IMPACT OF CRYOPRESERVATION MEDIA ON SPERM MOTILITY

Transkript

1 Institutionen för kvinnor och barns hälsa Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 högskolepoäng IMPACT OF CRYOPRESERVATION MEDIA ON SPERM MOTILITY Stephanié Petersen Handledare: Julius Hreinsson, Laboratoriechef Reproduktionscentrum, Akademiska sjukhuset Uppsala 1

2 ABSTRACT The result of cryopreservation of semen is crucial for patients in need of fertility preservation. The cryopreservation method is not optimized since only 10 % the sperms are expected to survive the treatment. The sperms are exposed to many risk factors such as oxidative stress, osmotic chock and ice crystallization. To minimize the risks, use of cryoprotectants is needed. The use of cryoprotectants helps the cell to dehydrate as penetrating cryoprotectants can create space between ice crystals and cell membrane. Two studies were performed. In study one, two different freezing medias (SpermFreeze solution and Cryoprotect II effect on sperm motility after freezing in were compared). Study two investigate whether the motility were best preserved if semen froze with all the contents of the ejaculate or if the sample should be concentrated, with removal of seminal plasma, epithelium cells and dead sperm cells by gradient centrifugation. The project was performed according to recommended instructions for each freezing media. In total, 55 samples were collected for the first study and 23 samples were collected for the second study. The sperm motility was measured both before freezing and after thawing. The Cryoprotect II medium preserved the cells better than the SpermFreeze medium (p=0,006). Using SpermFreeze, higher rate of motility was obtained when centrifugation were performed before freezing (p=0,033), while this was not observed when using Cryoprotect II (p=0,055). In conclusion Nidacon preserved sperm more effectively than Vitrolife freeze medium. Vitrolife s freezing medium preserved the samples better if centrifugation were performed before freezing. Nidacons freezing medium gave the same result for the samples no matter centrifugation were performed before or after freezing. keywords: Osmatic chock; Cryopreservation; Gradient centrifugation; Sperm progression 2

3 INTRODUKTION Vart femte par har någon gång i livet svårigheter att få barn. Mannen är orsaken i 25 % av fallen. 1 Mannens spermier kan vara av dålig kvalitet, total avsaknad av spermier eller på grund av tubal patologi kvarvarande i sädesledaren. Fertiliteten avtar med åldern, för kvinnor börjar det redan vid 30 års ålder. Barnlöshet kan även bero på faktorer som inte kan åtgärdas, exempelvis medfödd avvikelse eller sjukdom. Barnlöshet har även kopplats till en del livsstilsfaktorer som kan påverka fertiliteten, bland annat rökning och högt BMI [1,2]. Fertilitetskliniker arbetar för att hjälpa ofrivilligt barnlösa patienter genom olika fertilitetsbehandlingar. Kvalitén på mannens spermaprov utreds så att rätt assisterad reproduktionsbehandling väljs ut till paret. Kvinnan genomgår sedan en follikelstimulerande hormonbehandling och varpå ett ägguttag sker. Mannen lämnar samtidigt ett sperma prov till kliniken som därefter tillsätts till kvinnans ägg. För män utan spermier i ejakulatet eller med obstruktion i sädesledaren används metoderna Perkutan Epidumal Sperma Aspiration (PESA) eller Testikel Sperma Extraktion (TESE). Vid obstruktion i sädesledaren används PESA. En smal nål aspirerar sperman ur sädesledaren. Vid avsaknad av spermier i ejakulatet är TESE ett alternativ. En liten biopsi av sädesledarens tubuli tas. Vävnaden tvättas och centrifugeras för att lyckas isolera ett fåtal spermier. Fertilitetskliniker erbjuder även fertilitetsbevaring för både män och kvinnor där gameterna frysförvaras. De män som önskar fertilitetsbevaring är ofta de som senare inte har tillgång till fler spermier. Till exempel transexuella patienter genomgår ett könsbyte och könscellproduktionen upphör därefter. Det gäller även patienter som ska behandlas med kemofarmaka eller strålbehandling och därför riskerar att skada sin könscellproduktion. 1 Infertility, Emre S 3

