Comparison between two different cryoprotectants for human sperm, with emphasis on survival

Transkript

1 Examensarbete 10 poäng C-nivå HT 2007 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Comparison between two different cryoprotectants for human sperm, with emphasis on survival Malin Engström och Karin Eklund Handledare: Fredwell Hambiliki Kvinno-och barndivisionen, Reproduktionscentrum Datum:

2 ABSTRACT The increasing number of patients undergoing treatment with assisted reproductive techniques (ART) during the past years have led to the need of developing different methods for separation of spermatozoa that can be used for different fertilisation procedures and for freezing. Cryopreservation of spermatozoa includes preparation, freezing, storage and thawing. In this study two different cryomedia (Cryo Protec I and Cryo Protec II) for human spermatozoa were compared. The main outcome was spermsurvival rate for spermatozoa after freezing. Sperm viability was assessed using the Hypo-osmotic swelling test which is based on osmolality. A total of 86 samples of semen were used in this study (Cryo Protec I=38, Cryo Protec II=48). The survival rate between the two cryomedia did not differ much but Cryo Protectant I showed a small increase in survival for the spermatozoa after freezing. The Hypo-osmotic swelling test also showed similar values of viable spermatozoa for the two cryomedia both before and after freezing. Key words: gradient preparation, cryopreservation, sperm motility, viability test, HOS Test 2

3 INTRODUKTION Världens första provrörsbarn föddes 1978 tack vare de brittiska forskarna Robert Edwards och Patrick Steptoes 20-åriga forskning. Fram till 2005 har ca 2,1 miljoner IVF (in vitro fertilisering)-barn fötts i världen [1]. I Sverige föds varje år omkring 3000 IVF-barn, varav det första föddes 1982 i Göteborg. Enligt WHO definieras infertilitet (ofrivillig barnlöshet) som oförmåga hos ett par att åstadkomma befruktning eller att fullfölja en graviditet efter ett år eller längre av regelbundna, oskyddade samlag. WHO uppskattar också att det finns cirka miljoner par runtom i världen med någon form av infertilitet. Infertilitetsproblemen kan bero på både mannen och kvinnan. Oftast finner man orsaken till infertiliteten, men i 5-10% av fallen av infertilitet är orsakerna fortfarande okänd efter medicinsk utredning ( Socialstyrelsen klassificerar infertilitet som en sjukdom. Vid behandling av ett par med ofrivillig barnlöshet väljs behandlingen utifrån orsaken till barnlösheten. Flera olika metoder finns och de mest använda är konventionell IVF och mikroinjektion, där man hjälper spermien in i cellen. Grunden för de flesta behandlingsformer som används idag för att behandla barnlöshet, bland annat provrörsbefruktning, är en hormonbehandling, den s.k. Gemzellmetoden som utvecklades redan på 50-talet av Carl Gemzell. Genom åren har metoderna förbättrats och nya utvecklats. På Reproduktionscentrum har cirka provrörsbefruktningar gjorts sedan 1995, varav ungefär var tredje har lett till en graviditet. Förutom provrörsbefruktning (IVF) görs även äggdonation, spermadonation, ägglossningsstimulering, insemination samt kontroll av spermieförekomst efter vasektomi, sterilisering. Dessutom finns det möjlighet till fertilitetsbevarande åtgärder i form av nedfrysning av spermier och befruktade eller obefruktade ägg före behandling med cellgifter eller strålning eftersom det då finns risk att bli varaktigt steril. Ökningen av antalet patienter som genomgått behandling med assisterade reproduktionstekniker (ART) under den senaste tiden har lett till att olika separationsmetoder av sperma har utvecklats. En idealisk metod ska kunna ta bort 3

