Detection of Enterococci with three different methods

UPPSALA UNIVERSITET Examensarbete 10 poäng C-nivå Vt 2007 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Detection of Enterococci with three different methods Cecilia Lepp Handledare: Christina Gunnarsson & Kerstin Olsson Mikrobiolgiska enheten Livsmedelsverket

ABSTRACT Water is the most consumed foodstuff around the world. Therefore it is very important to analyze possible faecal contamination of water, and Enterococci are an indicator for that. They are also used as an indicator for possible faecal contamination in food. Normally you find Enterococci in the intestines of humans and animals, but Enterococci can also give infections like urinary tract infection. In this study, varying number of colonies and colours of Enterococci on different media were evaluated. The purpose was to investigate if three different methods would give the same numbers of colonies. Another interesting perspective was to investigate if one medium could be used for two methods. Membrane filter techniques and surface spreading techniques were used to detect Enterococci. These methods were compared with a most probable number method. None of the strains showed an optimal result on all media, however one medium, ChromoCult, showed good results for all investigated strains. Keywords: Enterococcus, water analysis, membrane filtration, food analysis, surface spreading Förkortningar SPV= Spädningsvätska Ent= Slanetz-Bartley medium ment= m-enterococcusagar TSA= Trypton soja agar TSB= Trypton soja buljong MPN= Most probable number 2

INTRODUKTION Eftersom vatten är det livsmedel som konsumeras mest världen över, så är det ingen överraskning att övervakningen av hälsoriskerna som är förknippade med förorenat vatten är av väldigt stor betydelse för samhället [Eckner]. Användningen av enterokocker som en indikator av fekal kontamination av vatten rekommenderades av USA:s miljöskyddsagentur redan 1986. Rekommendationen var baserad på en studie som demonstrerade att enterokocker hade en stark relation till sjukdomar i samband med bad både i havs- och sötvatten [Messer]. I Sverige tillämpas ett EU-direktiv för användningen av enterokocker som en indikator för fekal kontamination i strandbadvatten. Kontroll av enterokocker i strandbadvatten sker regelbundet under badsäsongen [Naturvårdsverket 1996:6]. Analys av enterokocker i dricksvatten sker enligt föreskriven kontroll [SLV FS 2001:30] och för livsmedel sker det enligt livsmedelsverkets vägledning. De livsmedel som är lämpliga att kontrollera är de som är frusna, torkade och saltade [Vägledning för livsmedel]. Enterokocker är grampositiva bakterier som vanligen finns i tarmen hos människor och djur. Dessa är oftast ganska ofarliga men kan ibland kolonisera sår, urinkatetrar m.m. Mest besvär orsakar de i samband med infektion av främmande material inne i kroppen, t.ex. hjärtklaffar och proteser. De flesta infektioner med enterokocker hos människan orsakas oftast av patientens egen tarmflora, men organismerna kan också överföras från patient till patient eller via konsumtion av kontaminerad mat eller vatten. Enterokocker orsakar infektioner såsom urinvägsinfektion, sårinfektion och sepsis. En anledning till att dessa bakterier lätt sprids i sjukhusmiljö är att de är naturligt resistenta mot en rad vanliga antibiotika och att de har förmåga att utveckla resistens mot alla kända antibiotika. Detta ger bakterierna en överlevnadsfördel på sjukhus med hög antibiotikaförbrukning. Det finns ca ett 20-tal olika stammar av enterokocker och de vanligaste är Enterococcus faecalis och Enterococcus feacium [Papavassiliou]. Anledningen till studien var att utreda problem med varierande utseende och antal av enterokocker vid analys av referensmaterial för livsmedel och dricksvatten. Dessa 3

