Comparison between different freezing and thawing methods for human spermatozoa

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp, vt 2011 Comparison between different freezing and thawing methods for human spermatozoa Sandra Castillo Handledare: Julius Hreinsson Reproduktionscentrum, Akademiska sjukhuset Uppsala

ABSTRACT Preservation of cells and tissues by freezing at temperatures below 70 C has led to new possibilities for the storage of germ cells for fertility preservation. During the freezing process problems might occur, the greatest being ice crystallization which can cause membrane destruction and thus cell death. To minimize this risk, solutions that reduce the freezing point can be added to reduce crystallization and increase survival rates. These solutions are called cryoprotectants. The best method for freezing is still not known. The aim of this study was to analyze the effect of various parameters on the survival rate of human semen frozen with liquid nitrogen. The parameters investigated were thawing method (incubator or water bath) and container choice (straw or ampoule). In addition, two different cryoprotectants were tested. The method used was the instruction for preservation with Sperm CryoProtec II from Nidacon. In total 16 samples were collected for the first test and 13 samples for the second test. Sperm concentration and motility was measured. There seem to be no significant differences depending on container choice or thawing method leading to the conclusion that the most cost effective method of storage and thawing may be used. A small but significant difference was found in survival after thawing dependent on cryoprotectant p=0.041. However the study sample was limited and further studies might be of value. Keywords= Cryopreservation; sperm; ice crystallization; gradient wash; ampoule. INTRODUKTION Genom att frysa celler, embryon eller annan levande vävnad i -70 C kan det tillstånd och de egenskaper som de besatt just i det ögonblick de frystes bibehållas [1]. Ökad kunskap om frysning och tining av celler har lett till förbättrad behandling av och ökad livskvalité för många patienter. Exempel på patienter som dragit nytta av de nya och förbättrade metoderna är de med blodsjukdomar som kräver behandling med regelbundna blodtransfusioner. Nedfrysning av blod är då eftersträvansvärt, speciellt om patienten utöver sjukdomen även har en ovanlig blodgrupp. Ett lager av nedfruset blod kan bidra till att patienten kan leva ett mer normalt liv. Stamceller som fryses ned är ett annat exempel på den nytta cellfrysning möjliggjort. Leukemibehandling kan underlättas genom att stamceller prepareras och fryses ned innan påbörjad cytostatikabehandling. Cancerpatienter erbjuds också att lämna prov med könsceller för fertilitetsbevaring genom nedfrysning innan cytostatikabehandling eftersom behandlingen kan leda till sterilitet [2]. Hittills har detta endast varit en möjligt att göra för spermier från män men utvecklingen av nya metoder har gjort att även kvinnor kan erbjudas detta. Att frysa oocyter är jämfört med spermier dock inte lika vanligt då det är betydligt svårare [3]. Frysning av ovarialvävnad är fortfarande under utveckling och praktiseras endast på ett fåtal sjukhus inom Sverige. Anledningen till att spermier är enklare att frysa är att de består av nästan enbart DNA och mitokondrier med väldigt lite omgivande cytoplasma. Därtill är deras DNA mer välpackat jämfört med oocyters. Dessa egenskaper gör spermier mindre känsliga för den interna kristallisation som kan uppstå vid nedfrysningsprocessen. Iskristallbildningen är det största problemet vid cellnedfrysning och uppmärksammades speciellt vid utvecklingen av nedfrysningsmetoden. Kristallisationen uppstår både intracellulärt och extracellulärt, vilket kan leda till att celler brister. Lösningen på problemet med kristallbildning är att antingen ersätta den extracellulära vätskan med ett medel som har lägre fryspunkt som därmed inte ger iskristallsbildning vid nedfrysning lika lätt [4] eller att öka osmolaliteten utanför cellerna och 2

