandra, vilket gynnar bildning av större klumpar och motverkar att sporerna fördelar sig jämnt i vätskan. Det finns ett intressant extremvärde i testomgång 4 som förmodligen illustrerar detta fenomen (se Figur 7). Spädningen till 100 CFU uppvisar i replikat nr 1 ett förväntat värde, för att därefter plötsligt ge ett orimligt högt värde. Det klingar sedan av genom de resterande replikaten. En rimlig förklaring kan vara att en klump av sporer följde med vid pipetteringen av 0,1 ml spädningsvätska till replikat nr 2, för att sedan successivt smetas ut med den använda racklan och därefter minska på de efterföljande plattorna. Fenomenet är tydligen mycket slumpartat, eftersom inga tendenser märks när just denna lösning späds till 50 CFU och stryks ut. Att sporer troligtvis överförs med racklan endast vid mycket höga koncentrationer, som orsakats av en klump, visas även av att specialstudierna med byte eller tvätt av rackla inte fångade upp fenomenet. Omröringen är speciellt viktig om tendensen att bilda lipofila klumpar av sporer är stor. Alla lösningar har rörts om direkt före att prov tagits ut i försöket, se Figur 9. Exakt hur omröringen påverkar provets och lösningarnas homogenitet är fortfarande oklart. Huruvida en ökad omrörning minskar eller ökar risken för klumpbildning är oklart. Variationer i faktorer som temperatur ljus, tid och luftfuktighet vid inkubation kan påverka resultaten, men då dessa hölls konstanta genom alla testomgångar, bör de inte ha påverkat resultaten. 4.3 Varför välja 100 CFU per platta? I denna typ av försök antar man oftast att bildandet av kolonier (CFU) följer en poissonfördelning om inte koncentrationen är så hög att kolonierna klumpar ihop sig. För en sådan fördelning gäller att säkerheten i uppskattningen av medelvärdet av antalet kolonier per platta ökar med koncentrationen i provet. Man får alltså säkrare resultat om man har prov med hög koncentration Verkligheten sätter dock gränser för detta, speciellt då det vid hög koncentration uppstår en konkurrens mellan de groende sporerna, som hämmar deras bildning av kolonier. Likaså blir det svårt att räkna antalet kolonier korrekt då de sitter för tätt. Vi kunde i våra avräkningar observera en tendens till konkurrens mellan de groende sporerna på spädningsnivån 250 CFU och vid användning av plattor av denna storlek. 18

I den statistiska analysen av våra försök kunde vi se att konfidensintervallet vid spädning till 50 CFU var något snävare än vid 100 CFU. Skillnaden beror i princip på ett enda mätvärde i spädningsnivån 100 CFU som avviker markant. Man kan dra slutsatsen av detta försök att både spädningsnivån 50 och 100 CFU skulle kunna fungera som underlag för beräkningarna. Av erfarenhet vet vi att standard brukar vara spädningsnivån 100 CFU och av denna anledning lät vi denna spädningsnivå bilda underlag för vår bedömning av vitaliteten hos Botanigard ES. Figur 9. Alla lösningar rördes om direkt innan prov togs ut. 4.4 Biologisk effekt Frågan kvarstår vad en vitalitet på 16,8 ± 4,8 % innebär i praktiken i form av biologisk effekt. Man skulle kunna tänka sig att sprutvätskan, trots nedsatt vitalitet, innehåller så många livsdugliga sporer att det finns ett överflöd i den verkliga bekämpningssituationen. Följande beräkningsexempel illustrerar vissa relationer. Med fullgod vitalitet hos preparatet kan vi förvänta 2 x 10 10 CFU per ml, vilket i rekommenderad sprutvätskeblandning motsvaras av 5 x 10 10 CFU per liter. Om vi förutsätter en sprutvätskemängd på 100 liter per 1000 m 2, kommer detta att motsvaras av cirka 5 000 CFU per mm 2. Med cirka 20 % av angiven vitalitet ligger värdet på 1000 CFU per mm 2. Denna mycket teoretiska beräkning förutsätter att sprutvätskan fördelas idealiskt jämnt över den besprutade ytan. Vi vet att så inte är fallet i verkligheten, utan speciellt bladens baksidor (nedåtriktade) kommer att få en mycket dålig täckning, kanske under 10 % täckningsgrad vilket motsvarar 100 CFU per mm 2. Vi är då nere vid den nivå, 50 150 CFU per mm 2, som krävs enligt Wraight et al. (1998) för att hälften av mjöllössen ska dö (LC50, Lethal concentration). Då kan man ifrågasätta om det går att tumma på kvaliteten med bibehållen effekt. 4.5 Fortfarande oklara skillnader mellan labben Denna rapportdel har sin utgångspunkt i ett första delprojekt, där stora variationer i vitalitet redovisades från undersökningar genom kommersiella laboratorier (Nilsson et al., 2010). Det är dock inte möjligt att fullt ut utnyttja de nyvunna kunskaperna till att förklara de stora variationerna i resultat mellan olika laboratorier. Det är fortfarande oklart varför ett laboratorium får så hög vitalitet och varför man där endast gör en spädning. Vi är också 19