problem har uppstått på Livsmedelsverkets laboratorium. Dessutom var man intresserad av att se om samma medium kunde användas vid både ytodling och membranfiltrering. Syftet med undersökningen var därför att jämföra utbytet och utseende av tre enterokockstammar på fyra olika selektiva medier. Syftet var också att undersöka om ph och tillverkningssätt kunde påverka resultatet och att jämföra konventionella medier med ett kromogent medium och en snabbmetod baserad på most probable number (MPN). Denna utvärdering baserade sig på metoderna NMKL nr. 68 och SS-EN ISO 7899-2. MATERIAL och METOD Stammar I denna studie användes tre olika enterokockstammar, Enterococcus faecalis SLV-051, Enterococcus feacium SLV-459 och Enterococcus durans SLV-078. Dessa stammar var nedfrysta vid 70 C och tinades upp innan försöken. Dessutom analyserades kända frystorkade prover för livsmedel och dricksvatten samt vattenprover från ett recipientvatten 1 och från en å för att utvärdera påverkan på enterokocker i närvaro av annan bakterieflora. Frystorkade prover samt naturligt vatten I studien analyserades även kända frystorkade prover för dricksvatten och livsmedel. 2 vattenprover löstes upp i 10 ml spädningsvätska (SPV) och blandades väl. Provet för livsmedel löstes upp med 4 ml peptonvatten och överfördes till 100 ml peptonvatten. Från dessa 104 ml togs 1 ml till 9 ml peptonvatten. Utav dessa 10 ml överfördes 2 ml till 18 ml så att slutvolymen blev 20 ml. Vid olika tillfällen analyserades ett åvatten samt två recipientvatten. Dessa vatten analyserades utan att spädas. Vid varje filtrering och ytodling ansattes 0,1 ml från proverna. 1 Renat avloppsvatten som släpps ut i ån från reningsverket. 4

Medier De medier som användes i studien var Slanetz-Bartley medium (Ent), m-enterococcusagar (ment), ChromoCult enterococcusagar (ChromoCult) och Trypton soja agar (TSA) samt Enterolert-E. Alla medier tillverkades på Livsmedelsverket av en och samma person förutom Enterolert-E som är ett färdigt kit. Medierna tillverkades enligt standard, för livsmedel enligt NMKL nr. 68 och för vatten enligt SS-EN ISO 7899-2, eller enligt fabrikantens rekommendation. För att få olika ph-värden justerades medierna med antingen natriumhydroxid eller saltsyra inom ph-intervallet 7,2 ± 0,2. Alla medier kokades upp för att sedan kylas ner i tempererat vattenbad. Innan de hälldes upp i olika petriskålar justerades ph. ment ånga tillverkades enligt fabrikantens rekommendationer. Det kokades först i strömmande ånga i 20 min för att sedan kylas ner och gjutas. Inför varje försök fick plattorna som skulle användas stå framme i rumstemperatur över natten för att torka. Plattorna märktes även med stamnummer, ph, inkuberingstemperatur samt ett identifikationsnummer. Tabell 1 visar vilka medier som användes för varje stam. Tabell 1. Analysschema för varje stam. Medium ph Inkuberingstemperatur Antal plattor Ent 7,0 37 C 5 2 + 5 3 Ent 7,0 44 C 5 2 + 5 3 Ent 7,2 37 C 5 2 + 5 3 Ent 7,2 44 C 5 2 + 5 3 Ent 7,4 37 C 5 2 + 5 3 Ent 7,4 44 C 5 2 + 5 3 ment 7,0 37 C 5 2 + 5 3 ment 7,0 44 C 5 2 + 5 3 ment 7,2 37 C 5 2 + 5 3 ment 7,2 44 C 5 2 + 5 3 ment 7,4 37 C 5 2 + 5 3 ment 7,4 44 C 5 2 + 5 3 TSA 7,2 37 C 5 2 + 5 3 TSA 7,2 44 C 5 2 + 5 3 ment ånga 7,2 37 C 5 2 + 5 3 ment ånga 7,2 44 C 5 2 + 5 3 ChromoCult 7,2 37 C 5 2 + 5 3 Enterolert-E 41 C 5 4 2 5 plattor med diametern 5 cm användes vid filtrering. 3 5 plattor med diametern 9 cm användes vid ytspridning. 4 5 kit 5