därmed via osmos suga ut vatten ur cellerna för att på så vis minska iskristallbildningen där. Bäst är att skydda både intra- och extracellulärt, varför ett medel som modifierar cellvätskan samtidigt som det ger skydd extracellulärt anses bättre. Medel som ger skydd på detta sätt kallas kryoprotektanter och förekommer både naturligt och för laboratoriebruk. De naturliga kryoprotektanten upptäcktes i vissa amfibier och insekter som vid temperatursänkning börjar bilda höga halter av kolhydratföreningar, främst glukos. Den förhöjda halten glukos minskar cellvätskans fryspunkt vilket gör att de kan tillbringa vintern nedfrysta [5]. Det är från denna naturliga frysförvaring som tankar om cellnedfrysning föddes och metoder samt nya kryoprotektanter för nedfrysning av hela organ med bibehållen funktion vid upptining utvecklats [6]. De kryoprotektanter som främst används inom embryologi är glycerol, dimetylsulfoxid (DMSO), propandiol och etylenglykol. Glycerol och DMSO används främst för frysning av sperma medan propandiol och etylenglykol används för oocyter och embryon. Tidigare användes ett kryoprotektant utvunnet ur hönsäggula men detta övergavs på grund av rädsla för att prioner och andra smittsamma sjukdomar skulle kunna överföras och inverka skadligt på embryona. Förutom detta är den ägguleinnehållande kryoprotektanten icke-penetrerande. Studier visar en markant försämring av DNA-kvalitet i spermier som frysts ned med äggulekryoprotektant [7], samt att spermier behandlade med detta medel medför en ökad risk för uterusinflammation i de fall kryoprotektanten inte tvättats bort innan insemination [8]. Den vanligaste icke-penetrerande kryoprotektanten som används är sukros medan medel som DMSO är penetrerande och skyddar både intra- och extracellulärt. För att minska toxiciteten samt öka effekten av kryoprotektant, används oftast en blandning av både penetrerande och icke-penetrerande medel. Förhållandet mellan dessa varierar beroende på vilken typ av vävnad och från vilken djurart vävnaden kommer [9;10]. Även om de kryoproktektanter som numera används tycks ha färre riskfaktorer än de tidigare använda medlen, diskuteras det om nedfrysning och upptining av celler påverkar cellerna på ett negativt sätt. En del studier pekar mot att cellerna och deras arvsmassa kan ta skada av nedfrysningsoch upptiningsprocessen [11;12]. Det finns även undersökningar kring skillnaden i graden av påverkan om man utgår från sperma av olika kvalité. Enligt dessa studier är det främst spermier med nedsatt kapacitet som påverkas av nedfrysningsprocesserna [13]. Fertilitetshjälp och nedfrysning av könsceller har funnits sedan 1970-talet, men då det tar år innan några studier kan utföras på de barn som föds med denna hjälp, är det svårt att avgöra om barnens utveckling påverkas. De undersökningar som hittills finns angående barn födda med hjälp av IVF (in vitro fertilisering) tyder på att det finns en liten skillnad på den kognitiva utvecklingen hos dessa barn medan den sociala utvecklingen sker normalt [14]. Detta behöver dock inte bero på själva IVFbehandlingen, utan snarare på att mödrarna oftare får flerbörd i IVF-fallen jämfört med när befruktning skett på naturlig väg. Flerbörd leder ofta till prematurbörd vilket ger en lägre födelsevikt, som kan leda till något långsammare kognitiv utveckling [15]. Denna skillnad är dock liten och utvecklingen ligger fortfarande inom normala referensintervallet [14]. På senare år har trenden ökat för antalet par som behöver fertilitetshjälp. I och med detta kan utvecklingen inom fertilitetsmetoderna antas gå framåt då ökad efterfrågan oftast leder till bättre finansiering, vilket kan användas till kvalitetsförbättring inom branschen [16;17]. Det är viktigt att metodik för nedfrysning och tining är så bra som möjligt för att kunna ge patienterna bästa möjliga behandling. Nedfrysnings- samt upptiningsmetoden utsätter spermierna för stora påfrestningar. Enligt företaget Nidacon skall överlevnadsfrekvensen vara >50% då deras 3

