Bruksanvisning EULISA RNP IgG Avsedd användning Enzymimmunoanalys för detektering av autoantikroppar IgG mot RNP Microtitrering 96 brunnar Förvara kitet vid +2-8 C Endast för in vitro diagnostik Dokument nr.. E-23-0215-01 SE Januari 2013 EULISA RNP IgG Svenska 213296 96
Innehåll 1. Introduktion och bakgrund 2. Varningar och försiktighetsåtgärder 3. Testprincip 4. Kitets innehåll 5. Material som krävs men som inte ingår 6. Förvaring av kitet 7. Reagens- och provberedning / provkrav 8. Analysmetod 8.1. Manuell användning 8.2. Dynex DS2 automatiskt ELISA-system 9. Utvärdering och kvalitetskontroll 10. Tolkning av resultat / metodens begränsningar 11. Prestanda 11.1. Standardisering 11.2. Analytisk specificitet 11.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) 11.4. Homogenitet i fast fas 11.5. Linjäritet 11.6. Precision 11.7. Frekvensdistribution av RNP-Ab (IgG) 11.8. Manuell drift jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system 12. Garanti 13. Symboler 14. Referenser 15. Sammanfattande flödesschema Den produkt som beskrivs i detta dokument har tillverkats i enlighet med IVDdirektivet 98/79/EG. 2
1. Introduktion och bakgrund Uracil-rika, små nukleära RNA:er (U-snRNA) är fysiologiskt sammansatta med proteiner till ribonukleoproteinpartiklar (U-snRNP), vilka är involverade i splitsningsprocessen av pre-mrna. Olika komplex (U1-U6) kan särskiljas beroende på involverat RNA; deras proteinkomponenter är delvis gemensamma och delvis olika. Exempelvis är U1-snRNA sammansatt med så kallade Sm-proteiner, vilka också finns i andra U-snRNP:er och med de U1- specifika proteinerna A, C och 68kDa. Autoantikroppar som riktas mot dessa tre U1-specifika proteiner anses utgöra diagnostisk markör för blandad bindvävssjukdom (mixed connective tissue disease - MCTD; synonym: Sharps syndrom) (1, 2, 3). MCTD är ett väl definierat överlappningssyndrom som karakteriseras av typiska kliniska manifestationer, distinkta autoantikroppar och specifik HLA-konstellation, d.v.s. DR2 and DR4 (4). U1-RNP-specifika antikroppar förknippas även med systemisk lupus erythematosus (SLE), men uppstår med tydligt lägre prevalens (cirka 35 %) och huvudsakligen i kombination med ytterligare antinukleära antikroppar (ANA) (4). Numera anses proteinerna A, C och 68kDa vara den faktiska RNP-antigenen, snarare än den kompletta U1-RNP. Den aktuella enzymkopplade immunadsorberande analysen (ELISA) är avsedd för kvantitativ eller kvalitativ bestämning av IgG-antikroppar i humant serum, riktade mot U1-RNP. Antigenpreparationen är en balanserad blandning av humana proteiner A,C och 68kDa (därigenom undvikes störande inverkan av Sm-antigener; alla av dem är rekombinanta högrenade preparationer. Testet är snabbt (inkubationstid 30-30 - 30 minuter) och flexibelt (delbar fast fas, reagenser som är klara att användas). Sex kalibratorer möjliggör kvantitativa mätningar; en negativ och en positiv kontroll kontrollerar analysprestandan. 2. Varningar och försiktighetsåtgärder Testkitet är endast avsett för in vitro diagnostiskt bruk och får inte användas i eller på människor eller djur. Använd inte reagenser efter angivet utgångsdatum. Vi rekommenderar starkt att protokollet följs. Provbuffert, kalibratorer och kontroller innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Tvättbufferten innehåller bromnitrodioxan och konjugatet innehåller metylisotiazolinon/bromnitrodioxan som konserveringsmedel. 3