Mediernas funktion Slanetz-Bartley medium (Ent) och m-enterococcusagar (ment) innehåller olika näringsämnen så att bakterier tillväxer samt natriumazid och tetrazoliumklorid. Natriumazid är en selektiv substans som hämmar aerofila bakterier, speciellt gramnegativa stavar, medan enterokocker inte påverkas. Tetrazoliumklorid är en indikator som enterokockerna reducerar till formazan som gör att enterokockerna blir röda. Skillnaden mellan Ent och ment är liten. Ent innehåller något mer agar. ChromoCult-mediet innehåller olika peptoner och fosfater som ger näring åt enterokockerna. Enterokockerna klyver det unika kromogena substratet i mediet och detta ger lilaröda kolonier av enterokocker. ChromoCult mediet innehåller även vissa gallsalter som tarmbakterier är mer vana vid och därav gynnas medan andra bakterier hämmas. Enterolert-E använder sig av 4-metylumbelliferyl-β-D-glukosid som indikator. Denna indikator reduceras till 4-metylumbelliferon av enterokockernas β-glukosidas som utsöndrar fluorescens i UV-ljus [Idexx] 5. De selektiva medierna kan ha en hämmande effekt även på enterokocker. Trypton soja agar (TSA) är ett oselektivt medium där maximalt antal kolonier bör växa fram. Förtest Innan själva studien gjordes en del förtester. För att odla upp bakteriestammarna ströks de tinade bakteriestammarna upp på TSA-plattor. En koloni från TSA plattan ympades i 40 ml Trypton soja buljong (TSB) och inkuberades i 30 C vattenbad i 20h. För att veta hur mycket provet skulle spädas för att få mellan 50-80 kolonier på plattorna så gjordes en spädningsserie. 1 ml utav de ympade stammarna spädes 7 steg med spädningen 1:10 i spädningsvätska (SPV). De tre sista spädningarna ytspreds på ett oselektivt substrat (TSA). Antal kolonier räknades efter 1 dygn i 37 C. Spädningen 10-6 gav ungefär 80 st kolonier och valdes till studien. 5 www.idexx.com 6

Prover De rena bakteriestammarna odlades upp som vid förtestet och späddes enligt följande: 1 ml utav den ympade buljongen spädes först fyra steg med spädning 1:10, därefter späddes provet ett sista steg med spädning 1:100 så att slutvolymen blev 100 ml. E. faecalis tillväxte mycket bra vilket gjorde att stammen späddes 1:200 det sista steget med en slutvolym på 100 ml. Provet stod på is med omrörning under hela försöket för att förhindra ytterligare tillväxt av stammen. Varje stam odlades upp och analyserades vid två tillfällen. Vid första ansättningen användes Ent ph 7,0, 7,4, ment 7,0, 7,4, ment ånga och TSA medan vid andra ansättningen användes Ent ph 7,2, ment ph 7,2, ChromoCult, TSA och Enterolert-E. Membranfiltrering Membranfiltrering går ut på att ett vattenprov filtreras genom ett filter så att bakterierna stannar på ytan [ISO 8199]. Filtret placeras sedan på ett medium som är lämpligt för enterokocker. I denna studie användes ett cellulosanitrat filter med en porvidd på 0,45 μm. Vid försöken började jag med att sätta en steril magnetfiltertratt i en manifold, därefter sattes en vakuumsug på så att ett undertryck uppstod. Undertrycket gör det lättare för vätskan att rinna igenom filtret (figur 1). Därefter tillsattes lite SPV i tratten för att fukta den och filtret placerades på bottenplattan. När analysmängden är mindre än 30 ml måste en liten mängd SPV hällas i tratten innan provet tillsätts. Det är viktigt att provet blir jämt fördelat på filtret. I denna studie användes 0,1 ml prov från spädning 10-6 som tillsattes till ungefär 50 ml SPV i tratten. När allt prov runnit igenom filtret så sköljdes det 2 gånger med SPV. Därefter stängdes undertrycket av och filtret överfördes med en flamberad pincett till agarplattan. Det är viktigt att överföra filtret med en rullande rörelse så att det inte blir några luftbubblor mellan agarplattan och filtret. Hälften av alla plattor inkuberades upp och nervända i plastpåsar vid 37 C och resten av plattorna vid 44 C i 2 dygn innan avläsning. Vid avläsningen noterades antal kolonier samt färgen på kolonierna. Dessutom mättes diametern på kolonierna. Resultaten jämfördes sedan för att kunna 7