4 seminalplasma snabbt och effektivt, eftersom seminalplasman innehåller faktorer som gör att spermierna inte kan simma normalt, vilket hämmar fertilisationsförmågan. Metoden bör även minimera risken för ROS (reactive oxygen species) samt vara kostnadseffektiv och klara av stora mängder ejakulat, vilket maximerar antalet användbara spermier. ROS är metaboliter från syre som är reaktiva och som är eller lätt övergår till fria radikaler. En hög ROS-produktion kan starta oxidativa skador på cell-lipider, proteiner och DNA. Som skydd mot sådana skador är de flesta celler utrustade med endera enzymatiska oxidantsystem eller icke-enzymatiska system med antioxidanter. När dessa skyddssystem är överbelastade förlorar spermien delvis sin funktion. Personer med fertilitetsproblem visar minskade nivåer av dessa antioxidanter i seminalplasman. Borttagandet av seminalplasman under preparation av spermier gör att spermierna blir sårbara för oxidativa attacker, eftersom de förlorar sitt skyddssystem [2]. Spermmedia ska motverkar reaktionen av ROS. De vanligaste metoderna för att separera beståndsdelar i sperma är migrationsteknik, där spermierna separeras efter rörlighet samt täthetsgradient, där spermierna selekteras efter sin densitet, d.v.s. mognadsgrad. Reproduktionscentrum använder sig av en metod där spermierna separeras med täthetsgradient där man använder PureSperm (Nidacon, Göteborg, Sverige). Allamaneni et al. (2005) har rapporterat signifikant högre antal motila spermier och livslängd i semen som blivit preparerad med täthetsgradient med PureSperm, jämfört med migrationstekniken [3]. Täthetsgradient med PureSperm klarar även av att reducera antalet spermier med nukleära avvikelser samt spermier med förstörd DNA [4]. Täthetsgradienten bygger på principen att spermier centrifugeras tillsammans med gradienten där spermierna separeras efter densitet. De mogna spermierna vandrar genom ett eller båda skikten och bildar en pellet i botten av röret, de omogna och på annat sätt oönskade spermierna stannar kvar i ytskiktet. Bakterier har en tendens att fästa tills spermier och bl.a. försämra motiliteten. Hög närvaro av bakterier kan även leda till degeneration av oocyterna. Men eftersom defekta spermier, bakterier och virus ej kan passera genom skikten utan filtreras bort, blir "slutprodukten" mycket ren och innehåller endast mogna, friska spermier [5]. Spermierna räknas både före och 4

5 efter preparationen för att jämföra antalet rörliga spermier/ml, den totala koncentrationen/ml, motiliteten, det totala antalet rörliga spermier/ml samt det totala antalet spermier i provet. Det finns olika viabilitetstest som är användbara för att upptäcka viabla men immotila spermier. Spermieviabilitet kan bestämmas med antingen eosin Y eller Hypo-osmotic Swelling Test (HOS-test). Eosin Y-metoden är baserad på principen att ej viabla celler med ett skadat membran tar upp ett färgämne som färgar cellen. HOStest är baserat på osmolalitet och introducerades av Rajasingam S. Jeyendran et al. (1984). Med HOS-test kan man bedöma det funktionella tillståndet på spermiens membran. Ett fullständigt membran behövs bl.a. för spermiens förmåga att binda till äggets yta [6]. Cellmembranet verkar som ett semipermeabelt membran. Vatten transporteras passivt genom membranet där vattenkoncentrationen är lägst, dvs. där koncentrationen av lösta ämnen är högst. Testet fungerar så att levande spermier sväller under hypo-osmotiska förhållanden p.g.a. inflöde av vatten och expansion av membranet. Spermiens svans verkar vara extra känslig för dessa hypo-osmotiska förhållanden. Elektrolyter och socker är kända att upprätthålla det funktionella tillståndet i spermien. HOS-testmediet består därför av en vätska innehållande fruktos, natriumcitrat och vatten som ger en osmolalitet på cirka 155 mosmol/kg ( I människan är osmolaliteten 290 mosmol/kg. Skillnaden i osmolaliteten utanför cellen och inuti cellen gör att vätska transporteras in i cellen och cellvolymen ökar. Spermier som har ett förstört eller kemiskt inaktiv plasmamembran kommer inte att svälla. HOS-test är användbart för att välja ut den mest lämpade spermien till mikroinjektion vid asthenozoospermia (låg motilitet på spermierna) [7] samt för att se viabiliteten efter tining då spermierna ofta är immobila men viabla. En studie av Sallam et al. (2005) visar att fertiliseringsgraden är signifikant högre efter injicering av en spermie utvald med hjälp av HOS-test (43,6%) jämfört mot på måfå utvald spermie (28,2%) [8]. 5