medium Sperm CryoProtec II används [18] men är i praktiken <50% [19]. Då resultaten skiljer sig åt har metoden på laboratoriet vid Reproduktionscentrum, Akademiska universitetssjukhuset i Uppsala, börjat ifrågasättas. Man vill därför undersöka om överlevnaden ändras genom användning av olika behållare vid nedfrysningen eller genom att utnyttja olika upptiningsmetoder. Förutom att jämföra behållartyp samt upptiningssätt, kommer även en ny kryoprotektant att jämföras med den som nu används för att påvisa om det dåliga utbytet beror på kryoprotektanten. Den nya kryoprotektanten har en högre proteinhalt, något som tros öka utbytet av spermier, genom att minska cellernas tendens att aggregera. Samma nedfrysnings metod nyttjas för den nya kryoprotektanten som för den gamla. Nedfrysningsmetoden som används i denna studie är en väl etablerad metod på laboratoriet på Reproduktionscentrums i Uppsala, och även på andra laboratorier i Sverige. Tillsättning av en kryoprotektant modifierar vätskan i och utanför cellerna vilket minskar kristallbildningen och leder till minskad förstörelse av spermiecellerna. Principen för metoden verkar via osmos; genom att successivt öka koncentrationen kryoprotektant kommer cellvätska delvis att ersättas med kryoprotektant som diffunderar in i cellerna. Eftersom cellvätskan och den extracellulära vätskan till stor del ersätts med kryoprotektant sänks fryspunkten och risken för kristallisation minskar. Efter behandling med kryoprotektant fryses cellerna i en temperaturreglerare nedsänkt i en kvävebehållare. Temperaturregleraren sänker successivt temperaturen på cellerna från 20 C till - 80 C. Cellerna kan sedan förvaras i tankar med flytande kväve (-196 C) till dess att man önskar använda spermierna för befruktning av ägg [18]. För att kunna använda spermierna till att befrukta ägg efter nedfrysning tinas dessa upp, vilket kan utföras på varierande sätt. De metoder som används i denna studie är upptining med hjälp av inkubator samt upptining i vattenbad. Upptining i inkubator sker i någon minut vid temperatur 37 C och för vattenbad några sekunder. Därefter måste spermierna genomgå en gradienttvätt, för att avlägsna kryoprotektanten samt celler som dött under nedfrysnings- och upptiningsprocesserna. En gradienttvätt genom centrifugering utförs även för färska prov innan insemination av spermier i kvinna eller tillsats till oocyt, då i syfte för att avlägsna döda celler, seminalplasma, epitelceller med mera. Det förekommer olika tvättmetoder och olika tvättmedier. Den tvättmetod som används i denna studie har enligt studier resulterat i en god överlevnadsfrekvens både med avseende på färska och frysförvarade spermieprov [20]. Gradienttvätten separerar celler efter densitet; de friska spermierna har en högre densitet än övriga celler, vilket leder till att endast de kan passera genom densitetsgradienten då provet centrifugeras. Med denna studie vill man klargöra vilka parametrar som har samband med överlevnadsfrekvensen och, om signifikanta, rekommendera en förbättrad procedur. Önskvärt skulle vara att underlätta arbetsprocessen och om skillnad i pris på kryoprotektant, ta den mest fördelaktiga. 4

MATERIAL OCH METOD Studieöversikt I studie 1 undersöktes två behållartyper, ampuller mot strån, samt upptiningsval, vattenbad eller inkubator 37 C. Samma typ av kyoprotektant användes för dessa försök, och tvättmetoden var den samma för de båda. I studie 2 jämfördes de två olika kryoprotektanterna Sperm CryoProtect II från företaget Nidacon och SpermFreeze från FertiPro *22+. Upptining skedde med 37 C inkubator, och proven delades upp efter tillsatt kroyprotektant. Därefter sögs prov upp i två strån vardera, det vill säga totalt fyra strån per ejakulat. Dessa frystes sedan enligt samma metod som studie 1. Till studie 2 erhölls också 4 förpreparerade prover vilket medförde att gradienttvätt ej utfördes på dessa efter upptining (se nedan för beskrivning av gradienttvätt samt preparering). Prov Spermieejakulat erhölls från patienter på Reproduktionscentrum, Akademiska universitetssjukhuset i Uppsala, som kommit in för enstaka analys. Proverna kasseras i vanliga fall efter undersökning varför de kan användas förutsatt att de avidentifieras. Eftersom proven avidentifierats krävdes inget etiktillstånd. Frysning av prover Material som krävs utöver normal laboratorieutrusning för analys av spermier är kryoprotektantmedelet Sperm CryoProtec II från Nidacon, maklerkammare ( Counting chamber Makler 0,01sq.mm 10µm deep, SEFI-MEDICAL INSTRUMENTS), spruta samt hygienspets (Cryovial sterile 2 ml T311-2, Simport PR/100) för att suga upp spermier i strå med, strå (CryoBioSystem CE04550) och ampuller (Cryovial sterile 2mL T311-2, Simport PR/100) för nedfrysning. Därtill fylld kvävebehållare (Cryologic Cryobath) med temperaturreglerare (Cryologic Freeze control, serienr. CL-8800i). Program 0 var inställt