Separation av plastidfärgämnen Hos fotoautotrofer fångas energin i ljuset upp av speciella pigment-proteinkomplex. De pigment som framförallt absorberar ljuskvanta till fotosyntesen är klorofyllerna. Dessutom finns ytterligare pigment som är röda och gula antocyaner, karotenoider och xantofyller. Deras funktion kan vara att locka pollinatörer och att hjälpa klorofyll att fånga in ljus, men de kan också skydda växten mot för mycket ljus. De flesta pigment kan man enkelt separera med hjälp av papperskromatografi. Kromatografi kan användas för att separera olika organiska ämnen. Metoden utnyttjar att ämnen lösta i ett lösningsmedel (rörlig fas) kommer att vandra olika snabbt i en lämplig fast fas. De lösta ämnenas struktur är mer eller mindre lika den fasta eller den rörliga fasen. Ett ämne som mer liknar den rörliga fasen kommer att vandra snabbare än ett ämne som mer liknar den fasta fasen. Avsikten med laborationen är att separera, isolera och identifiera de viktigaste plastidpigmenten hos några olika fotoautotrofer och jämföra pigmentsammansättningen. Säkerhet Aceton och petroelumeter är mycket brandfarliga och det får därför inte finnas någon öppen låga i närheten när man arbetar med dessa ämnen. Undvik inandning och hudkontakt. Ångorna kan göra att man blir dåsig och omtöcknad. De verkar också uttorkande på huden. Blandningen av petroleumeter och aceton kan återvinnas eller återanvändas. Petroleumeter får inte hällas ut i vasken. Små mängder överbliven aceton kan spolas ned i avloppet med stora mängder vatten. Material Organismer enligt nedan Kromatografipapper Stort provrör Stavmixer eller mortel Natriumvätekarbonat Aceton Petroleumeter
Gör så här 1. Arbeta två och två. Varje grupp analyserar pigmentsammansättningen hos något av följande: a. Blågröna bakterier b. Grönalg c. Brunalg d. Rödalg e. Bandtång (fanerogam, marin) f. Gräs (fanerogam, monokotyledon) g. Jordgubbsblad (fanerogam, dikotyledon) h. Mossa (kryptogam) 2. Klipp till en bit kromatografipapper så att det passar i ett stort provrör. Pappret ska vara så stort som möjligt men ändå kunna hänga fritt i röret utan att gå emot botten och kanter. Gör en upphängningsanordning, exempelvis med hjälp av gem. Papperet kommer att fungera som fast fas. 3. Väg upp 2-3 g gröna blad eller 5-7 g alger och klipp dem i smådelar. Homogenisera bitarna med stavmixer eller mortel tillsammans med en knivsudd natriumvätekarbonat och 10 ml aceton tills de är finmalda. Dekantera av lösningen i ett centrifugrör och centrifugera på högsta hastighet ca 3 min. Efter centrifugeringen ska supernatanten (vätskan) vara helt klar. För över supernatanten till ett nytt rör. 4. Applicera extraktet med hjälp av en kapillär ungefär 2 cm från nedre kanten på kromatografipappret. Gör det i flera omgångar och låt papperet torka mellan varven. 5. Häll en skvätt av det lösningsmedel som används som rörlig fas, i det här fallet en blandning av aceton och petroleumeter i proportionerna 15:85, i provröret. Ställ provröret stadigt i ett dragskåp. 6. Sänk ner papperet med pigmentranden i röret. Lösningen ska nå papperets nedre kant, men inte randen med pigment. Nu kommer pigmenten att börja vandra på pappret. Efter 15-30 minuter brukar tydliga fält med färger synas, och då kan pappret lyftas upp och läggas på tork. 7. Rita av pappersremsan och märk ut vilka färger de olika fälten har. Ringa in de olika fälten med blyerts. Titta i UV-ljus på remsan, och notera vilka fält som eventuellt fluorescerar. 8. Klipp ut pappersbitar med de olika pigmentfälten, håll reda på vad som är vad. Klipp pappersbitarna i smala remsor och lägg dem i separata provrör. Extrahera ut pigmenten ur pappersbitarna igen genom att skaka dem i ca 3 ml aceton. 9. Ta med samtliga provrör (även ursprungslösningen med blandade pigment) till spektrofotometern. Scanna absorbansen mellan våglängderna 400-700 nm. Markera vid vilken våglängd absorbanstopparna finns för de olika pigmenten. Skriv ut absorbansspektran för pigmenten och rita av dem på overheadplast. 10. Försök med ledning av bifogade strukturformler och spektra avgöra vilka pigment ni hittat. Jämför resultaten med era kurskamraters. Kan man dra några slutsatser angående släktskap mellan gröna landväxter, olika algrupper och bakterier?
Strukturformler för: Cellulosa (papper), lösningsmedel och några plastidfärgämnen Cellulosa (papper) C n (H 2 O) n Petroleumeter (bl.a. oktan) C 8 H 18 Aceton CH 3 -CO-CH 3 Klorofyll a. Gruppen CH 3 byts ut mot CHO i klorofyll b. Klorofyll a och b
ß-karoten i fykoerytrin fykocyanin Fykoerytrin och fykocyanin Mättad bindning i fykoerytrin Fotosyntetiska pigment i olika växtgrupper Klorofyll a Klorofyller Fykobiliner Karotenoider Klorofyll b Fykoerytrin Fykocyanin Karoten Xantofyller Blågröna bakterier + - + +++ + + Grönalger + + - - + + Brunalger + - - - + + Rödalger + - +++ + + + Fröväxter Ormbunkar Fräkenväxter Lummerväxter Mossor + + - - + + Så här kan kromatogrammet se ut: ß-karoten Xantofyll Klorofyll a Klorofyll b Applicering Referenser till absorbtionsspektra Spektra som visar absorbansen för de olika pigmenten finns i ett flertal läroböcker i växtfysiologi och biokemi, t.ex: Mathews, C.K m.fl. Biochemistry. Benjamin/Cummings. 1997 Absorbtionsspektra går även att hitta på webben.