utvärdera hur de olika medierna och ph kan ha påverkat enterokockerna. Resultaten jämfördes även mot de andra metoderna. Figur 1. Bild över manifold och magnetfiltertrattar. Ytodling Alla plattor kontrollerades så att de inte var för blöta. Om så var fallet torkades de i en inkubator vid 37 C i ca 15 min. Om plattorna är för blöta kan spridningen på plattan bli ojämn. 0,1 ml av provet från spädningen 10-6 tillsattes till varje stor platta (9 cm). Därefter spreds provmängden ut med hjälp av en plattspridare och en rackla tills provet arbetats in i plattan. Det är viktigt att sprida ut provet på plattan så att inte kolonierna ligger för tätt på agarytan för då kan kolonierna bli små och okarakteristiska. Det är även viktigt att inte sprida ut provet i kanten av plattan för då kan det bli svåravläst. Om plattorna är förtorkade underlättar det arbetet. Plattorna inkuberades därefter upp och ner vända i plastpåsar vid 37 C respektive 44 C i 2 dygn innan de lästes av. Vid avläsningen noterades antalet kolonier samt färgen på kolonierna. Dessutom mättes diametern på kolonierna. Resultaten jämfördes sedan för att kunna utvärdera hur de olika medierna och ph kan ha påverkat enterokockerna. MPN Enterolert-E är ett snabbtest baserat på en MPN metod som detekterar enterokocker. Vid försöken överfördes 0,1 ml prov från spädning 10 6 till en steril burk som rymmer 8

drygt 100 ml. Därefter tillsattes sterilt avjonatvatten så att volymen blev 100 ml samt ett medium i pulverform som medföljer kitet. Provet skakades väl tills allt pulver hade löst sig och vätskan fördes över till en Quanti-Tray/2000 (en sorts behållare med olika brunnar) som även det medföljer kitet. Behållaren förslöts i en Quanti-Tray sealer (Idexx) och inkuberas vid 41 C i 24h. Efter 1 dygn lästes Enterolert-E av genom att en UV-lampa med våglängd 365 nm lystes över behållaren. De brunnar som fluorescerade räknades, då dessa var positiva för enterokocker. Därefter jämfördes resultatet med en MPN-index tabell för att se hur många kolonier/100 ml som fanns i provet. RESULTAT Resultatet i denna studie är sammanställt i olika diagram. På grund av att stammarna analyserades under två dagar så visas två diagram per stam. Resultaten visar medelvärde av antal kolonier på de olika medierna vid analys med de tre olika metoderna. Diagrammen visar även spridningen mellan plattorna på de olika medierna (figur 2-7). Kolonierna av de olika stammarna på de olika medierna var mellan 0,5 mm till 3,0 mm i diameter och exempel på hur de rena stammarna ser ut på medierna ses i figur 10-17. Resultaten av de frystorkade proverna visas i figur 8-9 där medelvärdet av antal kolonier på de olika medierna visas samt spridningen. Däremot växte det inget på medierna med det naturliga åvattnet samt från recipientvattnet varför inget resultat redovisas. Antalet kolonier på de olika medierna skiljde sig inte så mycket utan det som skiljde medierna åt var storlek och färg på kolonierna. Detta gällde både ytodling och membranfiltrering. Antalet kolonier mellan ytodling, membranfiltrering samt MPN skiljde sig åt för alla stammar. Det skiljde sig mycket mellan de olika metoderna vid analys av frystorkat prov för livsmedel medan skillnaden var mindre för dricksvatten. 9