på Freeze control temperaturregleraren, vilket är anpassat för nedfrysning av spermier. Antal levande och döda samt det totala antalet spermier i spermaprovet analyserades enligt metodbeskrivning Metod för spermaanalys reg nr-utgåva: 353-1, som finns på Reproduktionscentrums laboratorium på Akademiska universitetssjukhuset i Uppsala. Först blandades provet väl, sedan pipetteras 5µL av provet till maklerkammare varpå spermierna räknades i mikroskop. Resultatet fördes in på protokoll Arbetsprotokoll spermaanalys reg nr-utgåva: 474-4. Efter slutförd grundanalys utfördes resterande preparering enligt Nidacons metodbeskrivning för Sperm CryoProtec II *21+ med undantag av att en gradienttvätt ej utfördes innan tillsatts av kryoprotektant. Företaget rekommenderar att en gradienttvätt utförs innan tillsatts av kryoprotektant samt nedfrysning i syfte att minimera smittrisk. (Detta steg ansågs dock inte nödvändigt eftersom provet inte skulle ges till en patient.) För varje prov fylldes två ampuller och/eller två strån; ampullerna med max 1,5mL och stråna med 0,5mL. Ampullerna märktes med datum samt testnummer. Stråna märktes med etiketter utskrivna med etikettskrivare (LABXPERT, laboratory labeling system, Brady ) även dessa med testnummer 5

samt datum. Efter upphällning och markering förseglades stråna med hjälp av en stråsmältare (CryoBioSystem, SYMS/UF 4000, serie.nr. 713). Ampullerna hade skruvlock som skruvades på. Sedan placerades dessa i cryologic frys. Beroende på om det var ampuller eller strån som frystes användes olika typ av placeringsställ för att placera dem i. När ampuller/strån satts på plats och locket lagts på startades temperaturregleraren Freeze control, varpå maskinen iakttogs för att se att temperaturen började sjunka för att vara säker på att processen startat som den skulle. Program 0 som förinställts, hade en starttemperatur på 20 C varpå temperaturen sänktes med 0,5 C/min tills temperaturen 5,0 C uppnåtts. Då sänktes temperaturen med 8,0 C/min tills -40,0 C uppnåtts, därefter med 6,0 C/min tills -60,0 C följt av, 5,0 C/min tills - 70,0 C och slutligen med 3,0 C/min tills -80,0 C erhållits. Frysningsprocessen tog ungefär en timma totalt varpå materialet överfördes till speciella förvaringstankar (HC35, high capacity, TW Taylor Wharton) med flytande kväve (-196 C), där kunde de förvaras tills upptining. Preparation av spermier efter frys För att underlätta arbetsgången förbereddes ett ställ med 3 stycken rör, ett för provet, ett för gradientlösningen (till frysta prov skall PureSperm gradienten vara 80 % och 40 %), och ett med 5mL SpermWash. I rör 1 förbereddes gradienten genom att först tillsätta 1,5mL PureSperm 80 % Nidacon (finns färdigspädd på laboratoriet) och därefter försiktigt tillsätta 1,5mL av den 40 % lösningen ovanpå. PureSpermlösningarna är spädda med SpermBuffer för att erhålla rätt koncentration. Samtliga medel kommer från företaget Nidacon. Preparationen utfördes enligt laboratoriets metodbeskrivning Diskontinuerlig täthetsgradientcentrifugering reg nr-utgåva: 267-4. Prov tinades antingen i inkubator under några minuter(varierar beroende på provvolymen) eller någon minut i vattenbad. Därefter blandades och räknades provet med maklerkammare och resultatet antecknas i det protokoll som används vid nedfrysning för samma prov. Sedan pipetterades provet försiktigt på gradientlösningen varpå det centrifugeras vid 300g i 20min, varefter supernatanten sögs av tills det endast kvarstod 1mL vätska i provröret. Från den kvarvarande vätskan pipetterades 750µL upp från botten så att all pellet kom med och volymen överfördes till röret med SpermWash. Detta rör centrifugerades i 10min vid 500g. Även efter denna centrifugering sögs supernatanten av tills 1mL kvarstod varpå pelleten slammades upp och 5µL pipetterades till en maklerkammare för avslutande räkningen i mikroskop. Resultaten antecknades återigen i protokoll Arbetsprotokoll spermaanalys reg nr-utgåva: 474-4 som används vid nedfrysning. Det gjordes några undantag från metodbeskrivningen; endast en tvätt i SpermWash utfördes (vanligtvis upprepas tvätt i SpermWash så att totalt två tvättar uppnås) samt att det togs 750µL av provet efter gradienttvätt samtliga gånger (vid rutinlaboratoriet anpassas alltid volymen efter storleken på pelleten), och efter uppslamning och räkning på maklerkammare så avslutades analysen. 6