tveksamma till om noggrannheten är tillräcklig vid så höga utspädningar och varför man då väljer att späda så långt ner som till förväntat antal 20 CFU per platta för Botanigard ES och 2 CFU per platta för Preferal (som även testades i det försöket). För att kunna besvara frågan skulle respektive laboratoriums olika moment vid testerna behöva studeras närmare, men kanske även de olika momentens inverkan på provets homogenitet och vitalitet. De laboratorier som deltog i vitalitetsstudien i del 1 har haft möjlighet att kommentera och diskutera resultaten, men avböjt. Det är tråkigt, då vi ser att ett nära samarbete och en nära dialog är en förutsättning för att kunna förklara de stora variationerna. 5. Slutsatser Denna del av projektet (del 2) har visat att med konsekvent laboratoriearbete och ett utökat antal testomgångar, spädningsnivåer och replikat går det att uppnå acceptabel precision i vitalitetsanalysen. Det finns fortfarande en risk för enstaka stora variationer, men förhoppningsvis är de så extrema att de kan identifieras och kasseras vid utvärderingen. Undersökningarna i projektet visade att den undersökta förpackningen av Botanigard ES har en vitalitet på 16,8 ± 4,8 % (baserat på samtliga testomgångar och spädningsnivån CFU 100). Det är tveksamt om så låg koncentration ger en önskvärd biologisk effekt. Den statistiska analysen visade i detta försöket att både spädningsnivån 50 och 100 CFU ger tillräcklig noggrannhet och kan fungera som underlag för vitalitetsberäkningarna. Viktiga mått och steg i utförandet av testet, för att undvika felaktiga resultat: Utför noggrann omröring och uppmätning Genomför en preliminär spädningsserie för att finna en utspädningsnivå som ger ett lämpligt antal CFU per platta Håll uppsikt på avvikelser, som kan tyda på lipofila klumpar Genomför ett flertal testomgångar för att erhålla användbara resultat och minst 5 replikat för varje spädningsnivå 6. Referenser Butt, T. M.; Jackson, C.; Magan, N. (Eds). (2001). Fungi As Biocontrol Agents : Progress, Problems and Potential. Wallingford, Oxon, GBR: CABI Publishing, 2001. Danmarks Miljöstyrelse. (2005). Winding, A., Danmarks Miljøundersøgelser Quantification and Identification of Active Micro organisms in Microbial Plant Protection Products. Environmental Project No. 982, 2005. Elektroniskt tillgänglig; http://www2.mst.dk/udgiv/publications/2005/87-7614-521-2/pdf/87-7614-522-0.pdf (DAR) Draft Assessment Report (2008) public version Initial risk assessment provided by the rapporteur Member State Germany for the existing active substance, Beauveria Bassiana GHA, of the fourth stage of the review programme reffered to in Article 8(2) of Council Directive 91/414/EEC, Volume 1, August 2008. Nedstam, B. 2008. Personlig information. Rådgivare på Jordbruksverket, Växtskyddscentralen, Alnarp 20

Nilsson, A., Johansson, C., Svensson, S. A.(2010). Vitaliteten hos två biologiska växtskyddsmedel, del I, Slutrapport till Jordbruksverket, Elektroniskt tillgänglig; http://74.125.77.132/search?q=cache:dilaccyuvhij:fou.sjv.se/fou/download.lasso%3fid%3d Fil- 002387+Vitaliteten+hos+tv%C3%A5+biologiska+v%C3%A4xtskyddsmedel,+del+I,+Slutrap port+till+jordbruksverket&cd=1&hl=sv&ct=clnk&gl=se, Område Jordbruk - odlingssystem, teknik och produktkvalitet, SLU Alnarp, 2010 SJV (2010a.) Växtskyddsmedel i växthusgrönsaker 2010. Elektroniskt tillgänglig; http://www2.jordbruksverket.se/webdav/files/sjv/trycksaker/pdf_ovrigt/ovr86.pdf SJV (2010b.) Växtskyddsmedel i prydnadsväxtodling 2010. Elektroniskt tillgänglig; http://www2.jordbruksverket.se/webdav/files/sjv/trycksaker/pdf_ovrigt/ovr87.pdf Svensson, S.A., Nilsson, A., Lundell. J. & Löfkvist, K. (2008). Appliceringsteknik för prydnadsväxter i växthus, speciellt krukväxter. Opublicerat resultat från pågående projekt Wraight S.P., Carruthers R.I., Bradley C.A., Jaronski S.T., Lacey L.A., Wood P. and Galini- Wraight S. (1998). Pathogenicity of the Entomopathogenic Fungi Paecilomyces spp. and Beauveria bassiana against the Silverleaf Whitefly, Bemisia argentifolii. Journal of Invertebrate Pathology 71, 217-226. 21