Innehåll Prokaryot genexpression 28/102008 Allmän orientering Transkriptionsreglering Produktionsstrategier Chaperon/foldassystem Metabolbelastning Problem och lösningar Centrala dogmat Biologiska system för proteinexpression replikation DNA transkription RNA translation Protein posttranslationella förändringar Funktionellt protein Escherichia coli Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae (jäst) Insektsceller Däggdjursceller Växtceller Transformationsmetoder CaCl 2 + värme elektroporering genegun virusmedierade liposomer Modifiering av genexpression Transkription Genetiska strategier Medel: promotorer terminatorer RBSstyrka antal genkopior genfusioner gensekvens (codon usage) etc Att ta hänsyn till: transkription translation lokalisering proteinstabilitet metabola förhållanden reningsprocess etc 1. Initiering: RNApolymeras binder promotor, strukturella förändringar hos promotorpolymeraskomplexet ( bubbla ), initial transkription 2. Elongering: konformationsförändringar (håller hårdare om templatet), uppvindning av DNAt, RNAsyntes, proofreading 3. Terminering: Rhooberoende terminatorer (inneboende terminatorer = hårnålsstrukturer), Rhoberoende terminatorer 1
Transkription Termination of transcription (E. coli) Promoter RNA polymerase RNA polymeras: 2 + (ca 465 kda) sigmafaktorn påverkar DNAbindande egenskaperna hos polymeraset bindningsstyrkan till olika promotorer kan skilja 10 6 x transkription initieras utan primer Promotor (consensus): (35) (10) TTGACA 1619 bp TATAAT 59 bp RNA Other mechanism: Termination via Rho protein (hexamer) Hairpin termination signal DNA Pausesite Rho Promotorer Promoter (Escherichia coli) Startsignaler för RNAsyntes Stark promotor: hög affinitet för RNApolymeras Konstitutionell promotor: alltid påslagen + proteinproduktion cellen mår inte bra; borde växa till först energiförluster plasmidinstabilitet Reglerbar promotor: går att slå på och stänga av + proteinproduktion bara under en viss fas av cellcykeln, eller bara under en viss tid 35 10 Start of RNA synthesis Start of coding sequence CCGGTTGACAGATAGTCGTGTATGCGATATAATCAGCCCGTAGTCGGAGGGTCCTGACATG GGCCAACTGTCTATCAGCACATACGCTATATTAGTCGGGCATCAGCCTCCCAGGACTGTAC P "Pribnow box" Gene for protein Produced molecule Translation Sigmafaktorer ( ) i E. coli Transkriptionsreglering Gene rpod rpoh Factor 70 32 Use general heat shock 35 TTGACA CCCTTGAA sep 1619 bp 1315 bp 10 TATAAT CCCGATNT Skiljer på positiv och negativ reglering Positiv reglering: transkriptionsfaktor (aktivator) måste binda in till promotorn för att transkription skall ske hjälper RNApolymeras att binda till DNAt (rekrytering) allosterisk verkan av steg efter polymerasinbindning rpon flia rpoe 54 28 ( F ) E Nmetabolism motility/chemotaxis heat shock CTGGNA CTAAA 6 bp 15 bp TTGCA GCCGATAA Negativ reglering:repressorprotein binder till operator och hindrar transkription hindrar RNApolymeras att binda till promotorn alternativt håller kvar RNApolymeraset rpos S stress response 2
Genreglering efter transkriptionsinitiering Prematur transkriptionsterminering s.k. attenuering; ex. trp antiterminering = en typ av positiv transkriptionsreglering vid vilken transkripionsfaktorer (proteiner) binder till RNApolymeras och modifierar det så att det kan läsa igenom speciella termineringssites används av fager och i vissa operon Vanligt använda promotorer Promotor Induktionsmedel a lac IPTG tac 35 trp 10 lac IPTG trc IPTG trp Trpsvält/ IAA T7 IPTG P L ( ) Värme lac(ts) Värme P SPA Konstitutiv Ett urval av promotorer använda för hög proteinexpression i E. coli a mest använda metod för inducering. Förkortningar: SPA, Staphylococcus aureus protein A; IPTG, isopropyl Dthiogalactopyranoside; IAA, indolakrylsyra. Test av promotorstyrka Reglering av laktosoperonet (E. coli) His 6 ABPGFP Promotor 35 10 Lac I Catabolite Activator Protein (CAP) CAP Cykliskt AMP (camp) Promotor= Landningsplats för RNApolymeras RNApol. 