Statistiska analyser Vid analys av data användes två olika analyser i Excel, parat tvåsidigt t-test för medelvärde samt två faktors ANOVA båda vid en 95 % signifikansnivå. Genom att ställa upp värdena från analysundersökningarna för samtliga test kan dessa metoder analysera data så att bland annat p- värde, varians och medelvärdet fås. RESULTAT Studie 1. Undersökning av behållartyp och upptiningsmetod Vid undersökningen av hur behållartyp och upptiningsmetod påverkar överlevnadsfrekvensen hos spermier erhölls totalt 16 prov. Varje prov (färskt ejakulat) delades upp i två delar. Från den ena delen togs två ampuller och från den andra delen av provet togs två strån. Ett prov från vardera grupp tinades i vattenbad respektive inkubator, se Figur 1. Figur 1. Schematisk bild över uppdelning av de 16 prov som användes för analysen. Varje prov delades på fyra varav två till ampuller och två till strån. Från varje prov tinades en ampull och ett strå i vattenbad samt en ampull och ett strå i inkubator. Totalt tinades 16 ampuller samt 16 strån i vattenbad och samma antal i inkubator. För att jämföra behållartyp och upptiningsmetod användes parat tvåsidigt t-test för medelvärde på en 95 % signifikansnivå, p-värdet vid jämförelse av vattenbad mot inkubator för samtliga test var >0,05, se Tabell 1. 7

Miljoner/mL Miljoner/mL Tabell 1. Sammanfattning av resultat från t-test på 95 % signifikants nivå för spermiekoncentration före och efter preparation samt för de två olika behållartyperna, strån och ampuller. Inga signifikanta skillnader noterades mellan vattenbad och inkubator i något av behandlingsstegen. Behållartyp/Behandling Vattenbad Inkubator P(T<=t) tvåsidig Konc.(milj/mL) ± SD Konc.(milj/mL) ± SD Före preparation Strå 49,7± 35,6 46,4± 32,1 0,710 Före preparation 45,8 ± 44,7 42,4 ± 36,1 0,681 Ampull Efter preparation Strå 0,3 ± 0,4 0,2 ± 0,2 0,279 Efter preparation Ampull 0,5 ± 0,7 2,1 ± 5,2 0,263 Behållartyp; ampuller jämfört med strån I analysen testades om någon skillnad kunde noteras i koncentration motila spermier före respektive efter nedfrysning och upptining följd av gradienttvätt för de två behållartyperna strån och ampuller. ANOVA för testgrupperna gav resultatet att ingen signifikant skillnad kunde påvisas vid jämförelse av koncentrationen motila spermier för ampull och strån innan gradienttvätt, p=0,613. Samma gäller för jämförelse efter gradienttvätt, p=0,056, se Figur 2. A B 9,9 9,0 13,7 9,2 0,47 0,18 0,11 0,25 Strå Ampuller Strå Ampuller Figur 2. Graferna visar medelvärde för koncentrationen motila spermier före (A) samt efter (B) nedfrysning och utförd gradienttvätt. Gula staplar representerar strån (vattenbad respektive inkubator) och gröna staplar ampuller (vattenbad respektive inkubator). Svarta staplar visar standardavvikelsen. Totalt analyserades 16 prov. Tiningstyp; inkubator jämfört med vattenbad ANOVA för koncentrationen motila spermier från strån och ampuller före samt efter gradienttvätt tydde på att ingen signifikant skillnad beroende på tiningssätt förekom, p= 0,502 respektive 0,493, se Figur 2. Att skillnaden mellan proven är små framgår även visuellt i figuren, de gula staplarna som 8

Miljoner/mL Miljoner/mL representerar strån är i princip lika stora och det samma gäller för de gröna staplarna som representerar ampullerna. Studie 2. Undersökning av kryoprotektant För undersökningen av de två olika kryoprotektanten, Sperm CryoProtect II och SpermFreeze användes totalt 13 prov, varav 9 var prov som inte blivit behandlade på något sätt innan nedfrysning och 4 stycken var preparerade innan nedfrysning, (se studieöversikt). Resultat efter bearbetning av de 9 lika proven visade ingen signifikant skillnad mellan de olika kryoprotektanten. Från t-test erhölls p-värde= 0,988 vid jämförelse innan nedfrysning och p=0,272 efter nedfrysning av koncentrationen motila spermier. Jämförelse av den totala koncentrationen spermier erhöll p-värde= 0,266 innan nedfrysning och 0,389 efter nedfrysning. Ingen signifikant skillnad mellan grupperna syntes alltså. Se Figur 3. A B 52 86 66 58 18 18 0,2 0,2 1 0,3 Cryo.f. Freeze.f. Cryo.e. Freeze.e. Cryo.f. Freeze.f. Cryo.e. Freeze.e. Figur 3. Graf (A) visar medelvärdet för koncentrationen motila spermier och (B) medelvärdet för den totala spermiekoncentrationen. Figuren