Substratet innehåller 3, 3', 5, 5'-tetrametylbenzidin (TMB) och väteperoxid (H2O2). Stopplösningen, 0,5 M svavelsyra (H2SO4), är sur och frätande. Ovan angivna reagenser kan vara giftiga vid förtäring. Iakttag rutinmässiga försiktighetsåtgärder vid hantering av farliga kemikalier. Undvik all kontakt med kroppen, använd handskar och skyddsglasögon. Skölj grundligt med vatten, om någon av reagenserna kommer i kontakt med hud eller slemhinnor. Pipettera aldrig med munnen. Kassera i enlighet med lokala/nationella föreskrifter. Kalibratorer och kontroller innehåller komponenter med humant ursprung. De har visat negativa resultat vid tester för humant immunbristvirus (HIV)-ag, hepatit B yt-(hbs)-ag, HIV 1/2-ak samt hepatit C-virus (HCV)-ak, i tester som uppfyller FDA:s krav eller kraven i EU:s direktiv 98/79/EG. Det finns emellertid inga kända tester som kan garantera att produkter som härleds ur humant blod är fria från smittämnen. De måste därför hanteras som om de är smittbärande och kasseras på lämpligt sätt. Läs CDC:s (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andra lokala/nationella riktlinjer beträffande laboratoriesäkerhet och dekontamineringsrutiner. 3. Testprincip Brunnarna i den fasta fasen bestryks med U1-RNP. På denna yta kommer följande immunologiska reaktioner att äga rum: 1:a reaktionen: U1-RNP-specifika antikroppar i provet binder till det immobiliserade antigenet och bildar ett antigen-antikroppskomplex. Därefter tvättas obundna provkomponenter bort från den fasta fasen. 2:a reaktionen: En andra antikropp, riktad mot humana IgG-anti kroppar och konjugerad med HRP (pepparrotsperoxidas) tillsätts. Detta konjugat binds till komplexet. Därefter tvättas överflödigt konjugat bort från den fasta fasen. 3:e reaktionen: Det enzymmärkta komplexet omvandlar det färglösa substratet till en blå produkt. Graden av färgutveckling reflekterar koncentrationen av U1-RNP-antikroppar (IgG) i provet. 4
4. Kitets innehåll a. 1 mikrobrunnsplatta som belagts med U1-RNP och förpackats hermetiskt i en folielaminatpåse tillsammans med en påse med torkmedel. Plattan består av 12 remsor som var och en kan delas upp i 8 enskilda brunnar. b. Provbuffert, 100 ml, klar att användas, orange. Innehåller trisbuffrad koksaltlösning (TBS), bovint serumalbumin (BSA), tween och natriumazid. c. Tvättbuffert, 100 ml, 10x-koncentrat, blå. Innehåller TBS, tween och bromnitrodioxan. d. 6 kalibratorer, 2,0 ml vardera, 0 0,60 2,0 6,0-20 och 60 U U1-RNPantikroppar (IgG) / ml, klara att använda, gradvis blåfärgade. Innehåller TBS, BSA, tween och natriumazid. e. Negativ och positiv kontroll, 2,0 ml vardera, klara att använda, grön respektive röd. Innehåller TBS, BSA, tween och natriumazid. f. Anti-humant IgG HRP-konjugat, 14 ml, klart att använda, rött. Buffrad lösning som innehåller stabiliseringsprotein, metylisotiazolinon samt bromnitrodioxan. g. Substratlösning, 14 ml, klar att använda, färglös. Innehåller en buffrad lösning av TMB och H2O2 i en flaska som är ogenomtränglig för ljus. 5