Medelvärde E. durans Antal kolonier/ platta 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TSA ph 7,2 37 C TSA ph 7,2 44 C ment ph 7,0 37 C ment ph 7,0 44 C ment ph 7,4 37 C ment ph 7,4 44 C Ent ph 7,0 37 C Ent ph 7,0 44 C Ent ph 7,4 37 C Ent ph 7,4 44 C många ph 7,2 37 C många ph 7,2 44 C Enterolert-E 41 C Substrat, ph, temp Figur 2. Resultat från den första analysdagen. Medelvärde antal kolonier av E. durans på de olika medierna vid analys med ytodling (blå staplar), membranfilter (röda staplar) samt MPN metod (gul stapel). TSA används för att se om de selektiva medierna hämmade tillväxten av kolonierna. Medelvärde E. durans Antal kolonier/ platta 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TSA ph 7,2 37 C TSA ph 7,2 44 C ment ph 7,2 37 C ment ph 7,2 44 C Ent ph 7,2 37 C Ent ph 7,2 44 C ChromoCult ph 7,2 37 C Enterolert-E 41 C Substrat, ph, temp Figur 3. Resultat från sista analysdagen. Medelvärde antal kolonier av E. durans på de olika medierna vid analys med ytodling (blå staplar), membranfilter (röda staplar) samt MPN metod (gul stapel). TSA används för att se om de selektiva medierna hämmade tillväxten av kolonierna. 10

Medelvärde E. faecalis Antal kolonier/ platta 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TSA ph 7,2 37 C TSA ph 7,2 44 C ment ph 7,0 37 C ment ph 7,0 44 C ment ph 7,4 37 C ment ph 7,4 44 C Ent ph 7,0 37 C Ent ph 7,0 44 C Ent ph 7,4 37 C Ent ph 7,4 44 C många ph 7,2 37 C många ph 7,2 44 C Enterolert-E 41 C Substrat, ph, temp Figur 4. Resultat från den första analysdagen. Medelvärde antal kolonier av E faecalis på de olika medierna vid analys med ytodling (blå staplar), membranfilter (röda staplar) samt MPN metod (gul stapel). TSA används för att se om de selektiva medierna hämmade tillväxten av kolonierna. Medelvärde E. faecalis Antal kolonier/ platta 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TSA ph 7,2 37 C TSA ph 7,2 44 C ment ph 7,2 37 C ment ph 7,2 44 C Ent ph 7,2 37 C Ent ph 7,2 44 C ChromoCult ph 7,2 37 C Enterolert-E 41 C Substrat, ph, temp Figur 5. Resultat från sista analysdagen. Medelvärde antal kolonier av E. faecalis på de olika medierna vid analys med ytodling (blå staplar), membranfilter (röda staplar) samt MPN metod (gul stapel). TSA används för att se om de selektiva medierna hämmade tillväxten av kolonierna. 11

Medelvärde E. faecium Antal kolonier/ platta 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TSA ph 7,2 37 C TSA ph 7,2 44 C ment ph 7,0 37 C ment ph 7,0 44 C ment ph 7,4 37 C ment ph 7,4 44 C Ent ph 7,0 37 C Ent ph 7,0 44 C Ent ph 7,4 37 C Ent ph 7,4 44 C många ph 7,2 37 C många ph 7,2 44 C Enterolert-E 41 C Substrat, ph, temp Figur 6. Resultat från den första analysdagen. Medelvärde antal kolonier av E.faecium på de olika medierna vid analys med ytodling (blå staplar), membranfilter (röda staplar) samt MPN metod (gul stapel). TSA används för att se om de selektiva medierna hämmade tillväxten av kolonierna. Medelvärde E. faecium Antal kolonier/ platta 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TSA ph 7,2 37 C TSA ph 7,2 44 C ment ph 7,2 37 C ment ph 7,2 44 C Ent ph 7,2 37 C Ent ph 7,2 44 C ChromoCult ph 7,2 37 C Enterolert-E 41 C Substrat, ph, temp Figur 7. Resultat från sista analysdagen. Medelvärde antal kolonier av E.faecium på de olika medierna vid analys med ytodling (blå staplar), membranfilter (röda staplar) samt MPN metod (gul stapel). TSA används för att se om de selektiva medierna hämmade tillväxten av kolonierna. 12