visar data för de 9 prov där två olika kyoprotektant undersökts. Grön stapel representerar de färska proven, blå staplar de prov där kryoprotektanten Sperm CryoProtect II tillsatts, där den vänstra stapeln är innan nedfrysning och preparation. Gula staplar representerar de prov där det tillsatts SpermFreeze, även i detta fall är den vänstra stapeln innan preparation och nedfrysning. Vid jämförelse av koncentrationen motila spermier för prover som tinats, påvisades det en signifikant högre överlevnad för de med Sperm CryoProtect II tillsatt, med p=0,044. Före nedfrysning syntes ingen signifikant skillnad, p=0,423. Det samma gällde för den totala spermiekoncentrationen p=0,041 efter och p=0,948 före nedfrysning. Se Figur 4. 9

Miljoner/mL Miljoner/mL A B 5,7 1,5 2,1 2,9 0,7 6,3 4,9 4,8 3,9 1,4 Cryo.f. Freeze.f. Cryo.e. Freeze.e. Cryo.f. Freeze.f. Cryo.e. Freeze.e. Figur 4. Graf (A) visar medelvärdet för koncentrationen motila spermier och (B) medelvärdet för den totala spermiekoncentrationen. Figuren visar data för de 4 prov där två olika kyoprotektant undersökts. Grön stapel representerar de färska proven som tvättats i en gradienttvätt, blå staplar de prov som kryoprotektanten Sperm CryoProtect II tillsatts, varav den vänstra stapeln är innan nedfrysning och den högra efter upptining. Gula staplar representerar de prov som det tillsatts SpermFreeze, även i detta fall är den vänstra stapeln innan nedfrysning och den högra efter upptining. DISKUSSION Kryopreservering är en vida brukad metod inom forskning och sjukvård. Dock är metoden inte helt enkel med många problem såsom iskristallisation, vilket förstör celler och kan uppstå under processen. Det är därför önskvärt att undersöka metodik vid nedfrysning och upptining av spermier i syfte att maximera utbytet vid förvaring. Undersökningar av spermiers överlevnadsförmåga görs främst på donatorspermier, men fynden man erhåller genom dessa studier har inte bara betydelse i donationsfrågan. Resultaten har även stor vikt för fertilitetsbevarande åtgärder för cancerpatienter. I denna studie testades upptiningsmetodik, snabb eller långsam, typ av behållare, strå eller ampull samt två kryoprotektanter. Förväntan på denna undersökning var att det skulle finnas en skillnad mellan de olika upptiningssätten eftersom studier gjorda i ämnet lutar mot att överlevnaden är högre vid en snabb upptining [24]. Ett fåtal undersökningar av upptiningsmetodiken har utförts på Reproduktionscentrum i Uppsala utan definitiva resultat (intern laboratorieutredning) varför man ville jämföra överlevnadsfrekvensen av spermier vid snabb respektive långsam tining. Förväntat var även att ampuller skulle ge större överlevnad på grund av den större skyddande volymen samt att en kryopretektant med protein skulle ge lägre aggregering av spermierna och därmed högre överlevnad. Flera studier har undersökt nedfrysningsprocessen, framförallt om snabb eller långsam nedfrysning påverkar spermierna mest. Somliga studier visar att en snabb frysning är att föredra [25], men de flesta studier tyder på att en långsam, mer reglerad process är att bättre [26;27]. Därför används vanligtvis en reglerad nedfrysningsprocess, vilket även är fallet på Reproduktionscentrum i Uppsala. 10

Utifrån iakttagelser under arbetets gång kunde inga tydliga skillnader mellan upptiningssätten påvisas, utan det tydde mer på en variation från prov till prov än mellan upptiningssätt. En skillnad beroende på vilken behållartyp som användes vid nedfrysningen kunde däremot påvisas. Koncentrationen var högre för ampuller, vilket kan förklaras med att volymen för ampuller var större och vid centrifugering erhölls en högre koncentration, något som var svårt att korrigera för vid bearbetningen av data. Eftersom ingen signifikant skillnad kunde påvisas borde inte behållartyp eller upptiningssätt ha någon inverkan på överlevnadsfrekvensen. Dock kan det låga antalet prover (16) som erhölls till försöket ge missvisande resultat. Det är möjligt att en större studie kan ge ett annat resultat. Överlevnadsfrekvensen är starkt varierande mellan individer vilket observerades under både denna arbetsprocess men även vid andra undersökningar [28]. Från donatorer som från början har prov med hög koncentration motila spermier kan ibland erhållas en lägre koncentration efter nedfrysning