4 Cancerbehandling är inte tillräckligt styrd för att endast riktas mot de sjuka cellerna, könscellerna skadas och risken för sterilitet är stor. Dessa patienter kan gå till en fertilitetsklinik och frysa ned sina könsceller som fertilitetsbevarande åtgärd. Nedfrysning av spermier är även aktuellt för par som behöver donerade spermier som lagras i frys, för män som genomgått PESA behandling och för män som önskar fertilitetsbevaring på grund av olika medicinska anledningar. PESA utförs så få gånger som möjligt för att minimera riskerna med ingreppet. Om en stor mängd spermier aspirerats under ingreppet att det efter fertilitetsbehandling finns ejakulat kvar, fryses den resterande mängden ned. Vid nedfrysning av donerade spermaprover fryses hela spermaprovet ned, varken seminalplasman eller infertila spermier avlägsnas från provet. När spermierna ska användas tinas de upp i 37 o C vattenbad och därefter genomgår prover gradientseparation och två tvättar inför fertilitetsbehandling. Reproduktionscentrum har donationsverksamhet där donerade gameter frysförvaras. För att bli donator utreds individen av en läkare och en kurator. Provets spermiemotilitet (rörlighet), morfologi och överlevnadsfrekvens efter frysning och upptining bör vara höga. Morfologin utvärderas enligt World Health Organisations föreskrifter där dem beskriver en normal, potentiellt fertiliserande spermie. Spermien ska ha ett slätt och ovalt huvud. Det bör finnas en väldefinierad akrosomal region som tar upp % av huvudarean. Akrosomala regionen bör inte innehålla någon stor vakuol. Mittendelen ska vara smal och samma längd som huvudet. Svansen ska vara tunnare än mitten delen, ca 45µm lång (ca 10 gånger så lång som huvudet) samt inte skarpt vinklad åt något håll 2. 2 WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 5th edition 4

5 Spermier lagras i bitestikeln. Under passagen genom epididymis sker första mognadssteget, där aktiveras spermiens motilitet samtidigt som spermiens plasmamembran bekläds av proteiner. I mån om att förhindra för tidig akrosomreaktion binds glykoproteiner och kolesterol in. Akrosomen är ett yttre skikt frampå spermiens huvud där enzymer lagras. I kvinnliga könsorgan blir spermier hyperaktiva och får kapacitet att binda till oocyten. I plasmamembranet minskar koncentrationen av kolesterol och glykoproteiner, beklädningen faller av och spermien har möjlighet att binda till en oocyt 3. Tyrosinfosforylering av ett antal proteiner uppregleras och en hög koncentration av intracellulär camp induceras som i sin tur reglerar kalcium jonkanaler [3]. Permeabiliteten för Ca 2+ ökar och en hög intracellulär koncentration av Ca 2+ tar vid. Akrosomreaktionen är beroende av att Ca 2+ är närvarande. Spermien producerar en rad enzymer som frigörs när spermien genomgår akrosomreaktion. Enzymet hyaluronidas underlättar spermiens passage fram till ägget. Akrosin bryter ned zonapellucida och spermien kan penetrera 3. Först när spermien fästs till äggets ytglykoproteiner (ZP1, ZP2 och ZP3) startar akosomreaktionen och spermien kan ta sig igenom zonapellucida för att nå oolemmat (oocyt membranet). CD9 och GPI är oolemmaproteiner som spermien binder sig till för penetrering och befruktning av oocyt [3]. Om spermien lyckas fertilisera ägget hårdnar Zona Pellucida, vilket förhindrar polyspermi. Äggets membranpotential förändras och endoplasmatiska retikulet frisätter Ca 2+. Glykoproteinerna ZP2 och ZP3 faller av och ingen ny spermie kan binda in och penetrera [4] 4. Volym på ejakulat och koncentration av spermier varierar mellan individer och inom individen vid olika tillfällen. Koncentrationen spermier styrs bland annat av testikelvolymen och abstinenstiden. Sannolikheten för graviditet korrelerar med en spermakoncentration på 3 In Vitro Fertilization, Elder K och Dale B 4 In Vitro Fertilization, Elder K och Dale B 5

