Förändringar i komplexa dentala biofilmer över tid in vitro.

Förändringar i komplexa dentala biofilmer över tid in vitro. Emilia Davey Lydia Tran Handledare: Gunnel Svensäter och Madeleine Blomqvist Examensarbete Masternivå (30 hp) Tandläkarprogrammet Februari 2017 Malmö Högskola Odontologiska fakulteten 205 06 Malmö 1

Sammanfattning Syfte Att undersöka hur tillväxt och succession sker i ett bakteriellt konsortium bestående av vanliga orala bakteriearter vid lågt ph och vid tillgång av glukos i närmiljön. Material & metod Konsortiumet bestod av Streptococcus mutans, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula/dispar, Lactobacillus paracasei, Capnocytophaga gingivalis, Fusobacterium nucleatum, och Actinomyces odontolyticus. Denna bakteriekultur sattes till glukosfattiga lösningar vid ph 5.5 och 7.2, samt till en glukosrik lösning vid ph 7.2 och inkuberades i 37 C. Efter 0, 24 och 48 timmar analyserades bakteriekompositionen samt ph-värdet i bakteriekulturen. Resultat Den procentuella ph-sänkningen var störst i bakteriekulturen med initialt ph 7.2 med tillsats av glukos, och minst i bakteriekulturen med initialt ph 7.2 utan tillsats av glukos. Alla bakteriearter förekom i varierande mängd vid odling, men i takt med ph-sänkning sågs en mer homogen mikroflora som nästan uteslutande dominerades av L. paracasei. Slutsats L. paracasei hade stor förmåga att överleva i detta konsortium oavsett miljöförändring, och visade även på högst syratolerans. Det förekom en samexistens mellan L. paracasei och S. gordonii eller S. oralis oavsett bakteriekultur. Övriga bakterier klarade sig inte lika bra som L. paracasei, däribland S. mutans som inte överlevde i bakteriekulturerna i den utsträckningen som förväntades. 2

Development of complex dental biofilms over time in vitro. Emilia Davey Lydia Tran Supervisor: Gunnel Svensäter and Madeleine Blomqvist Master thesis (30 hp) Program of Dentistry Februari 2017 Malmö University Faculty of Odontology 205 06 Malmö 3

Abstract Introduction The aim of this study was to investigate the outcome of interspecies interactions in vitro in a consortium made of nine commonly isolated oral bacterial strains under different environmental conditions, such as glucose excess. Material and methods The bacterial consortia was comprised of Streptococcus mutans, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula/dispar, Lactobacillus paracasei, Capnocytophaga gingivalis, Fusobacterium nucleatum, and Actinomyces odontolyticus. This complex culture was incubated in glucose-limited and glucose-rich media with different ph at 37 C for 48 hours during which the bacterial composition and ph was analysed at 0, 24, and 48 hours. Results The greatest ph-reduction was seen in the bacterial culture with an initial ph of 7.2 with glucose-excess, and lowest in the culture with an initial ph of 7.2 with glucose-limitation. All species were identified at least once in the experiments, but the diversity was diminished following ph reduction. Conclusion L. paracasei showed great ability to survive in the bacterial cultures, with the highest acid tolerance, regardless of environmental change. Coexistence occurred between L. paracasei and S. gordonii or S. oralis regardless of bacterial culture. Other bacteria did not cope as good as L. paracasei, including S. mutans that did not survive in the bacterial cultures to the extent expected. 4

Innehåll Sammanfattning... 2 Abstract... 4 Introduktion... 6 ph i dentala biofilmer... 8 Motivering av försöksmodell och val av bakterier... 9 Syfte... 13 Frågeställningar... 13 Hypoteser... 14 Material och metod... 14 Beredning av medium... 14 Beredning av bakteriellt konsortium med flera arter... 15 Inkubation... 15 Bakteriell sammansättning av konsortium... 16 ph-mätning... 17 Resultat... 17 Förändring i bakteriesammansättning över tid... 17 Förändringar av ph över tid... 22 Diskussion... 22 Begränsningar... 25 Signifikans... 26 Konklusion... 26 Referenser... 27 Bilaga 1 Bakteriell sammansättning... 30 Bilaga 2 Odling av bakteriekulturer... 36 Bilaga 3 Förändring av ph över tid... 42 5