och preparation än från de donatorer som från början hade en lägre koncentration. Utbytet är ibland så dåligt att prov med från början god kvalitet efter behandling inte längre uppfyller de nödvändiga kriterierna, och dessa personer kan därmed inte bli donatorer trots att deras färska prov mer än väl uppfyllde kraven *29+. Efter att behållartyp och upptiningssätt undersökts, jämfördes två olika kryoprotektant mot varandra, Sperm CryoProtec II från Nidacon och SpermFreeze från FertiPro, för att även här undersöka överlevnadsfrekvensen. En skillnad som specifikt fanns i åtanke var att Sperm CryoProtec II, som man använt sedan en tid på laboratoriet, inte innehåller några proteiner, medan SpermFreeze innehåller 0,4 % humant serumalbumin. En hypotes var att spermierna lättare aggregerar i frånvaro av protein. Detta undersöktes speciellt eftersom det upptäcktes att pelleten blev svår att suspenderad efter den sista centrifugeringen av provet vid behandling med Sperm CryoProtec II. Resultaten påvisar ingen signifikant skillnad för de 9 prov som frysts ned innan gradienttvätt, vare sig i avseende på koncentrationen av motila spermier eller av den totala spermiekoncentrationen, se Figur 3. För de fyra prov som preparerats, det vill säga tvättats innan frysning kunde en viss skillnad visas i överlevnaden av de motila cellerna och den totala koncentrationen spermier efter tvätt (p<0,05), se Figur 4. I detta fall var överlevnaden något högre för prov med Sperm CryoProtec II tillsatt. Dock är provantalet litet och slumpvisa variationer kan ha stor inverkan på slutresultatet. För att utveckla studien av behållaretyp skulle det vara bra om man från början satte en viss volym som skall erhållas för vardera behållare, till exempel totalt 1mL för ampull och 1mL för strån och räkna flera strån per ampull. I den här studien togs det största möjliga hänsyn till det vid bearbetning av data, men jämförelser mellan behållartyper hade underlättats om man hade haft samma volym i båda provgrupperna. Vad det gäller undersökning av kryoprotektanten skulle det vara intressant att se om det ger någon större skillnad mellan Sperm CryoProtec II och SpermFreeze i de fall man preparerat proven innan nedfrysning. I våra resultat erhölls en viss skillnad men eftersom provantalet var så lågt i denna studie (på grund av tidsbrist), skulle det vara intressant att undersöka om skillnaden kvarstår även vid en större provgrupp. 11

Sammanfattningsvis kan ingen skillnad noteras med avseende på antal överlevande celler för behållartyp eller upptiningsmetod. Slutsatsen blir här därför att den mest praktiska och kostnadseffektiva metoden för förvaring och upptining av spermaprov bör användas. Jämförelsen mellan de två kryoproteknanterna Sperm CryoProtec II och SpermFreeze utföll till den förres fördel vilket även var den som användes vid laboratoriet. Trots att studien var liten blir därför rekommendationen att fortsätta använda Sperm CryoProtec II. ACKNOWLEDGEMENTS Jag skulle vilja tacka alla på reproduktionscentrum, då speciellt min handledare Julius samt laboratoriepersonalen som varit ett stort stöd under både den praktiska och teoretiska delen av arbetet. Dessutom vill jag tacka Cassandra och Maria mina opponenter vilka hjälpt till med att komma med många synpunkter, främst på den skriftliga rapporten. Slutligen vill jag tacka min pojkvän Anders som gett stöd på många plan under detta arbete. REFERENSER 1. www.ki.se http://mesh.kib.ki.se/swemesh/show.swemeshtree.cfm?mesh_no=e01.450.865.366.156. [Online] [Citat: den 28 Februari 2011.] 2. www.akademiska.se. www.akademiska.se/templates/page 43111.aspx. [Online] [Citat: den 8 mars 2011.] 3. www.akademiska.se. www.akademiska.se/templates/page 43688.aspx. [Online] [Citat: den 10 mars 2011.] 4. Rall WF, Fahy GM. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 C by vitrification. Nature. 313, den 14 February 1985, Vol. 6003, ss. 573-575. 5. Feder ME, Burggren WW. Environmental physiology of the amphibians. Chicago : The University of Chicago Press, Chicago 60637, 1992. s. 267. 0-226-23944-6. 6. Storey KB. Biochemistry of natural freeze tolerance in animals: molecular adaptations and applications to cryopreservation. Biochemistry and cell biology. 68, April 1990, Vol. 4, ss. 687-98. 