Medelvärde frystorkat prov för livsmedel Antal kolonier/ platta 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ment ph 7,0 37 C ment ph 7,0 44 C ment ph 7,2 37 C ment ph 7,2 44 C ment ph 7,4 37 C ment ph 7,4 44 C Ent ph 7,0 37 C Ent ph 7,0 44 C Ent ph 7,2 37 C Ent ph 7,2 44 C Substrat, ph, temp Ent ph 7,4 37 C Ent ph 7,4 44 C många ph 7,2 37 C många ph 7,2 44 C ChromoCult ph 7,2 37 C Figur 8. Medelvärde antal kolonier för frystorkatprov för livsmedelsanalys på de olika medierna vid analys med ytodling (blå staplar) och membranfiltrering (röd staplar). Medelvärde frystorkat prov för dricksvatten Antal kolonier/ platta 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ment ph 7,0 37 C ment ph 7,0 44 C ment ph 7,2 37 C ment ph 7,2 44 C ment ph 7,4 37 C ment ph 7,4 44 C Ent ph 7,0 37 C Ent ph 7,0 44 C Ent ph 7,2 37 C Ent ph 7,2 44 C Ent ph 7,4 37 C Ent ph 7,4 44 C många ph 7,2 37 C många ph 7,2 44 C ChromoCult ph 7,2 37 C Substrat, ph, temp Figur 9. Medelvärde antal kolonier för frystorkatprov för dricksvattenanalys på de olika medierna vid analys med ytodling (blå staplar) och membranfiltrering (röd staplar). 13

Figur 10. E. faecium på ChromoCult 37 C membranfiltrering. Figur 11. E.faecalis på Ent ph 7,2 44 C membranfiltrering. Figur 12. E. durans på ment ph 7,0 44 C membranfiltrering. Figur 13. E. faecium på ment ph 7,2 37 C membranfiltrering. 14

Figur 14. E. durans på Ent ph 7,2 37 C ytodling. Figur 15. E. faecalis på Ent ph 7,4 37 C ytodling. Figur 16. E. durans på ment ph 7,4 44 C ytodling. Figur 17. E. faecalis på ment Ånga 37 C ytodling. DISKUSSION I denna studie blev det störst skillnad mellan medierna för stammen E. durans och minst skillnad mellan medierna för stammen E. faecalis. Tidigare studier visar att E. durans hämmas av vissa substrat medan E. faecalis har visats sig växa typiskt och tydligt på alla substrat [Mykkänen]. I denna studie syntes dessa skillnader bara på koloniernas färg och storlek. Antalet kolonier var jämt mellan de olika medierna. Antalet kolonier mellan de olika metoderna bör vara lika på grund av lika stor provvolym använts. Som man kan se i resultatet var fallet inte så (figur 2-7). Antalet kolonier blev lägre vid membranfiltreringen och MPN. Att utbytet blev lägre vid membranfiltreringen kan bero 15