Introduktion Ekologiska plackhypotesen Det har funnits olika teorier om huruvida bakterier samverkar eller inte i utvecklingen av orala sjukdomar (1, 2). Tidigare har man antagit att en sjukdom orsakas av en eller flera specifika patogener, något man kallade den specifika plackhypotesen. Senare har man dock upptäckt att denna hypotes har brister. Till exempel förekommer karies både i närvaro och i frånvaro av Streptococcus mutans, en patogen som man tidigare trott var ensamt bidragande till karies. Således kan S. mutans förekomma i dentala biofilmer utan att karies uppkommer. En annan hypotes som utvecklades var den ospecifika plackhypotesen, som menar att sjukdom är en följd av mängden dentalt plack. Hypotesen lyfter dock inte faktumet att vissa bakteriearter återfinns i större grad vid sjukdom än vid hälsa. Idag används den ekologiska plackhypotesen för att förklara hur orala sjukdomar kan uppkomma, och hur biofilmens sammansättning kan ändra sig vid hälsa och sjukdom (2, 3). Denna hypotes lyfter fram att dentalt plack är ett mikrobiellt samhälle, där enskilda bakterier interagerar med varandra. Vid hälsa råder homeostas, en balans mellan värd och mikroflora. Om balansen störs, till exempel på grund av förändringar i miljön, kan det gynna vissa mindre dominanta bakterier som normalt förekommer i mikrofloran utan att ge upphov till sjukdom. Dessa bakterier som är potentiella patogener och förknippas med sjukdom, får då större konkurrenskraft än de som förknippas med hälsa. Ekologiska plackhypotesen menar att sjukdomar inte enbart kan behandlas genom att angripa förmodade patogener, eftersom sjukdom inte nödvändigtvis förekommer där patogener finns. Det är därför mer adekvat att angripa de förändringar som kan orsaka en ekologisk obalans som vidare kan leda till sjukdomsutveckling. Exempelvis sker en ekologisk förändring i placksammansättningen vid högt eller frekvent kolhydratintag, som kan orsaka demineralisering av emaljen, vilket startar kariesutveckling i tanden. I samband med behandling av parodontit sker en ekologisk förändring i tandköttsfickor, då icke-specifika bakterier avlägsnas mekaniskt för att minska inflammation. Detta ger en miljöförändring som påverkar förutsättningarna för patologi i området (4). Karies och parodontit är vanliga sjukdomar som kostar patienten och samhället både tid och pengar. I dagsläget råder brist på kunskap om hur placksammansättningen kan manipuleras för att minska förekomsten av dessa sjukdomar. Plackbildning Pellikel bildas på en ren tandyta, med hjälp av salivens proteiner (5). Bakterier transporteras passivt till tandytan med saliven, där de fäster reversibelt till pellikeln genom svaga elektrostatiska attraktionskrafter. Så småningom uppstår irreversibla molekylära interaktioner mellan adhesiner på de primära kolonisatörerna och kolhydratreceptorer i pellikeln. 6