6 45-50 miljoner motila spermier/ml, dock finns det infertila män med högre koncentration än så [5]. Motiliteten är direkt länkad till spermiekvalitén. Koncentrationen motila spermier påverkas negativt av genitala infektioner, åderbrock i pungen samt oxidativ stress [5]. Oxidativ stress är en biokemisk process där cellens egenproducerade reaktiva syreföreningar skadar celler och organ [1]. Volymen ejakulat kan vara stor men dock innehålla en låg koncentration spermier. Mängden seminalplasma och epitelceller ökar volymen, men inför behandlingar är de motila spermierna av intresse. Genom gradientseperation avlägsnas de omogna, morfologisk onormala spermierna och seminalplasma från provet. Seminalplasman kan förhindra spermiens fertiliseringskapacitet in vitro och därför måste spermier snabbt och effektivt separeras från plasman. Mogna, morfologisk normala spermier har en densitet kring 1,12 g/ml och omogna spermier utan inre och yttre akrosomala membran har en densitet mellan 1,06 och 1,09 g/ml [6,7]. Densitet och storleksskillnaden mellan mogna och omogna spermier utnyttjas för att skilja dem åt. Ett kolloidalt-silikatäckt preparat i två olika koncentrationer används, 40 % och 80 % där den senare har densiteten 1.10 g/ml vilket endast mogna spermier kan passera. Under centrifugeringen förflyttas de mogna spermierna ned i botten av röret [6]. Möjligheten att behålla livets funktion och struktur identiskt innan och efter frysning lyckades år 1949 av Polge et al med hjälp av små, ofrysbara molekyler som kallas kryoprotektanter. Vatten är största beståndsdelen i celler och när vattnet fryser bildas iskristaller. Iskristaller bildas under frysning och tar hål på organeller och cellmembran [8]. Samtliga kryoprotektanter är vattenlösliga då de har en hydroxylgrupp som kan bilda vätebindningar med vatten. Allt eftersom isen fryser packas celler in i mindre och mindre fickor av ofryst vätska. Det finns två typer av kryoprotektanter, penetrerande och icke-penetrerande. En penetrerande kryoprotektant har en mindre molekylvikt än 100 dalton, eftersom små 6

7 molekyler lättare tar sig igenom cellmembranet. Närvaro av penetrerande kryoprotektanter skapar rum mellan iskristaller och organeller genom att själva inte kunna frysa. Större rum kring iskristaller ökar överlevnaden för cellen och minskar risken för form och frysskador [8,9]. Vid temperatur under -100 o C stelnar den ofrysta vätskefickan och celler kan överleva infrysning genom att existera innanför den glasaktiga ytan mellan iskristaller [9]. Ju mer penetrerande kryoprotektant som tillsätts desto mer ofryst volym förekommer i slutet av frysningen. En penetrerande protektant reducerar också celldehydrering under frysning. Icke-penetrerande kryoprotektanter som sukros och manitol är större molekyler. Dessa inhiberar isbildning genom att öka det extracellulära osmotiska trycket varvid vattnet förflyttas ur cellen. Den icke-penetrerande kryoprotektanten anses vara mindre toxisk för cellen jämfört med penetrerande [8]. Dessa två typer bör användas i kombination med varandra då koncentrationen av penetrerande kryoprotektant kan minskas. Proceduren kryoprotektion kan beskrivas som en process där vattenmolekyler ersätts av ofrysbara molekyler [9]. Nyligen upptäcktes det att ämnen som bildar starka vätebindningar i människokroppen är giftiga, detta är troligen för att de orsakar rubbning av vätebindningarna [8]. Trots det verkar kryoprotektanter för högre överlevnad och bevarad membranintegritet för cellerna. Inom embryologi används främst glycerol som kryoprotektant för frysning av spermier. Glycerol är väldigt giftig för en cell, men i kalla temperaturer underlättar glycerol för cellens överlevnad. Utöver kryoprotektanter behöver ett frysmedium innehålla en del grundkomponenter så att cellerna får det stöd som krävs för överlevnad. Det krävs en buffert som behåller fysiologisk ph så cellernas metabolism kan fortgå. Salter och andra osmotiska partiklar, näringsämnen och antibakteriella medium behövs för spermiens överlevnad. Cellerna löper en stor risk för osmotisk chock om vatten flödar förhastigt in i cellen under upptining. Detta kan undvikas 7