på att filtret hämmar tillväxten av bakterierna. Att det blev lägre antal vid MPN kan bero på att de enterokocker som fanns i proven inte uttryckte β-glukosidas som behövs för att detektera dem med MPN. En intressant aspekt till varför denna studie utfördes var att se om man eventuellt kunde gå över till att bara använda ett medium till både membranfiltrering och ytodling. På Livsmedelsverket används idag Ent vid livsmedelsanalys av enterokocker medan ment används vid vattenanalys. Ent visade sig vara sämre för E. faecium vilket gör att man inte kan använda enbart Ent. Det bästa mediet för alla stammar visade sig vara ChromoCult som gav jämnt antal kolonier, bra och tydlig färg och bra storlek. Kolonierna på dessa plattor var lättast att läsa av vilket är en stor fördel med tanke på den mänskliga faktorn. Nackdelen med detta medium är att det är dubbelt så dyrt som ment och Ent. Enterolert-E var svåravläst för E. durans. Vissa brunnar fluorescerade svagt efter 24h men efter ytterligare 3h så fluorescerade de klart och tydligt. Det blev olika resultat mellan Ent och ment trots att de enligt innehållsförteckningen innehåller samma ingredienser, förutom att Ent innehåller något mer agar vilket kan vara orsaken till att plattorna blir något hårdare än ment. Troligtvis är även kvaliten på agarinnehållet olika vilket gör att resultatet kan skilja sig åt mellan dessa medier. Inkuberingstemperaturen visade sig ha en stor inverkan på storlek och färg. Kolonierna av E. durans var så små på ment 44 C att det var svårt att se ifall det växte något (figur 12, 16). Eventuellt skulle man kunna ta det för skräp i ett naturligt prov, men i detta fall var det rena prover så jag visste att det var E. durans trots att de var så små. Ent kan enligt tillverkaren och gällande standard användas för både vattenanalys och livsmedelanalys vilket gör att den borde vara anpassad för inkubering vid 37 C och 44 C. ment är gjord för vattenanalys och därför anpassad för inkubering vid 37 C. 16

ph på de olika medierna visade sig inte ha så stor inverkan på enterokocker. På E. durans orsakade dock ett högt ph att det tillväxte ovanligt stora kolonier. Slutsatsen här är att ph inte har så stor påverkan så länge man följer det rekommenderade toleransintervallet, alltså ph 7,2 ± 0,2. Membranfiltreringen som metod fungerade väl. Den var lätt att använda och mängden prov som kan analyseras spelar ingen stor roll. Fördelen med membranfiltreringsmetoden är att man kan utföra konfirmeringar och därmed eliminera falskpositiva kolonier. Membranfiltreringen är den metod som används mest idag vid vattenanalys. Studier som gjordes 1955 och 1957 visade redan då att membranfilterteknik är en bra, effektiv och noggrann metod för bestämningen av hygienkvalité av vatten [Slanetz]. Fördelen med ytodlingsmetoden är att den är snabb och enkel. Nackdelen är att kolonierna lätt kan komma för nära kanten på agarplattan, vilket gör att det blir svårt att räkna kolonierna. Ytodlingen är även begränsad när det gäller volym. För att ytodla en liten volym så måste provet innehålla hög koncentration av bakterier för att det ska ge utslag. Det var det som var problemet vid analysen av recipientvattnet och åvattnet, som innehöll för få bakterier för att kunna ge resultat. Det frystorkade provet för livsmedelsanalys som var ett referensmaterial varierade väldigt mycket mellan ytodling och membranfiltrering. Det kunde bero på att vid filtrering var det en mindre platta och därav större konkurrens. E. durans som växte i provet är en känslig bakterie och tillsammans med en annan bakterieflora kan den ha svårare att växa fram. Antalet kolonier vid ytodlingen var bra. Detta kunde bero på att plattan var större och det fanns större plats att växa på. Att det inte blev så stor skillnad mellan metoderna för det frystorkade provet för dricksvattenanalys kan bero på att det inte fanns lika mycket bakgrundsväxt som i provet för livsmedelsanalysen. Inför denna studie var det svårt att hitta relevant litteratur. Bland få artiklar hittades en studie som har undersökt om membranfiltermetoden kan ersättas med Enterolert-E. Av 17