Figur 1. Illustration av plackbildning (Oral biologi, Malmö Högskola). Primära kolonisatörer är främst streptokocker, med medlemmar från mitis-gruppen (Streptococcus gordonii, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis). Koaggregation sker sällan mellan bakterier från samma art, men kan ske hos tidiga kolonisatörer som streptokocker och actinomyceter (6). Dessa egenskaper kan förklara varför streptokocker är mest dominanta bland de tidiga kolonisatörerna. Actinomyces spp. isoleras ofta efter två timmar, även Haemophilus spp. och Neisseria spp. Med tiden får biofilmen en mindre andel streptokocker och flera actinomyceter samt andra gram-positiva bakterier. Sekundära kolonisatörer kan sedan fästa till de primära, ofta genom så kallad koadhesion. Utöver dessa tidiga kolonisatörer kommer ytterligare bakterier, sena kolonisatörer, bli en del av biofilmen. Fusobakterier har visat sig kunna koaggregera med flest bakterier, både tidiga och sena kolonisatörer, men inte med varandra. De komplexa interaktionerna som sker vid mikrobiell succession leder till en mogen biofilm som underlättar bakteriell interaktion. I Figur 1 visas en illustration av plackbildning. Genuttrycket hos en mikroorganism kan skilja sig beroende på om organismen befinner sig i en vätska eller om den har kontakt med en yta. Det påverkas sannolikt också av lokala miljöförändringar, såsom sockerkoncentration och ph. En viktig komponent i plackmatrixen är de extracellulära polysackariderna som strukturerar, innesluter vatten och näringsämnen, samt skyddar. Biofilmen kan avlägsnas mekaniskt, men bakterierna kan också aktivt lösgöra sig ifrån biofilmen för att kolonisera på andra ställen i munnen. (5). Samverkan mellan bakterier Obligat anaeroba arter ses sällan i den tidiga biofilmen. Näring och metaboliter från tidiga kolonisatörer kan ändra miljön och därmed påverka vilka bakterier som kan tillväxa, till exempel kan Neisseria skapa en syrefattig miljö där obligat anaeroba bakterier trivs. Mikrobiella interaktioner har alltså stor inverkan på hur mikrofloran är sammansatt. Det förekommer både synergistisk och antagonistisk interaktion mellan mikroorganismerna, det vill säga interaktion till deras fördel respektive nackdel. Exempel visas i Figur 2. Synergistiska interaktioner innebär att tillväxten av en mikroorganism kan gynnas av eller helt vara beroende av en annan organism. Till exempel kan S. oralis bryta ner kolhydratskedjor i glykoprotein, vilket i sin tur exponerar proteindelen som andra mikroorganismer, bland annat Fusobacterium nucleatum, kan ta del av. S. oralis har dessutom förmågan att bilda IgA-proteaser, vilket hjälper dem och andra bakterier att överleva värdförsvaret. Ett annat exempel på synergistisk interaktion är att Veillonella spp. kan bryta ner laktat som bildats vid andra bakteriers kolhydratmetabolism, och ge restprodukter i form av acetat. Synergistisk interaktion innebär även koaggregation, cell-cellsignalering och genöverföring. Celler som befinner sig nära varandra i en biofilm har 7

förmåga att signalera med varandra vilket gör att de känner av och kan anpassa sig efter miljöförändringar. Antagonistiska interaktioner har negativ påverkan på andra bakterier. De flesta bakterier, framför allt streptokocker, utsöndrar antagonistiska substanser, så som bakteriociner eller bakteriocin-liknande ämnen. Dessa proteiner hämmar tillväxten hos andra bakterier och kan vara till fördel vid kolonisering. Andra hämmande substanser som bildas av plackbakterier är organiska syror, väteperoxid, och enzymer. Lågt ph till följd av kolhydratmetabolism kan också hämma vissa mikroorganismer. De antagonistiska faktorerna är aldrig så omfattande att de helt utkonkurrerar en bakterieart, eftersom de lever i en komplex biofilm. Antagonistiska interaktioner hindrar även exogena arter från att kolonisera. (5). Glukos, maltos, sackaros O2 O 2 butyrat CO 2 Fusobacterium O 2 Streptococcus H 2 O 2 Lactobacillus laktat Veillonella Capnocytophaga CO 2 laktat Actinomyces acetat succinat acetat Aminosyror katalas Glukos Figur 2. Illustration av möjliga interaktioner mellan bakteriearter. Rosa pil indikerar näringsämnen. Blå pil indikerar resultat från metabolism. Grå pil indikerar synergistisk interaktion där streptokocker använder syre, vilket gör miljön anaerob för exempelvis F. nucleatum. ph i dentala biofilmer Många organismer kräver ett neutralt ph för att växa, och är känsliga för större skiftningar. Saliven påverkar munnens ph, och medelvärdet för ostimulerad helsaliv ligger mellan 6.25 och 7.25 (7). Vid förtäring bidrar många sackarolytiska bakterier till ett lågt ph till följd av sockermetabolismen, men få arter överlever vid sådana förhållanden under längre tid. Utmärkande för kariogena bakterier som till exempel mutansstreptokocker och laktobaciller, är deras förmåga att kunna leva i låga ph-värden, genom att bibehålla en intracellulär phhomeostas. Det finns även bakterier som har förmågan att höja intracellulärt ph genom produktion av basiska ämnen. Det finns tidigare studier om bakterier och ph-förändringar (8, 9). I en av dem studerades ett konsortium bestående av nio olika bakterier i kemostater, avseende ph-sänkning till följd av glukostillsats, för att se om och när en skiftning i mikrofloran inträffade (9). Bakterierna i denna studie var S. mutans, S. oralis, S. gordonii, Lactobacillus rhamnosus, Actinomyces naeslundii, Neisseria subflava, Veillonella dispar, Prevotella nigrescens and F. nucleatum. Resultatet man fick då var att mängden syratoleranta bakterier, S. mutans och L. rhamnosus, ökade i takt med ph-sänkningen, samtidigt som de 8