6 För att spara levande spermier för en eventuell senare IVF-behandling används kryopreservering. Under sena 1930-talet och tidiga 1940-talet upptäckte man att spermier kunde överleva frysning ned till temperaturer under -160 C om man använde en s.k. kryomedia, som exempelvis glycerol. När detta blev känt ökade studierna om kryopreservering på områdena djur- och veterinärmedicin. Den första mänskliga graviditeten med kryopreserverade spermier rapporterades först 1953 [9]. Fertiliseringspotentialen är högre för färska spermier än för kryopreserverade spermier, eftersom kryopreservering förändrar spermiens karaktär [10]. Detta beror på att infrysning av spermier är så omfattande. De måste därför kunna frysas in på ett bra sätt så att så många som möjligt överlever frysningen. Fryslängden har såvitt man nu vet, ingen påverkan på spermiekvaliteten och spermier kan därför förvaras så länge patienten vill. Kryopreservering av spermier används bl.a. för patienter som ska genomgå behandling med strålning eller cellgifter, för patienter som saknar spermier i ejakulatet och som ska genomgå operation för att utvinna spermier från testikeln eller bitestikeln samt vid donationsverksamhet. Spermien består av huvud, mellanstycke och svans. Den främre delen av huvudet utgörs av en akrosom (en sektion utvecklad från golgiapparaten) och innehåller nedbrytande enzymer, akrosin. Dessa enzymer är viktiga vid fertilisering, eftersom de läcker ut när spermien får kontakt med äggcellen och underlättar fusion mellan spermie och ägg genom att enzymerna öppnar vägen för spermierna genom zona pellucida. Akrosinnivån sjunker två-till trefaldigt med glycerol som kryoprotektant. Denna minskning beror huvudsakligen på en inaktivering av proakrosin eller en oförmåga för proakrosin att konvertera till akrosin [11]. Spermier behöver energi för att kunna röra sig, vilket de får dels från glykolysen i cytoplasman och dels från den oxidativa fosforyleringen i mitokondrierna, som finns i mellanstycket. Frysning av spermier tros ge förändrad spermiemorfologi med skador på mitokondrierna, akrosomen och spermiesvansen. På grund av detta är det inte 6

7 många spermier som bibehåller intakta membran efter frys och tining. Membranen hos spermien måste behållas intakta för att spermien ska kunna fungera på ett normalt sätt. Spermiens motilitet påverkas mest av frysning, vilket kan bero på skadade mitokondrier och man tror att motiliteten påverkar förmågan för fertilisering in vitro. Conell et al. (2002) menar att antalet viabla spermier och spermier med funktionella mitokondrier minskar signifikant efter kryopreserving [12]. Nedfrysning av spermier är enkel eftersom spermier ofta finns tillgängligt i stort antal, är små samt innehåller lite cytoplasma och lite vatten. Humana spermier är dessutom inte så känsliga för köld som spermier från andra arter. Spermier kan frysas i ampuller eller i strån och det finns flera olika sätt att utföra nedfrysningen [13]. Spermien består av flera utrymmen omgärdade av plasma- och mitokondriemembran. Dessa membran måste hållas intakta för att upprätthålla cellfunktionen. För att skydda spermiens membran mot frysskador blandas råsperma eller preparerade spermier med ett kryomedia, vanligtvis innehållande glycerol. Därefter placerar man stråt i cirka 7ºC för att förbereda provet för infrysningen. Sedan används en programmerbar frysapparatur som först fryser ned provet till -5 C med en nedkylningshastighet av -0.5 C/min och sedan -10 C/min ned till -80 C. Provet förflyttas därefter över till en förvaringstank med flytande kväve (-196ºC) [14]. Infrysningmediet Cryo Protec I är en steril saltlösning som innehåller bl.a. glycerol, bikarbonat samt hsa (humant serum-albumin). Cryo Protec I är optimerad för infrysning av humana spermier. Spermieöverlevnaden med mediet är >50% (endast testad för humana spermier) och den har små endotoxiska värden (<1,0EU/ml). Det senaste mediet på marknaden, Cryo Protec II, som troligtvis kommer att ersätta Cryo Protec I, är liksom den sistnämnda balanserad för att passa jonsammansättningen för PureSperm. Precis som Cryo Protec I innehåller den också glycerol som kryoprotektant men i mindre mängd för att minska toxiciteten. En annan skillnad är att den inte innehåller något hsa. Vid blandning för infrysning tas Cryo Protec II samt spermieprov i proportion 1:4 jämfört med Cryo Protec I där lika stora mängder tas av respektive Cryo/semen ( 7