8 genom använda icke penetrerande substanser, exempelvis glukos, som verkar som en osmotisk buffert [9]. Efter frys- och upptiningsproceduren minskar koncentrationen motila spermier avsevärt och dessutom minskar totalkoncentration av spermier. Det beror på att en stor mängd av spermierna genomgår nekros och totala antalet spermier minskar. Det är därför viktigt att frysning och upptining av cellerna sker framgångsrikt och att celler tar så liten skada som möjligt. Syftet med studien är att undersöka om det föreligger en signifikant skillnad mellan de två olika frysmedium samt hur spermiens överlevnad påverkas av att gradientcentrifugering utförs före eller efter frysprocessen. METOD OCH MATERIAL Studiematerial Två typer av prover användes i studien, dels manliga patienters lämnade prover till fertilitetsbehandling (n=55) och dels utredningsprover som lämnats för att undersöka fertiliseringskapaciteten hos mannen (n=23). Utredningsproverna frystes ned både ocentrifugerade och centrifugerade (opreparerat och preparerat) varpå 625µl sparades opreparerat och resten koncentrerades med gradientcentrifugering. Samtliga prover erhölls från patienter till Reproduktionscentrum, ingång 96 på Akademiska sjukhuset. Proverna insamlades mellan februari och maj Eftersom proverna avidentifierades krävdes inget etiktillstånd för studien. 8

9 Studieöversikt Två delstudier utfördes i detta projekt. I den första delstudien undersöktes vilket frysmedium som gav högst överlevnadsfrekvens efter frys- och upptiningsproceduren. I den andra delstudien undersöktes det om gradientbehandling före eller efter frysning är mest gynnsamt för spermiers överlevnad. Spermiernas överlevnad undersöktes för båda studierna med hjälp av Maklerkammare med mikroskop i 100x förstorning där de motila spermierna räknades. Gradientcentrifugering PureSperm 80 % (Nidacon PS80-100) sattes till rör med konformad botten (ThermoFisherScientific) Därefter pipetterades 40 % Puresperm (NidaconPS80-100) försiktigt ovanför och sedan tillsattes spermier långsamt för att bilda tre skikt. Röret centrifugerades i 20 min x 300 g. Supernatanten pipetterades av och kastades och 1 ml av ejakulatet lämnades kvar. En pasteurpipett fördes ned i botten och det nedersta skiktet sögs upp och fördes över till nytt rör med koniskbotten varpå 5 ml tvättbuffert (Nidacon PSW- 100) tillsattes varefter provet centrifugerades 10 min x 500 g. Supernatanten pipetterades åter bort och 1 ml innehållande spermiefraktionen lämnades kvar. Två olika frysmedier användes, NidaconCryoprotect II (SCP-020) spädd 1:3, till 500 µl som var den totala stråvolymen, Vitrolife SpermfreezeSoloution (90137) var spädd 1:2 Frysning av spermier: Vid frysning av spermier i NidaconsCryoprotect II tillsattes 125 µl frysmedium till 375µL spermiefraktion. Röret vändes 20 gånger upp och ned. I änden av frysstråt med stoppning fästes sprutan (Braun, 1 mltuberkulint v) och gul pipettspets (Cryo Bio System ) fästes i andra änden, OPU nummer kontrollerades och 500 µl ejakulatet aspirerades in i strået och därefter ställdes in i kylskåp i min. Stråna lades på en floater (frigolitbit) 9