mindre syratoleranta arterna (F. nucleatum, P. nigrescens, S. gordonii, och S. oralis) minskade i antal. Resultaten tydde på att en sänkning till ph 4.5 5.5 möjligen kunde förbättra chanserna för potentiellt patogena arter, medan de som förknippas med hälsa förblev relativt opåverkade. När ph sjönk till under 4.5, fick de förmodade patogenerna troligtvis ökad konkurrenskraft, medan tillväxt och metabolism hämmades hos arterna som förknippas med hälsa. Även ph-sänkningens hastighet verkar ha varit av vikt, då en snabb ph-sänkning gav en mer radikal skiftning i mikrofloran än när ph-sänkningen fick ske långsamt. Till skillnad från den här studien kommer försöken inte att utföras i kemostater. Dessutom studeras ett annat konsortium i tre olika medium, med eller utan tillsats av glukos, och med varierande initiala ph-värden. Motivering av försöksmodell och val av bakterier Det finns tidigare studier som har använt sig av konsortium bestående av flera bakterier (2, 10). I en studie användes plack vilket var tidskrävande, resultaten var svåra att tolka och försöket var svårt att reproducera. I en annan studie skapades konsortium av nio olika bakteriearter, där varje bakterieart odlats separat och sedan inkuberats tillsammans i miljöer med och utan glukosöverskott vid ph 7. Fördelar med detta var att relevanta och lättidentifierade bakteriestammar kunde väljas, och att sammansättningen kunde formas beroende på försök. Dessutom kunde detta konsortium lagras och användas igen, vilket gjorde försöken reproducerbara. Metoden har använts vid upprepade tillfällen. I denna studie har ett konsortium använts vars bakteriesammansättning kan ses i Tabell 1 samt illustreras i Figur 3. Dessutom har en annan försöksmodell valts, där bakterierna odlas i en biofilm och inte planktoniskt. Biofilmen ska efterlikna ett artificiellt plack in vitro. Bakterierna undersöks i en multibakteriell miljö istället för renkulturer, vilket blir mer verklighetstroget och ger chans till samverkan mellan flera bakteriearter i enighet med den ekologiska plackhypotesen. Urvalet av bakterier är tänkt att spegla en frisk munflora med en bred mikrobiell variation avseende beteende, miljöpreferenser och förekomst (2). Ett annat kriterium var att de skulle vara lätta att urskilja för att förenkla artbestämning. Bakterierna som användes var dessutom lättillgängliga då de togs från fakultetens biobank. Vilka bakterier som inkluderats framgår i Tabell 1. Tabell 1. Bakteriearter som ingår i studien. Gram-positiva kocker Streptococcus mutans Streptococcus intermedius Streptococcus oralis Streptococcus gordonii Gram-positiva stavar Actinomyces odontolyticus Lactobacillus paracasei Gram-negativa kocker Veillonella parvula/dispar Gram-negativa stavar Capnocytophaga gingivalis Fusobacterium nucleatum 9