h. Stopplösning (0,5 M H2SO4), 14 ml, färglös, klar att användas. Varning: Svavelsyra är frätande. i. Bruksanvisning j. Lot-specifikt analyscertifikat 5. Material som krävs men som inte ingår a. Avjoniserat eller destillerat vatten b. Graderad cylinder, 1 000 ml c. Rör för provspädning (överföringsrör i mikrobrunnsplattans format rekommenderas) d. Pipetter för 10, 100 och 1 000 µl (pipetter med 1 och 8 kanaler rekommenderas) e. Tvätt för mikrobrunnsplatta (tillval) f. Fotometer för mikrobrunnsplatta, försedd med ett 450 nm filter g. ELISA utvärderingsprogram (rekommenderas) 6. Förvaring av kitet Förvara kitet vid 2-8 C. Det är stabilt fram till det utgångsdatum som anges på kartongens etikett. Använd inte kitet efter utgångsdatumet. 7. Reagens- och provberedning / provkrav Komponenter från olika kit får inte bytas ut mot varandra eller slås samman, på grund av eventuella varierande frakt- eller lagringsförhållanden. 6
a. Innan påsen med mikrotiterplattan öppnas måste den ha uppnått rumstemperatur. Ta ut de mikrobrunnar som inte behövs ur ramen och lägg omedelbart tillbaka dem i påsen, tillsammans med påsen med torkmedel. Återförsegla påsen hermetiskt och förvara den i kylen för framtida användning. b. Späd ut tvättbufferten (10x-koncentrat [100 ml, blå]) med 900 ml avjoniserat vatten. Blanda noga. Den utspädda bufferten är stabil i flera veckor vid förvaring i kylskåp (2-8 C). c. Beredning av proverna: Hantera patientproverna som om de kan överföra smittämnen. Förbered sera med vedertagna laboratoriemetoder och späd 1/100, t.ex. 10 µl serum + 990 µl provbuffert. Blanda noga. För snabb dispensering under analysen rekommenderas att kalibratorer, kontroller och prover förbereds i överföringsrör för mikrobrunn. Detta möjliggör användning av en pipett med 8 kanaler under analysen. Om proverna inte analyseras omedelbart ska de förvaras vid 2-8 C och analyseras inom 3 dagar. Vid längre förvaring rekommenderas en temperatur på -20 C eller lägre. Upprepad frysning och upptining av sera bör undvikas. Upptinade prover måste blandas före spädning. Provkrav: Sera med hög fetthalt eller sera som är hemolyserat eller mikrobiellt kontaminerat kan ge felaktiga resultat och bör undvikas. 8. Analysmetod 8.1. Manuell användning Innan analysen påbörjas måste alla komponenter i kitet ha uppnått rumstemperatur (23 ± 3 C). För bästa resultat, d.v.s. maximalt förhållande mellan specifik signal och bakgrundssignal, är noggrann tvätt avgörande (steg a, c och e). Det är av yttersta vikt att tvättlösningen avlägsnas helt och hållet. För detta ändamål torka ordentligt plattan mot flera lager av absorberande papper. Automatiska tvättar måste verifieras mot resultat som uppnås med manuell tvätt. a. Precis före användning ska mikrobrunnarna tvättas en gång: fyll brunnarna med 350 µl tvättbuffert i varje, vänta i cirka 10 sekunder och avlägsna. 7
b. Dispensera kalibratorerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gradvis blå), kontrollerna (2,0 ml i varje, klara att användas, grön och röd) samt de utspädda proverna snabbt i mikrobrunnarna; 100 µl per brunn. Mätningar i duplikat rekommenderas. Inkubera plattan i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). c. Tvätta brunnarna 4 gånger som i steg a. d. Dispensera konjugatet (14 ml, klart att användas, rött) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. e. Upprepa tvättmomentet i steg c. f. Dispensera substratlösningen (14 ml, klar att användas, färglös, svart flaska) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. Eftersom substratet är ljuskänsligt bör exponering för intensivt ljus undvikas (t.ex. direkt solljus) under inkubationen. g. Dispensera stopplösningen (14 ml, klar att användas, färglös. Varning: frätande!) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Använd samma sekvens som för substratet. Färgen ändras från blå till gul. Skaka plattan, företrädesvis på en orbital skakapparat i cirka 10 sekunder. h. Läs omedelbart av absorbansen i mikrobrunnsplattans fotometer vid 450 nm. Förvara kvarstående reagenser i kyl (2-8 C) om de ska användas igen. 8.2 Dynex DS2 automatiskt ELISA-system Denna produkt har validerats för användning med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system. En lämplig programfil för genomförande och utvärdering av analys tillhandahålls på begäran. Parametrarna i detta program är endast ett förslag och kan behöva anpassas av användaren till kraven i den faktiska analysen. Vi har generellt försökt att hålla oss så mycket som möjligt till protokollet vid en manuell användning, enligt ovan. Emellertid, på grund av en högre temperatur inuti DS2, inkubationstiden för substratet bör förkortas. Paragraf 11.8. innehåller en prestationsjämförelse mellan manuell analys och DS2 ELISA-systemet. 8
9. Utvärdering och kvalitetskontroll Kvantitativ utvärdering: De data som erhålls utvärderas kvantitativt mot standardkurvan enligt nedan. Den kurva som visas är endast en modell. Den kan inte ersätta mätning av kalibratorer, tillsammans med kontroller och faktiska prov. Kurvan har konstruerats med ett konventionellt ELISA utvärderingsprogram, som använder 4 parameters funktion. Splineapproximering är också lämpligt. 2500 2000 Dynex DS2 --x----x-- manual op. --o----o-- mod 450nm 1500 1000 500 0 0,1 1 10 100 U U1-RNP Ab/ ml 1011FE00.FED/StdKurveV2812J Om ingen datorstödd utvärdering är möjlig kan standardkurvan ritas för hand. Den möjliggör omvandling av absorbansvärdet i ett prov till dess koncentration, d.v.s. i U1-RNP-antikroppar (IgG) per ml serum. Kvalitativ utvärdering: Testet kan även utvärderas kvalitativt. Detta kräver mätning av den endast positiva kontrollen. Mätning och undersökning av den negativa kontrollen rekommenderas dock (se nedan: kvalitetskontroll). Vid kvalitativ testutvärdering jämförs absorbansen hos proverna med gränsabsorbansen (= cut-off). Den fastställs enligt följande formel: absorbansgränsvärde = absorbanspositiv kontroll x faktor Faktorn beror på kit-loten och anges i det lotspecifika analyscertifikatet som medföljer varje testkit. Exempel: 9
Absorbancepositiv kontroll = 1250 mod faktor = 0,35 absorbansgränsvärde = 1250 mod x 0,35 = 438 mod För att få en uppskattning av hur positivt ett visst prov är för RNP-Ab (IgG), kan man beräkna kvoten, enligt följande formel: kvot = absorbansprov / absorbansgränsvärde Exempel: Absorbansgräns = 438 mod absorbansgräns = 1 480 mod kvot = 1 480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontroll: Den positiva och negativa kontrollen kontrollerar analysens prestanda. Deras auktoriserade värden respektive godkända intervall anges i det lotspecifika analyscertifikatet. Kontrollernas värden måste falla inom de angivna intervallen, annars är analysresultaten ogiltiga. 10. Tolkning av resultat / metodens begränsningar Med utgångspunkt från mätning av en blodgivare och ett urval positiva sera (se nedan), föreslår vi för analys av patientsera: kvantitativ utvärdering kvalitative utvärdering U U1-RNP (IgG) kvot per ml serum normalt (negativt) intervall < 3,2 < 0,84 brytpunkt 4,0 1,00 obestämbart intervall 3,2 5,0 0,84-1,20 positivt intervall > 5,0 > 1,20 Dessa specifikationer ges bara some en indication, för att kontrollera noggranheten bör varje analys includera parallella prover från serum. Ett negativt testresultat anger att patienten inte har förhöjda nivåer av IgGantikroppar mot U1-RNP. Därför är MCTD inte särskilt troligt. På grund av den 10