10 över flytande kväve i 30 min och fördes sedan ned i flytande kväve och bevarades i kvävetank. Samtliga strån tinades tidigast 24 h efter frysning. Vitrolifes medium tillsattes droppvist till spermiefraktionen. Röret vändes upp och ned och fick stå i rumstemperatur i 10 min. Därefter aspirerades lösningen in i stråt och lades på floater i flytande kväve enligt metoden beskrivits. Upptining av centrifugerade prover Strån med frysta spermier togs upp ur frysen och ställdes i 39 C vatten i 30 s. Stråt klipptes upp i båda änderna över ett rör och volymen tinat ejakulat noterades. Därefter tillsattes 5 ml PureSpermwash och proverna centrifugerades i 10 min 500 g, supernatant pipetterades bort, endast 0,5 ml lämnades kvar. Koncentrationen motila spermier beräknades med maklerkammare. Oprocessade prover centrifugerades med gradientcentrifugering, enligt ovan, varefter koncentrationen beräknades. Statistik För att bestämma eventuella signifikanta skillnader i studien användes Wilcoxonteckenrange test. Utbytet spermier före och efter frys- och upptiningsproceduren beräknades genom att dela den upptinade koncentration med koncentrationen som frystes ned och multiplicera med 100. Utbytet beskrivs i procent. RESULTAT Delstudie 1, jämförelse mellan frysmedier 10

11 Två olika frysmedier användes för att utreda vilket medium av Vitrolife och Nidacon som gav den högsta överlevnadsfrekvensen. Totalt analyserades 55 gradientbehandlade ejakulat. Figur 1 Till vänster ses boxplotten för gradientcentrifugerade prover före frys nedfrysta med Vitrolife frysmedium. Till höger redovisas Nidacon's gradientcentrifugerade prover före frys. Figuren redovisar provernas utbytet motila spermier före frys/efter tining x 100 i %. Medelvärdet av utbytet motila spermier var 16 % för Vitrolife och 20 % för Nidacon. Uppmätta minimum var 0 % (inga överlevda spermier) för båda medium. Maximala utbytet för Vitrolife var 41 % och 57 % var maximala utbytet för Nidacon.. Utbytet av antal motila spermier var signifikant högre med Nidacons medium, 20 % jämfört med 16 % för Vitrolifes medium, p=0,006, figur 1. Delstudie 2, spermieöverlevnad I delstudie 2 analyserades fyra parametrars påverkan på spermiens överlevnad efter frys- och upptiningsprocessen. Vitrolife- och Nidacons frysmediums påverkan på spermieöverlevnaden efter frys- och upptiningsproceduren samt om gradientcentrifugering bör ske före eller efter frys och upptining undersöktes. För en schematisk skiss över experimentet se figur 2. Totalt analyserades 23 prover. 11

12 Figur 2 beskriver upplägget och antalet använda prov för studie 2. I studie 2 visade Vitrolifes medium signifikant skillnad mellan oprocessade och processade prover (p=0,033), se figur 2 grupp A. För oprocessade prover nedfrysta med Nidacon var medelvärdet 9,4 % samt för processade prover 12,2 % se figur 3 grupp B. Wilcoxonteckenrange test uppvisade däremot ingen signifikans i grupp B, (p=0,055). Figur 3 Utbyte av antalet motila spermier före frys /delat med/ antalet motila spermier efter tining i procent. OPu står för Oprocessade utredningsprover och u står för utredningsprover. Medelvärdet av utbytet i procent var för OPuN 9,4 %,OPuV 6,7 %, un 12,2 % och 13,6 % för uv prover. Skillnad i utbyte var 2,8 % för Nidacon respektive 6,9 % för Vitrolife. 12 Wilcoxonteckenrange test beräknade signifikansen i grupp A (Vitrolife) till p=0,033 och för grupp B (Nidacon) p = 0,055.