8 Det finns kryomedier som inte innehållande glycerol, bl.a. Irvine Freezing Medium (TEST-Yolk, USA) som istället innehåller äggula. En studie av Centola et al. (1992) visar att medium innehållande glycerol har en signifikant bättre motilitet av spermier efter frys än vad TEST-Yolk har [15]. Syftet med detta projekt var att studera effektiviteten av 2 olika frysmedia (Cryo Protec I, Cryo Protec II) med hänsyn till spermieöverlevnad. Som stöd för att se överlevnaden efter infrysning och upptining, använde vi oss av viabilitetstestet HOStest. METOD OCH MATERIAL Provmaterial Vårt provmaterial utgjordes av semen från män som var under IVF-utredning (enstaka prover) samt spermieprover från män under IVF-behandling (OPU-prover). Ejakulatet samlades genom masturbering i en steril behållare och fick liquifieras vid 37 C i minst 20 min (maximalt 60 min) innan den första räkningen. Normal spermiekoncentration är enligt WHO >20 milj/ml. Räkningen i Maklerkammare, gjordes på 10 rutor om antalet spermier där var minst 20 stycken. Om inte så räknas antalet spermier i hela rutnätet. Om 10 rutor räknas så skrevs denna siffra som antal i milj/ml och om hela rutnätet räknades divideras denna siffra med 10. Sedan preparerades provet enligt figur 1. Vi arbetade genomgående i rumstemperatur. 8

9 Semenprov Manuell semenanalys Spermpreparering 2 skikts täthetsgradientseparation med PureSperm Semenanalys HOS-test Kryopreservering med Cryo Protec I/ II Tining av semenprov Semenanalys HOS-test Figur 1. Flödesschema över provets väg Gradientberedning Innan utförandet av spermiepreparering bereddes gradienterna. För detta använde vi centrifugrör, pasteurpipetter, PureSperm 100% samt PureSperm buffert. Beredningen av PureSperm 95% gjordes genom att ta 9,5 ml PureSperm 100% till ett rundbottnat rör samt 0,5 ml PureSperm buffert som blandades noggrant. Beredningen av PureSperm 47,5% gjordes genom att ta 1:1 av PureSperm 95% samt PureSperm buffert till ett centrifugrör där det blandades noggrant. 9

10 Tvåskiktsgradienten bereddes genom att en del av PureSperm 95% tillsattes till ett centrifugrör och sedan tillsattes försiktigt samma mängd PureSperm 47,5% ovanpå, så att två skikt bildades. Spermiepreparering Spermiepreparering av enstaka prover för Cryo Protec I För prepareringen användes pipetter, centrifugrör, pasteurpipetter, maklerkammare, mikroskåp (Nikon), samt värmeskåp, 37 C. Maximalt 2 ml semenprov tillsattes försiktigt ovanpå gradienten. Fanns det mer semen gjordes ytterligare en eller flera gradienter. Volymen av semen noterades. Provet centrifugerades vid 300g i 15 min och supernatanten togs därefter bort så att cirka 0,5 ml av pelleten blev kvar. Därefter överfördes 0,5 ml av pelleten till i ett nytt centrifugrör. PureSperm wash tillsattes upp till 5 ml i centrifugröret och sedan centrifugerades provet vid 500g i 5 min. Efter centrifugering togs supernatanten bort och 0,5 ml av pelleten lämnades kvar. Sedan gjordes ytterligare en tvätt med PureSperm wash. Därefter togs supernatanten bort och 0,3 ml lämnades kvar. Provet blandades snabbt på vortex och sedan togs 5µl till en Maklerkammare där koncentrationen rörliga/orörliga spermier noterades. Antalet spermier med uppsvälld svans noterades också. Spermiepreparering av enstaka prover för Cryo Protec II Spermieprepering utfördes på samma sätt, med undantag för slutvolymen som här var 0,4 ml. Spermiepreparering av OPU prov för Cryo Protec I OPU-prover var redan gradientpreparerade av annan laboratoriepersonal när vi fick dem. Vi gjorde därför endast en sista tvätt av provet innan räkning av spermier. Till röret med prov fylldes PureSperm wash på upp till 5 ml och centrifugerades därefter vid 500g i 15 min. Supernatanten togs bort och 0,3 ml lämnades kvar. Provet blandades snabbt på vortex och sedan togs 5µl till en Maklerkammare där koncentrationen rörliga/orörliga spermier noterades. Antalet spermier med uppsvälld svans noterades också. 10