relativt låga känsligheten hos SLE parametern, en negativ anti-u1-rnp-resultat kan inte utesluta denna sjukdom. Ett positivt resultat bör tolkas främst som tecken på MCTD. En misstanke om SLE stöds men bör verifieras genom mätning av t. ex. dsdna och Sm antikroppar. Prover som visar resultat mellan ovan angivna gränser bör anses vara obestämbara och rapporteras som sådana. Vi rekommenderar att ytterligare ett prov tages två veckor senare och körs parallellt med det första provet för att dokumentera eventuell förändring i antikroppstitern. I likhet med alla serologiska analyser bör resultaten tolkas mot beaktande av patientens symtom och andra diagnostiska kriterier. 11. Prestationsegenskaper 11.1. Standardisering Testet är standardiserat med en renad serumberedning som innehåller IgGantikroppar som är specifikt inriktade mot U1-RNP. Denna beredning har kalibrerats mot en uppsättning av gradvis positiva sera, endast reserverad för detta ändamål. Graden av reaktivitet i provet mäts i arbiträra enheter (U/mL) eftersom ingen internationell standard finns tillgänglig. 11.2. Analytisk specificitet Testet medger specifik bestämning av humana IgG-antikroppar, riktade mot U1-RNP. Det har validerats (bland andra parametrar) med hjälp av kommersiellt tillgängliga humana referens serum från "Center of Disease Control" (CDC, Atlanta, USA). Följande resultat är typiska: serum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CDC- ds- SS-B -- U1- Sm -- SS-A -- Scl- Joresultat DNA /La RNP /Ro 70 1 immuno- homo- speck- speck- -- -- nuc- -- centro- -- -- fluorescens gen / led led leolar mere rim ELISA (U/mL) 2,6 0,6 >60 40 57 3,2 0,9 0,6 0,8 0,6 11
11.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) Detektionsgränsen definieras som den koncentration av analytet som motsvarar genomsnittlig absorbans av provbuffert plus 3-faldig standardavvikelse (s). Det fastställdes som < 0,5-60 U U1-RNP-ab (IgG) per ml serum (n = 24). Rekommenderat mätområde 0,5-60 U U1-RNP-Ab (IgG) per ml serum. 11.4. Homogenitet i fast fas Mätning av homogeniet i fast fas är en normal del av kvalitetskontrollen av varje produktionslot. Det bestäms genom 288-falding mätning av ett IgG-positivt prov som inte är saturerande på 3 valda plattor. Kriterium för godkännande: modvariationskoefficient (cv) över plattorna < 8 %. Bilden nedan visar ett typiskt utdrag (fast fas lotnr. 1609I) av en sådan analys. plate early (n/10) late (9n/10) mean cv% row 1 2 6 7 11 12 1 2 6 7 11 12 line a 1791 1762 1771 1765 1764 1773 1799 1789 1770 1773 1772 1787 1776 0,7 line b 1781 1758 1787 1758 1783 1762 1783 1805 1782 1732 1749 1769 1771 1,1 line c 1789 1761 1794 1771 1788 1755 1771 1807 1768 1758 1762 1765 1774 0,9 line d 1799 1742 1794 1753 1768 1777 1813 1804 1776 1757 1769 1793 1779 1,2 line e 1767 1750 1790 1776 1751 1768 1842 1836 1784 1766 1801 1785 1785 1,7 line f 1786 1746 1799 1782 1780 1755 1809 1795 1793 1773 1775 1793 1782 1,0 line g 1794 1769 1805 1775 1778 1750 1805 1846 1787 1775 1805 1792 1790 1,4 line h 1736 1762 1783 1781 1721 1731 1745 1773 1763 1760 1746 1780 1757 1,2 mean 1780 1756 1790 1770 1767 1759 1796 1807 1778 1762 1772 1783 1777 cv% 1,1 0,5 0,6 0,6 1,2 0,8 1,6 1,3 0,6 0,8 1,2 0,6 1,3 line a line b line c line d line e line f line g line h 0 500 1000 1500 2000 mod 450nm 12