13 DISKUSSION I denna studie undersöktes två frysmediums påverkan på spermiers överlevnadsgrad samt om gradientcentrifugering skulle utföras före eller efter frys- och upptiningsprocessen. Kliniken förutsätter att ca 10 % av de nedfrysta spermierna kommer överleva processen. Företagen Vitrolife och Nidacon tillverkar och säljer frysmedium som undersöks i denna studie. Vitrolifes frysmedium SpermFreeze soloution är en bikarbonat och 3-morfolinopropan-1-sulfonsyra (MOPS)-buffrat medium. Lösningen innehåller albumin och gentamicin som verkar som ett antibakteriellt medel. Lösningen innehåller kolesterol för ytterligare membranskydd [11]. Både Vitrolife och Nidacon innehåller kryoprotektanten glycerol. Nidacons koncentration av glycerol är 5 %. Nidacons CryoProtect II lösning innehåller bland annat 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), en buffert som behåller fysiologisk ph trots förändringar av koldioxidhalten orsakat av cellandning. Detta möjliggör för spermatozon att metabolisera in vitro i syreatmosfär [3]. CryoProtect II innehåller glukos som verkar trafikkontrollant av diffusion till följd av dess storlek. Till studie 1 användes 55 gradientcentrifugerade spermaprover. Studien visade att det just nu rutin använda frysmediet Cryoprotect II tillverkat av Nidacon är signifikant bättre än Vitrolifes Spermfreeze (p <0,006). Medelvärdet av motila spermier före/efter frysning var 20 % för Nidacon respektive 16 % för Vitrolife. Trots att det endast var 4 % skillnad av överlevnadsutbytet mellan grupperna gav studien en signifikant skillnad. Ju större grupper som analyseras desto lättare är det att finna signifikanta skillnader, trots att medelvärdet inte skiljer sig enormt åt. Skillnaden mellan medierna är att Nidacons innehåller glukos vilket Vitrolifes medium inte gör. Glukos verkar som en icke penetrerande kryoproktektant som minskar risker för osmotisk chock. Och tidigare studier har visat att glukos har en positiv påverkan för spermieöverlevnad [11]. Det finns studier på hur motiliteten, vitaliteten och den akrosomalaintergriteten 13

14 påverkas av frysning och upptining där samtliga parametrar minskas efter frysning [12]. Motiliteten minskar efter frys- och upptiningsprocessen som komplikation till att mitokondrierna skadats och ATP produktionen har upphört [13]. Kryoskador är orsakat av flertalet faktorer, bland annat osmotisk chock men också iskristallisering, celldehydrering och oxidativ stress [14,15]. Vitrolifes medium innehåller MOPS buffert och Nidacons innehåller HEPES buffert. Båda buffertarna används frekvent till cellkulturer. Det finns dokumenterat att buffertarna bibehåller ph vid olika temperatur [16,17]. Det kan inte dras några slutsatser om att det ena mediet ger fler intakta, väl bevarade, fertiliseringskapabla spermier än det andra mediet. Detta eftersom inga studier på membranintegriteten och nukleinsyra bevaringen utfördes. På grund av begränsade resurser har projektet endast baserats på antalet överlevande motila spermier. Båda företagen använder glycerol till penetrerande kryoprotektant. Glycerol har i över 60 år dominerat som kryoprotektant till spermanedfrysning [18]. Buffertsalterna HEPES respektive MOPS är väl utvärderade sedan tidigare, därför diskuteras inverkan av glukos i Nidacons frysmedium. Glukos är en relativt stor molekyl med en molekylvikt på ca 180 g/mol och därför verkar som icke penetrerande kryoproktektant. Glukos ökar det extracellulära osmatisk trycket genom öka koncentrationen partiklar på utsidan. Vattnet diffunderar ut ur cellen för att stabilisera saltoch vattenbalansen. Glukos förebygger osmotisk chock genom att täppa till så diffusionen av vatten går långsammare under både frysning och upptining. Vitrolifes spermfreeze solution nämner inte innehåll av någon annan icke penetrerande kryoprotektant. Anledningen till varför koncentrationen motila spermier efter upptining är lägre bland Vitrolifes prover kan förklaras av att membranet har utsatts för hastigt inflöde av vatten. Membranen har inte klarat av trycket och därför spruckit. För att säkerställa teorin krävs en vidare undersökning av spermiers membranenintegritet. 14