11 Spermiepreparering av OPU prov för Cryo Protec II Spermiepreperingen utfördes på samma sätt, med undantag av slutvolymen som här var 0,4 ml. Hypo-osmotiskt svällningstest HOST-medium tillsattes till ett centrifugrör, som fick stå vid 37 C i minst 5 min. HOSTmedium och semen blandades 1:10 och fick stå vid 37 C i minst 30 min (men inte mer än 120 min). Därefter centrifugerades provet vid 500g i 5 min, supernatanten togs bort utom 0,1 ml i botten och provet blandades snabbt på vortex innan 5µl togs till Maklerkammare för räkning. Alla spermier med förändring orsakad av svällning på grund av hypo-osmotisk lösning räknades (enligt figur 2). Detta antal dividerades med totala antalet spermier i hela Maklerkammaren. Figur 2. (a) normal spermie (b-g) olika typer av förändringar orsakat av svällningen ( Infrysning av spermier Infrysning av spermier med Cryo Protec I Semen blandades med cryo-medium 1:1 droppvis och överfördes med en spruta till ett 0,5 ml infrysningsstrå. Strået förslöts med en förslutningsmaskin och stod vid 11

12 +7 C i 30 min. Under tiden fylldes frysmaskinen på med flytande kväve och programmet för spermieinfrysning ställdes in. Efter 30 min i +7 C placerades strået i kammaren i frysmaskinen och när strået blivit nerfryst t.o.m. -80 C överfördes det till förvaringstanken med flytande kväve. Infrysning av spermier med Cryo Protec II Infrysningen utfördes på samma sätt med undantag av proportionen av cryo-medium och spermieprov som är 1:4. Upptining av spermier Strået förflyttades från tanken med flytande kväve och placerades i ett 37 C vattenbad i 30 sek. Ytan på strået torkades av och ena änden klipptes av. Sedan klipptes andra änden av och innehållet fick rinna ner i ett provrör. Volym noterades. Provet blandades kort på vortex, 5 µl tillsattes till en Maklerkammare och koncentrationen rörliga/orörliga spermier noterades. Hypo-osmotiskt svällningstest efter tining Testet utfördes på samma sätt som innan infrysningen. RESULTAT Totalt användes 86 stycken prover i studien varav 38 stycken för nedfrysning i Cryo Protec I och 48 stycken för Cryo Protec II. Resultatet av separation och analys av proverna visade att värdena för Cryo Protec I respektive Cryo Protec II var lika när det gäller motiliteten före och efter nedfrysning. Motiliteten före frys var 82% för Cryo Protec I och motsvarande för Cryo Protec II var 84%. Efter frys var dessa siffror också likvärdiga (se figur 3). När det gäller resultatet av HOS-testet visade detta liknande värden för kryomedierna både före och efter frys (se figur 4). 12

13 Motilitet % före frys efter frys Cryo Protec I Cryo Protec II Figur 3. Resultat över motilitet för Cryo Protec I och Cryo Protec II HOS test % före frys efter frys Cryo Protec I Cryo Protec II Figur 4. Resultat av HOS test för Cryo Protec I och Cryo Protec II DISKUSSION Mikroinjektion används då parets infertilitet beror på mannen, dvs. när antalet spermier är mycket lågt eller när det råder en oförklarad anledning till infertiliteten. För att underlätta valet av den mest lämpade spermien vid asthenozoospermi kan man använda HOS-test. Lin et al. (1998) menar ett HOS-test reflekterar tillståndet för spermiens svansmembran, medan eosin Y-infärgning visar tillståndet för spermiens huvudmembran. När 33% frysta spermier visar en förändring av svans eller huvud vid 13