U U1-RNP Ab / ml mod 450nm 2000 1500 1000 500 0 1 2 6 7 11 12 1 2 6 7 11 12 early / late plate, row no. 1011FE00.FED/FphHomV2812J 11.5. Linjäritet För att bedöma testets dos-responsförhållande, mättes positiva sera i seriell 2- faldig spädning. Kriterium för godkännande: linjär regression av fyra spädningar efter varandra måste ge en korrelationsfaktor > 0,98. Ett typiskt resultat visas nedan. 50 40 30 serum 1 serum 2 serum 3 lin.regr.1 lin.regr.2 lin.regr.3 20 10 0 0 20 40 60 80 100 nl serum / well 1011FE00.FED/LinearV2812J 13
11.6. Precision För att bedöma testets precision fastställdes resultatens variabilitet under följande förhållanden: a. inom 1 analys och mellan 3 analyser, b. mellan 3 operatörer och c. mellan 2 kit-loter. a. Variabilitet inom analys och mellan analyser (n = 24 respektive 72) prov medelvärde variabilitet (cv %) IU/ml inom analys mellan analyser 1 6,0 2,3 2,5 2 13 3,9 4,7 3 30 3,2 3,4 b. Variabilitet mellan operatörer (n = 12) prov medelvärde variabilitet IU/ml (cv %) 1 5,9 1,5 2 13 3,7 3 29 3,0 b. Variabilitet mellan 2 kit-loter (n = 6) prov medelvärde variabilitet IU/ml (cv %) 1 6,3 1,9 2 13 7,5 3 25 3,0 11.7. Frekvensdistribution av U1-RNP Ab (IgG) Detta analyserades i sera från blodgivare, jämnt fördelat mellan kön och ålder och från sera som befunnits positiva för U1-RNP autoantikroppar enligt CEgodkänt referens-elisa eller som har definierats kliniskt. Följande fördelning av analyt observerades: 14
<0,4 0,487-0,593 0,723-0,88 1,07-1,31 1,59-1,94 2,36-2,87 3,5-4,26 5,19-6,32 7,7-9,38 11,4-13,9 17-20,6 25,1-30,6 37,3-45,4 55,3-67,4 82,1-100 relative frequency (% <0,4 0,487-0,593 0,723-0,88 1,07-1,31 1,59-1,94 2,36-2,87 3,5-4,26 5,19-6,32 7,7-9,38 11,4-13,9 17-20,6 25,1-30,6 37,3-45,4 55,3-67,4 82,1-100 relative frequency (% blood donor sera 60 50 40 30 20 cut-off 10 0 U U1-RNP Ab/mL positive sera 60 50 40 30 20 cut-off 10 0 U U1-RNP Ab/mL 1011FE00.FED/HäufgPlotV2810J 15
Dynex DS2 (U/mL) blodgivarsera positiva sera n: 160 n: 14 medelvärde: 1,1 IU/ml medelvärde: 240 IU/ml medelvärde + s: 1,9 IU/ml medelvärde - s: <0 IU/ml medelvärde + 2s: 2,8 IU/ml medelvärde - 2s: < 0 IU/ml median: 0,9 IU/ml median: 170 IU/ml 95:e percentilen: 2,1 IU/ml 5:e percentilen: 25 IU/ml ROC-analys av dessa data användes för att bestämma gränsvärdet som 4,0 U/ml (5). De data som visas här visar på en diagnostisk specificitet och sensitivitet hos denna ELISA på cirka 99 respektive nästan 100 %. Dessa värden gäller endast analyserade sera; andra typer av provsamlingar kan ge andra resultat. 11.8. Manuell förfarande jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system Korrelation: 100 80 60 y = 0,925 x r = 1,000 40 20 0 0 20 40 60 80 100 manual operation (U/mL) 1011FE00.FED/KorrDynexDS2-V2812J 16