7. Kumar R, Jagan Mohanarao G, Arvind, Atreja SK. Freeze-thaw induced genotoxicity in buffalo (Bubalus bubalis) spermatozoa in relation to total antioxidant status. Molecular Biology Reports. den 19 September 2010, Vol. 38, 3, ss. 1499-1506. 8. Ribeiro AP, Vicente WR, Apparício M, Gadelha CR, Alves AE, Covizzi GJ. Uterine leucocyte infiltration after artificial insemination in bitches. Theriogenology. 6-7, October 2006, Vol. 66, ss. 1462-1464. 9. Gook DA, Osborn SM, Johnston WI. Cryopreservation of mouse and human oocytes using 1,2- propanediol and the configuration of the meiotic spindle. 7, Australien : Human reproduction, Juli 1993, Vol. 8, ss. 1101-9. 10. Wusteman MC, Pegg DE, Robinson MP, Wang LH, Fitch P. Vitrification media: toxicity, permeability, and dielectric properties. 1, York : Cryobiology, Februari 2002, Vol. 44, ss. 24-37. 12

11. Pribenszky C, Vajta G. Cells under pressure: how sublethal hydrostatic pressure stress treatment increases gametes' and embryos' performance. Reproduction, Fertility and Development. 23, 2011, Vol. 1, ss. 48-55. 12. Trapphoff T, El Hajj N, Zechner U, Haaf T, Eichenlaub-Ritter U. DNA integrity, growth pattern, spindle formation, chromosomal constitution and imprinting patterns of mouse oocytes from vitrified pre-antral follicles. Human Reproduction. 12, den 25 December 2010, ss. 3025-42. 13. Ahmad L, Jalali S, Shami SA, Akram Z, Batool S, Kalsoom O. Effects of Cryopreservation on Sperm DNA integrity in normospermic and four categories of infertile males. Systems biology in reproductive medicine. 56, Februari 2010, Vol. 1, ss. 74-83. 14. Socialstyrelsen. Assisterad befruktning - Uppföljning av barn som nått skolåldern. Linköping : LTAB, Linköpings Tryckeri AB, augusti 2001, 2001. s. 24. 91-7201-543-8. 15. Hreinsson J, Hamberger L, Hardarson T, [red.]. Infertilitet - Utredning och behandling genom assisterad befruktning. Lund : Studentlitteratur, 2005. ss. 186-187. 91-44-03867-4. 16. Hreinsson J, Hamberger L, Hardarson T, [red.]. Infertilitet- Utredning och behandling genom assisterad befruktning. Lund : Studentlitteratur, 2005. ss. 190-191. 91-44-03867-4. 17. www.dn.se. http://www.dn.se/nyheter/vetenskap/kraftig-okning-av-antaletprovrorsbefruktningar. [Online] [Citat: den 24 Mars 2011.] 18. www.nidacon.com. www.nidacon.com/spermcryoprotec/spermcryoprotec-ifu.pdf. [Online] [Citat: den 8 mars 2011.] 19. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5. 2010. s. 183. 978 92 4 154778 9. 20. Allamaneni SS, Agarwal A, Rama S, Ranganathan P, Sharma RK. Comparative study on density gradients and swim-up preparation techniques utilizing neat and cryopreserved spermatozoa. Cleveland : u.n., den 7 mars 2005, Asian journal of andrology, Vol. 1, ss. 86-92. 21. www.nidacon.com. http://nidacon.com/spermcryoprotec/spermcryoprotec-ifu.pdf. [Online] [Citat: den 8 mars 2011.] 22. www.fertipro.com. www.fertipro.com/index.php?page=media&sub=spf. [Online] FertiPro N.V. [Citat: den 18 april 2011.] 23. http://www.youtube.com/watch?v=f66wecusrc0. [Online] [Citat: den 12 Maj 2011.] 24. Barth AD, Bowman PA Determination of the best practical method of thawing bovine semen. 4, Canada : The Canadian veterinary journal, April 1988, Vol. 29, ss. 366-9. 25. Vutyavanich T, Piromlertamorn W, Nunta S. Rapid freezing versus slow programmable freezing. 6, Thailand : American Society for Reproductive Medicine, April 2010, Fertility and Sterility, Vol. 93, ss. 1921-1928. 13

26. Stanic P, Tandara M, Sonicki Z, Simunic V, Radakovic B, Suchanek E. Comparison of protective media and freezing techniques for cryopreservation of human semen. 1, Croatia : European journal of obestetrics, gynecology, and reproductive biologi, Juli 2000, Vol. 91, ss. 65-70. 27. Petyim S, Choavaratana R. Cryodamage on sperm chromatin according to different freezing methods, assessed by AO test. 3, Thailand : Journal of the medical association of Thailand, Mars 2006, Vol. 89, ss. 306-16. 28. Centola G M., Raubertas R F, Mattox JH. Cryopreservation of human semen. Comparison of cryopreservatives, sources of variability, and prediction of post-thaw survival. 3, New York : Journal of andrology, 1992, Vol. 13, ss. 283-288. 29. www.lio.se. http://www.lio.se/. http://www.lio.se/verksamheter/barn-och- kvinnocentrum/kvinnoklinikerna-i-ostergotland-/reproduktionsmedicinskt-centrum- RMC/Spermadonation/. [Online] [Citat: den 11 Maj 2011.] 14