14 HOS-test så är bara 9% eosin Y-negativa [16]. Det är än så länge okänt om eosin Y har en toxisk effekt på spermien, därför vill man inte använda sig av spermier, som är färgade med eosin Y till mikroinjektion. Fördelen med HOS-test är att spermierna efter analys kan användas kliniskt. En studie av Verheyen et. al. (1997) visar att andelen svällda spermier (HOS-test) är genomgående högre för ett prov jämfört med andelen ofärgade spermier vid analys med eosin Y. I denna studie jämfördes också tre olika hypo-osmotiska lösningar: Jeyendrans original-lösning innehållande natriumcitrat och fruktos, Milli-Q-vatten och en lösning innehållande 50% näringsmedium och 50% Milli-Q-vatten. Verheyen et al. (1997) visar att den sistnämnda hade minst skadlig effekt på spermien jämfört med de andra två lösningarna när man tittade på spermieviabilitet och uppsvällning under mikroskop [17]. Utförandet av gradientpreparationen har inte varit konsekvent under arbetets gång. Efter någon vecka började vi dela upp prov som bestod av mer än 2 ml för att inte överbelasta gradienten. Felkällor vi kunde komma på var att vi vid gradientberedningen inte var tillräckligt försiktiga, vilket ledde till att de två gradienterna blandades. Även tillsättning av semen behövde göras med en viss försiktighet, så att inte blandning av gradient och semen skedde. Oförsiktig borttagning av supernatanten efter centrifugering var en annan felkälla, d.v.s. att vi tog upp supernatant för snabbt eller för stora mängder vilket gjorde att pelleten i provet kunde grumlas upp. En annan felkälla kunde vara den personliga bedömningen av spermierna i HOS-testet, vilket kan ha haft en liten påverkan på resultatet. Även tiden för vortex påverkar resultatet negativt eftersom spermierna inte klarar av en längre blandning. Det är också viktigt att man tillsätter kryomedia mycket försiktigt till spermieprovet, särskilt de första dropparna så att spermierna inte chockas. Det är viktigt att blandningen av prov med kryomedia före infrysning sker noggrant, eftersom det annars finns risk att en del av spermierna blir oskyddade vilket kan öka antalet döda spermier efter frys. En för lång centrifugeringstid kan göra att man får med mera skräp och döda 14

15 spermier till pelleten. För att få ett ännu pålitligare resultat skulle fler antal prover totalt ha använts samt att varje prov borde ha delas upp i två delar ( tvillingprov ) innan frysningen, för att få samma prov nedfryst i Cryo Protectant I respektive Cryo Protectant II. Detta hade också resulterat i ett mer pålitligt resultat eftersom alla spermier reagerar olika på kryomediet. Det hade också gjort att vi hade fått exakt samma antal prover nedfrysta med de båda kryomedierna, vilket gör att det blir lättare att bedöma resultaten. Ibland kunde vi se samma fenomen som vid HOS-test fast innan viabilitetstestet, vilket kan tyda på att vissa spermier är känsligare för osmolalitetsförändringar och lättare tar upp vätska och sväller upp. Vi kunde efter tining se att vissa spermier tålde frysningen bättre än andra. Vissa spermier fick lättare frysskador som bruten svans jämfört med andra spermier. Vi kunde inte se någon skillnad på detta för de olika frysmedia. I det flesta proverna svällde inte spermierna lika tydligt vid HOS-test efter frys jämfört med HOS-test före frys och en del viabla spermier kan ha missats på grund av sin immotilitet. Detta kan ha berott på att spermieprovet efter frys innehöll kryomedia, som eventuellt kan ha förändrat förhållandena i provet. I vanliga fall tas kryomediet bort direkt efter frys m.h.a. preparationsgradient. Analysresultaten efter nedfrysning skilde sig inte åt avsevärt mycket för de två kryomedierna, men Cryo Protec I visade en liten ökning av motilitet på spermier efter frysning. Resultatet för överlevnad av spermier efter frys bör inte vara mindre än 50% vilket det heller inte var i något fall. Fördelar med det nyare mediet Cryo Protec II är att den är mer ekonomisk eftersom inte lika stora mängder behövs samt att den inte innehåller hsa. hsa framställs av blod från donatorer i USA. Även om donatorerna är noga testade innebär det alltid en risk. HOS-test visade nästan alltid ett bättre resultat jämfört mot motiliteten, speciellt efter frys. Detta kan bero på att spermierna direkt efter tining ofta är immotila. Studie 15

16 av McGonagle et al. (2002) visar att om spermier får återhämta sig vid 37 C i 2 timmar efter kryopreservering förbättras motiliteten från 9% till 44% [18]. Vi hade kanske fått ett jämnare resultat mellan motilitet och HOS-test efter frys om provet hade fått stå vid 37 C någon timme. Slutsatsen blir att spermieöverlevnaden var likvärdig för de båda kryomedierna, men att Cryo Protec II har fördelarna att vara mer koncentrerat, är billigare samt inte innehåller hsa. HOS-test skulle vara till stor användning vid mikroinjektion när patienter endast har immotila spermier samt vid testisbiopsi då spermierna inte än fått sin simförmåga och därför är immotila. ACKNOWLEDGEMENT Vi vill särskilt tacka Fredwell Hambiliki för all hjälp vi har fått under hela arbetet och att vi fick möjligheten att göra vårat examensarbete här på Reproduktionscentrum, Akademiska sjukhuset. 16