15 Delstudie 2 påvisade en signifikant skillnad för grupp A (Vitrolife) (p=0,033) medan grupp B (Nidacon) visade en tendens till att få en signifikant skillnad (p=0,055), se figur 2. Medelvärdet av utbytet motila spermier efter frys- och upptiningsprocessen var 9,4 % för oprocessade prover före frys med Nidacons frysmedium (OPuNidacon). Det är 2,8 procentenheter lägre än de processade proverna innan frys (un=12,2 %). Vitrolife gav en större skillnad mellan processade och oprocessade prover innan frys (6,9 procentenheter) vilket är mer än dubbelt så högt än det procentuella utbytet för oprocessade prover innan frys, (OPuV = 6,7 %). Under projektets gång noterades ofta en högre koncentration för de prover som gradientcentrifugerats innan frys, d.v.s. OPu-proven. Därför lades prepp av "OPu-prov" upp på maklerkammare för mikroskopering direkt efter upptining för att bestämma koncentrationen av motila spermier innan gradientcentrifugering utfördes. Flertalet prover hade då en hög koncentration av lågprogressiva spermier (långsamt simmande spermier). Efter gradientcentrifugeringen var dock koncentrationen motila spermier mycket låg, vilket visas i figur 2, se OPuV och OPuN. Med andra ord var koncentrationen motila spermier hög efter upptining, men de var låg progressiva och sorterades bort under centrifugeringen. En relevant fråga i det här sammanhanget är om spermierna hade fått mer tid till att återhämta sig och kvickna till, hade det då varit en högre koncentration motila spermier som tagit sig ned till det nedersta skiktet under gradientcentrifugering? Det finns studier som visar att om lågprogressiva spermier hydreras återfår de delvis sin motilitet [19]. Eventuellt skulle de oprocessade proverna ha gynnats ifall spermaproverna fick spädas i SpermBuffer innan gradientcentrifugerings utfördes. Spermierna skulle då ha fått en chans till återhämtning och motiliteten hade förhoppningsvis ökat. Koncentrationen motila spermier hade dock endast ökat om spermierna fortfarande var intakta och uppfyller densiteten 1,12 g/ml. Det går dock inte att utesluta att spermierna trots det var för låg progressiva för att simma ned till nedersta 15

16 skiktet. Studien är utfört på 23 prover men ett större antal prover hade varit önskvärt. Framförallt för att se hur det skulle påverka Nidacons signifikanstest. I denna studie drogs slutsatsen att Nidacons frysmedium Cryoprotect II bidrar till högre överlevnadsfrekvens av spermier efter frys- och upptiningsprocessen jämfört med Vitrolifes SpermFreeze solution. Gradientcentrifugering med Vitrolifes frysmedium bör ske före frysning för att uppnå bästa förvaring av spermier. För Nidacons medium kunde inga slutsatser dras om gradientcentrifugering bör ske före eller efter frysning utan detta kräver ytterligare utvärdering. ACKNOWLEDGMENT Jag vill tacka min praktiska handledare Julius Hreinsson som hjälpt mig på både den teoretiska och praktiska delen under projektets gång. Jag vill också tacka mina opponenter från Biomedicinska analytiker programmet som gett sina synpunkter och förslag på den skriftliga rapporten. Till sist vill jag även tacka min familj som givit mig ett enormt stöd under hela utbildningen. REFERENSER [1] Somwanshi SD, Madole MB, Bikkad MD, Bhavthankar SS, GavkareAochBhagwat S. "Effect of Cigarette Smoking on Sperm Count and Sperm Motility" 1012;2(1) [2] Gnoth C, Godehardt E, Frank-Herrmann P, Friol K, Tigges J och Freundl G. "Definition and prevalence of subfertility and infertility" Human Repro. 2005;20(5):