studien framkom det att det finns en del nackdelar med att använda Enterolert-E. Den största nackdelen som upptäcktes var oförmågan till återväxt och vidare konfirmering av isolaten, vilket skulle kunna innebära falskpositiva reaktioner i vissa brunnar. Å andra sidan, nämns även en del fördelar med att använda Enterolert-E, vilket inkluderar kortare inkubationstid, den är lätt att använda och kräver mindre nödvändiga teknikträningar av personal [Kinzelman]. En annan studie visar att Enterolert-E har 50 % färre falskpositiva och 95 % färre falsknegativa än membranmetoden [Budnick]. Hur de har kommit fram till detta framgår inte av artikeln. Resultatet av studien visar att om endast antalet enterokocker i provet ska undersökas är Enterolert-E en lika bra metod som membranfiltrering. Fördelen med Enterolert-E är att den ger en snabb indikation om en eventuell fekal förorening. Slutsatsen är att Enterolert-E metoden antagligen kommer att användas mer och mer i framtiden. Det går inte att avgöra vilket medium förutom ChromoCult som är bäst lämpat att använda med denna studie. Det behövs fler studier. Exempel på fler studier som kan göras är att jämföra olika sorters filter och undersöka om det ger någon skillnad. Sedan skulle man kunna testa fler prover där det finns en blandflora för att se om andra bakterier konkurrerar bort enterokockerna. Det jag kommit fram till i denna studie är att variationen av antalet kolonier mellan de olika metoderna inte skiljer sig så mycket att man kan dra slutsatser om vad som orsakat tidigare variationer. Därför bör man fortsätta analysera enterokocker enligt standard och tillverka medier enligt fabrikantens rekommendationer. REFERENSER [Budnick] Budnick G E, Howard R T, Mayo D R. Evaluation of Enterolert for Enumeration of Enterococci in Recreational Waters. (1996) Applied and Environmental Microbiology. 62 (10), 3881-3884. 18

[Eckner] Eckner K.F. Comparison of Membrane Filtration and Multiple-Tude Fermentation by the Coliert and Enterolert Methods for Detection of Waterborne Coliform Bacteria, Escherichia coli and Enterococci Used in Drinking and Bathing Water Quality Monitoring in Southern Sweden. (1998) Applied and Environmental Microbiology. 64 (8), 3079-3083. [ISO 8199] International standard. Water quality - General guidance on the enumeration of microorganisms by culture. 2005-06-15. [Kinzelman] Kinzelman J, NG C, Jackson E et.al. Enterococci as indicators of Lake Michigan Recreational Water Quality: Comparison of two Methodologies and their Impacts on Public Health Regulatory Events. (2003) Applied and Environmental Microbiology. 69 (1), 92-96. [Messer] Messer J.W, Dufour A.P. A Rapid, Specific Membrane Filtration Procedure for Enumeration of Enterococci in Recreational Water. (1998) Applied and Environmental Microbiology. 64 (2), 678-680. [Mykkänen] Mykkänen K. Evaluation of membrane filters for microbiological analysis of drinking water. (2004) Examensarbete 10p, Uppsala Universitet. [NFS 1996:6] Statens naturvårdsverks föreskrifter om strandbadvatten. [NMKL] Enterococcus. Determination in foods and feeds nr. 68 4:e utgåvan 2004.Nordisk metodikkommitté för livsmedel. [Papavassiliou] Papavassiliou J. Species Differentiation of Group D Streptococci. (1962) Applied microbiology. 10 (1), 65-69. 19

[Slanetz] Slanetz L W, Bartley C H. Numbers of Enterococci in Water, Sewage, and Faeces determined by the Membrane Filter Technique with an improved Medium. (1957) Journal of bacteriology. 74 (5), 591-595. [SLVFS 2001:30] Statens livsmedelsverks föreskrifter om dricksvatten. [SS-EN ISO 7899-2] Bestämning av intestinala enterokocker, Del 2: Membranfiltermetod. Svensk standard. [Vägledning för livsmedel] Livsmedelsprovtagning i offentlig kontroll och mikrobiologisk bedömning av livsmedelsprov, 2007-01-24. ACKNOWLEDGEMENT Skulle vilja tacka mina två handledare Christina Gunnarsson och Kerstin Olsson som funnits där för mig, särskilt Christina Gunnarsson som hjälpt mig under försöket och skrivandet. Ett särkilt tack till Jane Karlsdotter och substratpersonalen som hjälp mig med tillverkning av medierna. Sen vill jag också tacka övrig personal på mikrobiologiska enheten, som gjort att jag känt mig mycket välkommen. 20