17 REFERENSER [1] J.Hreinson, L.Hamberger, T.Harardarson, Infertilitet utredning och behandling genom assisterad befruktning, 2005, 1, [2] World Health Organization, WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, Fourth edition, 1999, [3] S.S.R.Allamaneni, S.Agarwal, S.Rama, P.Ranganathan and R.K.Sharma Comparative study on density gradients and swim-up preparation techniques neat and cryopreserved spermatozoa, Asian Journal of Andrology, 2005, 7, [4] D.Sakkas, G.C.Manicardi, M.Tomlinsson, M.Mandrioli, D.Bizzaro, P.G.Bianchi and U.Bianchi, The use of two density gradient centrifugation tecniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies, Human Reproduction, 2000, 15, [5] C.M.Nicholson, L.Abramsson, S.E.Holm and E.Bjurulf, Bacterial contamination and sperm recovery after semen preparation by density gradient centrifugation using silane-coated particles at different g forces, Human Reproduction, 2000, 15, [6] R.S.Jejendran, H.H.Van der Ven, M.Perez-Palaez, B.G.Crabo and L.J. D.Zaneveld, Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics, Journal of Reproduction and Fertility, 1984, 70, [7] G.Verheyen, H.Joris, K.Crits, Z.Nagy, H.Tournaye and A.Van Steirteghem, Comparison of different hypo-osmotic swelling solutions to select viable immotile spermatozoa for potential use in intracytoplasmic sperm injection, Human Reproduction, 1997, 3, [8] H.N.Sallam, A.Farrag, A.F.Agameya, Y.El-Garem and F.Ezzeldin, The use of the modified hypo-osmotic swelling test for the selection of immotile testicular spermatozoa in patients treated with ICSI: a randomized controlled study, Human Reproduction, 2005, 20, [9] J.T.Anger, B.R.Gilbert and M.Goldstein, Cryopreservation of sperm: indications, methods and results, The Journal of Urology, 2003, 170, [10] J.T.Anger, B.R.Gilbert and M.Goldstein, Cryopreservation of sperm: 17

18 indications, methods and results, The Journal of Urology, 2003, 170, [11] R.S.Jeyendran, H.H.VanDerVen, W.Kennedy, M.Perez-Pelaez and L.J.D.Zaneveld, Comparison of glycerol and a zwitter ion buffer system as cryoprotective media for human spermatozoa, Journal of Andrology, 1984, 5, 1-7 [12] M.O.Connell, N.McClure and S.E.M.Lewis, The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function, Human reproduction, 2002, 17, [13] J.Hreinson, L.Hamberger och T.Harardarson, Infertilitet utredning och behandling genom assisterad befruktning, 2005, 1, 74 [14] J.Hreinson, L.Hamberger och T.Harardarson, Infertilitet utredning och behandling genom assisterad befruktning, 2005, [15] G.M.Centola, R.F.Raubertas and J.H.Mattox, Cryopreservation of Human sperm: Comparisation of Cryopreservatives, Sourses of Variability, and Prediction of Post-thaw Survival, Journal of Andrology, 1992, 13, [16] MH.Lin, M.Morshedi, C.Srisombut, A.Nassar and S.Oehninger, Plasma membrane integrity of cryopreserved human sperm: an investigation of the results of the hypoosmotic swelling test, the water test, and eosin-y staining, Fertility and Sterility, 1998, 70, [17] G. Verheyen, H. Joris, K. Crits, Z. Nagy, H. Tournaye and A. Van Steirteghem, Comparison of different hypo-osmotic swelling solutions to select viable immotile spermatozoa for potential use in intracytoplasmic sperm injection, Human Reproduction, 1997, l3, [18] L.S.McGonagle, M.Goldstein, J.Feldschuh and R.H.Foote, The influence of cryoprotective media and processing procedures on motility and migration of frozenthawed human sperm, Asian Journal of Andrology, 2002, 4,