Variabilitet: Genom att använda prover från en och samma kit-lot, jämfördes analysresultatens variabilitet mellan manuell användning och Dynex DS2 automatiskt ELISA-system: manuell användning Dynex DS2 variabilitet inom analys medelvärde cv = 3,8 % medelvärde cv = 5,3 % (n = 16) variabilitet mellan analyser medelvärde cv = 5,5 % medelvärde cv = 6,6 % (n = 48) Standardkurva: visas i paragraf 9 12. Garanti Euro Diagnostica AB garanterar att levererad produkt har testats grundligt för att säkerställa att de egenskaper som specificeras här har uppfyllts. Inga ytterligare garantier lämnas. De prestationsdata som presenteras här erhölls med användning av angiven metod. Eventuell modifikation av metoden kan påverka resultaten varvid Euro Diagnostica AB friskriver sig från alla garantier, såväl uttryckliga som underförstådda eller lagstiftade. Euro Diagnostica AB bär inte heller något ansvar för eventuella skador, vare sig direkta, indirekta eller efterföljande som uppstår till följd av felaktig användning eller förvaring av produkten. 13. Symboler Katalognummer Satsnummer 17
Innehåller tillräcklig mängd för <n> tester Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik Conformité Européenne Skyddas från solljus Temperaturgränser Hållbar till Varning Biologiska risker Tillverkare 18
14. Referenser 1. Lerner, M. R., Steitz, J. A.: Antibodies to small nuclear RNAs complexed with proteins are produced by patients with systemic lupus erythematosus. Proc Natl Acad Sci USA 76 (1979), 5495-5499 2. Francoeur, A. M.: Anti-Sm and anti-u1-rnp lupus antibody fine specificities. J Clin Immunol 9 (1989), 256-263 3. Combe, B., et al.: Clinical significance of anti-rnp and anti-sm autoantibodies as determined by immunoblotting and immunoprecipitation in sera from patients with connective tissue diseases. Clin Exp Immunol 75 (1989), 18-24 4. Messinger, M.: Autoantikörper bei systemischen entzündlich-rheumatischen Erkrankungen (Kollagenosen). In: L. Thomas (ed.): Labor und Diagnose (2005), TH-Books-Verlags-Gesellschaft, Frankfurt/Main, 1139-1161 5. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), 86-92 19
15. Sammanfattande flödesschema a. Späd sera i 1/100 i provbuffert (100 ml, klar att användas, orange) och blanda. b. Späd tvättbufferten (10x-koncentrat [100 ml, blå]) med vatten och blanda. c. Tvätta brunnarna en gång med 350 ul tvättbuffert vardera. Dispensera 100 ul av kalibratorerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gradvis blå), kontrollerna (2,0 ml i varje, klara att användas, grön och röd) samt de utspädda proverna i den fasta fasens brunnar. Mätningar i duplikat rekommenderas. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). d. Tvätta brunnarna 4 gånger med 350 ul tvättbuffert vardera. e. Dispensera 100 µl av konjugatet (14 ml, klart att använda, rött) i brunnarna. Inkubera som i steg c. f. Upprepa tvättmomentet i steg d. g. Dispensera 100 µl av substratlösningen (14 ml, klar att använda, svart flaska) per brunn. Inkubera som i steg c och tillsätt därefter 100 µl stopplösning (14 ml, klar att använda, färglös) per brunn och skaka plattan en kort stund. h. Mät omedelbart absorbansen vid 450 nm. i. Kvantitativ utvärdering: Bestäm standardkurvan och omvandla provernas absorbans, med användning av denna kurva, till deras respektive antikroppskoncentration (U U1-RNP Ab (IgG)/ml). j. Kvalitativ utvärdering: Bestäm gränsabsorbansen genom att multiplicera absorbansen i den positiva kontrollen med den faktor som anges i analyscertifikatet. Beräkna därefter provernas kvot genom att dela deras absorbans med gränsabsorbansen. Internal file id._ver.-no. / date of issue: 1011FE60_1301M.FWD.doc / January 13, 2013 20