17 [3] BreitbartH,Spungin B "The biochemistry of the acrosome reaction" Mor Human Repro. 1997;3 (3): [4] Dale B och Monroy A. "How is polyspermy prevented" Gamete Research 1981;4: [5] Cooper TG, Noonan E, von Eckardstein S, Auger J, Baker HW, Behre HM, Haugen TB, Kruger T, Wang C, MbizvoMTochVogelsong KM. "World Health Organization reference values for human semen characteristics" Hum Reprod Update.2010;16(3): [6] Oshio S, Kaneko S,IizukaR,Mohri H. Effects of gradient centrifugation on human sperm Arch Androl 1987;19(1): [7] Mortimer D och Mortimer T S. Density Gradient Spearation of Sperm for Artificial Insemination Methods in Mol Bio, 2013;927: [8] Rosato MP, IaffaldanoN."Cryopreservation of rabbit semen: comparing the effects of different cryoprotectants, cryoprotectant-free vitrification, and the use of albumin plus osmoprotectants on sperm survival and fertility after standard vapor freezing and vitrification" Theriogenology. 2013;79(3): [9] Pegg DE. "The history and principles of cryopreservation." SeminReprod Med. 2002;20(1):5-13. [10] Tekcan M, L. Sati, W. Murk, J. Stronk, G. Huszar. A new cryomedia without animal components for fertility preservation in men: motility and various attributes affecting paternal contribution of sperm. FertSteril. 2011;96(3):337 [11] Woelders, H; Matthijs, A och Engel, B. "Effects of Trehalose and Sucrose, Osmolality of the Freezing Medium, and Cooling Rate on Viability and Intactness of Bull Sperm after Freezing and Thawing" Cryobio. 1997;35(2): [12] Wang S, Wang W, Xu Y, Tang M, Fang J, Sun H, Sun Y, Gu M, Liu Z, Zhang Z, Lin F, 17

18 Wu T, Song N, Wang Z, Zhang W och Yin C. "Proteomic characteristics of human sperm cryopreservation" Proteomics, 2014;14(2-3): [13] Connell M, McClure N och Lewis M. "The effects of cryopresercation on sperm morphology, motility and mitochondrial function" Hum Repro. 2002;17(3); [14] Alvarez JG, Storey BT "Evidence for increased lipid peroxidative damage and loss of superoxide dismutase activity as a mode of sublethalcryodamage to human sperm during cryopreservation" J Androl. 1992;13(3): [15] Critser J och Gao D "Mechanism of cryoinjury in living cells" ILAR J. 2000;41(4): [16] Roy R, Mrad D, Lord P, Carlsten J, Good W, Allsup P, Roy L, Kuhler K, K och W, Wu Y " Thermodynamics of the Second Dissociation Constant and Standards for ph of 3- (NMorpholino) Propanesulfonic Acid (MOPS) Buffers from 5 to 55 C " J solution chem. 1998;27(1); [17] Roy R, Roy L, Ashkenazi S, Wollen J, Dunseth C, Fuge M, Durden J, Roy C, Hughes H, Morris B och Cline K. "Buffer Standards for ph Measurement of N-(2- Hydroxyethyl)piperazine-N-2-ethanesulfonic Acid (HEPES) for I = 0.16 mol kg 1 from 5 to 55 C" J Solution Chem. 2009(38); [18] Martinez-Soto J, Garcia-Vazquez F, Gumbao D, Landeras J ochgadea J. "Assesment of two thawing processes of cryopreserved human sperm in pellets" Cryo biol. 2011;63(3): [19] Suzuki H "Freeze-Dried spermatozoa and Freeze-Dried sperm injetion to oocytes" J mam o res 2006;23(3);

19 19