35 10 Lac I start Lac Z Lac Y Lac A DNA Negative control SPA LacUV5 Trc T7 Lacrepressor (Lac I) S.D. Lac I 3 camp/capbindningsställe Operatorsekvens S.D. S.D. S.D. Lac Z Lac Y Lac A 3 galaktosidas: Spjälkar laktos till galaktos och glukos Laktospermeas: Reglerar införsel av laktos Thiogalaktosidacetylas: Bryter ned ej klyvbara laktosanaloger Laktos eller IPTG (syntetisk analog) Frånvaro av laktos: Lacrepressorn binder till operatorsekvensen Transkriptionen blockeras; inget galaktosidasenzym (eller något av de andra enzymerna) produceras Fluorescence intensity Red = T7 Green = Trc Blue = LacUV5 Yellow = SPA H. Tegel, unpublished Närvaro av laktos (eller IPTG): Lacrepressorn kan inte binda till operatorsekvensen Transkriptionsker; galaktosidasenzym (och alla de andra enzymerna) produceras Närvaro av laktos (eller IPTG) samt låga halter av glukos: Halten av camp stiger campcapkomplex bildas som kan binda uppströms om promotorn campcapkomplex främjar transkriptionen (vägleder RNApolymeraset) Mer galaktosidasenzym produceras Trpoperonet T7systemet och P L promotor repressor operator Trp trpl trpe trpd trpc trpb trpa T7systemet Lacpromotor Lacoperatopolymeras T7promotor T7 RNAgen gen Tryptofansvält repressor T7 RNApolymeras trpl trpe trpd trpc trpb trpa P L promotorn repressorprotein från bakteriofag Odling 2830 C aktiv repressor Inducering 42 C inaktiv repressor ger genexpression 3
Transcription: regulation Translation Promoter strength: degree of consensus sequence Sigma factor availability: growth condition dependent Positive/negative regulation Enhancer/silencer regions 5 Ribosome NH 2 Amino acid Transfer RNA (trna) Anticodon loop COOH 3 Translation Protein Translationsmaskineriet Translationsinitiering trna aminoacyl trna syntetaser ribosomen IF1, IF2, IF3 EF (EFTu, EFG) RF RBSsekvensberoende UAAGGAGG AUUCCUCC 16SRNA Avstånd RBSATG Sekundärstruktur hos t Codon usage Bacterial 16S RNA (T. thermophilus) Formation of the translation initiation complex Nformylmethionine (fmet) Always the first aminoacid in bacterial proteins Specific trna for fmet Nformylmethionine Initiation factors (IF) IF1 IF2 IF3 Bacteria S.D. trnaf + GTP AUG 30S 30S initiation complex Peptidyl Exit (E) (P) site site fmet Aminoacyl (A) site 50S binding (to S.D. sequence) AUG XXX 30S Next codon to be translated 70S initiation complex 4
Elongation phase of translation Termination phase of translation 35 aa/sec 100200 aa in 1 min 30 000 aa (titin protein in muscles) in 23 h (Bacteria: ca. 1520 aa/sec) A One of the three STOP codons C A C B D B Critical moment for insertion of the correct amino acid "Slow" GTP cleavage assures that only the correct trna is allowed to stay and deliver its amino acid D Translation: Regulation Prokaryota expressionsvärdar Position and sequence of ShineDalgarno sequence Codon usage Different codons for the same aminoacid are read with different efficiences binding proteins Proteins bind to SD sequence and block ribosomal binding Antisense regulation "Mirror image" of binds complementary to and prevents translation Stability of against degradation Escherichia coli Gramnegativ stav rörlig ickepatogen generationstid ca 25 min genetiskt och fysiologiskt karaktäriserad många specialstammar tillgängliga RNA interference (RNAi) micro RNA (mirna) silencing RNA (sirna) Nobelprize in Medicine 2006 to Andrew Fire and Craig Mello Prokaryota expressionsvärdar Produktionsstrategier E. colipromotorer fungerar i de flesta Gramnegativa bakterier. Universalplasmider kan användas. Salmonella spp., Cholera spp., Shigella spp. m.fl. används bl.a. i vaccinforskning p.g.a immunogena egenskaper Bacillus spp. hög proteasaktivitet vilket ofta skapar problem Coryonebacterium glutamicum Trichoderma reesei Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Extracellulär sekretion Periplasmatiskt Intracellulärt, lösligt Intracellulärt, olösligt Ytexpression 5
Intracellulära proteiner Lösliga Inget behov av solubilisering och refolding Löslighetsförhöjande fusionspartners Thioredoxin MBP Kan vara skadliga för cellen Proteolys Komplex rening Inklusionskroppar Hög produktion Lätta att isolera Skyddar mot proteolys Solubilisering och refolding krävs Sekreterade proteiner Extracellulärt signalpeptid behövs enklare rening inte alla proteiner är sekretionskomp. Periplasmatiskt signalpeptid behövs disulfidbindningar möjliga proteolysproblem osmotisk chock Ytexpression Cytoplasmic chaperones Family Name Cofactors Function Substrate specificity ATP requirement Gram bakterier: fusioner till bakteriella yttermembranproteiner, ex. OmpA Gram+ bakterier: cellväggs ankare, ex. SpA Hsp100 Hsp90 Hsp70 Hsp60 Clp HtpG DnaK GroEL DnaJ, GrpE GroES Disaggregase Folding/secretory chap.? Folding chaperone Folding chap. Regions rich in aromatic and bacic aa Segm. of four to five hydrophobic aa, enriched in leucine and flanked by basic residues / folds enriched in hudrophobic and basic residues + + + + Bibliotek för screening slumpmässiga DNAsnuttar i OmpAgen Vaccinapplikationer immunogena peptider/proteiner Hp33 DJ1 superfam. Small Hsps PPIase SecB Hsp33 Hsp31 IbpA, IbpB TF SecB Holding chap. Holding chap. Holding chap. Hold. chap., PPIase Secretory chap. Eight aa motif enriched in aromatic and basic residues Nine aa motif enriched in aromatic and basic residues Chaperoneassisted protein folding (cytoplasm) Periplasmic chaperones Classification Generic chaperones Specialized chap. PPIases Proteins involved in disulfide bond formation Protein Skp (OmpH) FkpA SurA LolA PapD FimC SurA PpiD FkpA PpiA DsbA DsbB DsbC DsbG DsbD DsbE (CcmG) CcmH Substrates Outer membr. proteins and misfolded periplasmic proteins Broad substrate range Outer membrane proteins Outer membrane lipoproteins Proteins involved in P Pili biosynthesis Proteins involved in type 1 pili biosynthesis Outer membrane betabarrel proteins Outer membrane betabarrel proteins Broad substrate range Reduces cellenvelope proteins Reduces DsbA Proteins with nonnative disulfides Proteins with nonnative disulfides Oxidised DsbC, DsbG and CcmG Cytochrome c biogenesis Cytochrome c biogenesis Baneyx F et al, Nature Biotechnology (2004), 22: 13991407 6
Export and periplasmic folding pathways E. coli: periplasm Folding in the bacterial periplasm: protein disulphideisomerases DsbA, a generic dithiol oxidase in the periplasm of E. coli Baneyx F et al, Nature Biotechnology (2004), 22: 13991407 E. coli: periplasm E. coli: periplasm Folding in the bacterial periplasm: protein disulphideisomerases DsbC catalyzes disulphide bond exchange reactions Folding in the bacterial periplasma: peptidylprolyl cis/transisomerases polypeptide bonds are synthesized in trans configuration 5% cis peptidylprolyl bonds in native proteins E a = 20 kcal/mol for peptidylprolylisomerisation Ratedetermining step of protein folding Metabol belastning Vad händer med cellen? Plasmider med högt kopieantal Syrebegränsning Överproduktion av främmande proteiner tär på lagret av trna Exportmaskineriet blockeras. Export av värdcellens egna proteiner hindras Förändrade metabola egenskaper i vissa stammar försämrar Främmande proteiner kan störa cellen. Ev. toxiska egenskaper hos målproteinet Celltillväxt minskar Form och storlek förändras Stressrespons. Proteaser tillverkas Minskad tillförlitlighet i DNAproof reading Fel aminosyra sätts in om något trna eller någon aminosyra är begränsad 7
Syrebegränsning Långsammare tillväxt och ändrad metabolism vid syrebegränsning Stressrespons aktiveras. Proteaser tillverkas Åtgärder: Proteasnegativa stammar ger minskad nedbrytning, men felaktiga proteiner kan ej brytas ner Uttryck av bakteriellt hemoglobin för intracellulär O 2 bindning Plasmider en börda för cellen Plasmider spottas ut Strategi: plasmidkodat protein som behövs för överlevnad i cellkulturen Kräver tillsats av antibiotika eller nödvändig metabolit (dyrt och i många fall oönskat) Risk med plasmider för överförande av genetiskt material Lösning: DNAintegration i värdkromosom Minskning av metabol belastning Heterologous protein expression in E. coli Använda andra kodon Promotorer som är reglerbara och inte läcker Minskad produktionsnivå kan i många fall ge högre celltäthet Common problems protein aggregation protein misfolding inactive protein Solutions decreased synthesis rate (weaker promoter, reduce conc. of inducer, low temperature) coexpression of folding modulators fusion tags protein engineering of target host engineering Effect of coexpression of GroEL/ES Effect of coexpression of GroEL/ES DH5alpha/11bHSD1eGFP 0 h 2 h 4 h DH5alpha/11bHSD1eGFP/GroELES 0 h 2 h 4 h time: 4 h DH5alpha/11bHSD1eGFP DH5alpha/11bHSD1eGFP/GroELES 8