Bakteriestam Streptococcus spp. Actinomyces odontolyticus Capnocytophaga spp. Lactobacillus Fusobacterium Figur 3. En mikroskopisk bild av det konsortium som användes i denna studie. (Oral biologi, Malmö Högskola) Streptococcus mutans, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis och Streptococcus gordonii. Streptokocker är gram-positiva kocker som ofta förekommer i munfloran (11). De kan särskiljas från varandra, och det finns mycket skrivet om arterna. De är därför fördelaktiga att inkludera i laborativa försök. Interaktionerna hos orala streptokocker är mångfacetterade, och sker inom samma art, mellan olika arter, samt med värden. Många interaktioner är fortfarande okända (12). Streptokocker är indelade i fyra undergrupper: mutans, salivarius, anginosus, mitis. Bakterier i mutansgruppen kan vara opportunistiska patogener och intresset för dem är stort på grund av deras roll i kariesutveckling. Gruppen förekommer ofta i dentalt plack vid karieslesioner, och mer sällan på frisk emalj. Mutansstreptokocker hittar effektivt socker från kosten och kan snabbt konvertera det till organiska syror, främst laktat som förknippas med kariesutveckling. De kan även växa och överleva under de sura förhållanden som skapas, genom att bibehålla ett intracellullärt ph på 7.5. Utvecklingen av syratolerans kan eventuellt vara beroende av adhesion till en yta (13). Mutansstreptokocker bidrar till plackmognad genom produktion av lösliga och olösliga extracellulära polysackarider som glukan, mutan Figur 4. Fotografi på koloni av S. mutans och fruktan från sackaros. Gruppen kan även syntetisera odlad på blodagar. intracellulära polysackarider när det finns överskott på socker, vilket kan användas som kolhydratsreserv och konverteras till syror när det råder underskott på socker. S. mutans är den vanligaste ur gruppen vid utveckling av karies. Trots sin ringa utsträckning i normalfloran är S. mutans välstuderad och därmed intressant ur just kariessynpunkt, vilket gör den lämplig i dessa försök. S. mutans och S. gordonii kan ha antagonistisk effekt genom att hämma tillväxten hos varandra (12, 14). Till exempel kan S. gordonii inaktivera en peptid hos S. mutans, vilket gör S. mutans mindre resistens mot antimikrobiella substanser i saliven, och minskar S. mutans produktion av bakteriociner. I Figur 4 ses ett fotografi av S. mutans på blodagar. Salivariusgruppen hittas främst på slemhinnor och var därför inte lämpliga i denna studie, som har fokus på supragingivala biofilmer. 10

Anginosusgruppen isoleras ofta från dentalt plack och slemhinneytor. Gruppen innefattar bland annat Streptococcus intermedius som är en del av normalfloran i munhålan (15). S. intermedius är sackarolytisk och producerar stora mängder laktat från bland annat glukos (16). Det är däremot ingen i anginosusgruppen som producerar extracellulära polysackarider av sackaros (11). Sura förhållanden kan eventuellt gynna dess biofilmsbildning (17). S. intermedius producerar även enzymer (sialidas och hyaluronidas) som förstör värdens vävnad och konverterar den troligen till näringsämnen som kan användas till bakteriell tillväxt (18). I mitisgruppen ingår bland annat S. oralis och S. gordonii. En av de vanligaste bakterierna i mitisgruppen är S. oralis. De bildar syror från bland annat glukos, fruktos, galaktos, laktos och maltos. De producerar även neuraminidas, ett enzym som avlägsnar sialinsyra från Figur 5. Fotografi på koloni av S. oralis oligosackaridens sidokedja på mucin i saliven. Vissa odlad på blodagar. bakteriestammar från S. oralis kan producera extracellulärt glukan från sackaros. S. oralis kan bilda IgA-proteas och väteperoxid (19). I Figur 5 ses ett fotografi av S. oralis på blodagar. S. gordonii förekommer inte i så stor utsträckning, men är intressanta att studera då de är primära kolonisatörer. De bildar syror från bland annat glukos, fruktos, galaktos, laktos och maltos. De kan bilda lösliga och olösliga glukaner från sackaros, vilket bidrar till plackbildning. För att möjliggöra nedbrytning av stärkelse binder S. gordonii till alfa-amylas i saliven. Bindningen till amylas kan även dölja bakteriella antigener vilket gör att organismen kan undvika värdförsvaret. Kolonisering av S. gordonii anses vara förmånligt för värden då de bidrar till ph-homeostas (20). Genom att bryta ner arginin från saliven och kosten, och producera bland annat ammoniak, koldioxid, och ATP, ökar syratoleransen eftersom det neutraliserar cytoplasman och omgivande miljö. S. gordonii anses dock bara vara en svagt syratolerant bakterie i jämförelse med S. mutans. Lactobacillus paracasei Laktobaciller karakteriseras av laktatproduktion som den enda eller främsta slutprodukten från kolhydratsmetabolism (21). De är fakultativt anaeroba och återfinns ofta i munhålan, speciellt i plack och på tungan, men utgör endast en liten del av den totala odlingsbara mikrofloran. Lactobacillus paracasei är en av de mest förekommande arterna i släktet. Laktobaciller är acidogena och förknippas med karieslesioner som når dentinet. Antalet laktobaciller i munnen motsvarar individens kolhydratintag (11). Man vet inte mycket om vilken miljö laktobaciller gynnas av, förutom att de klarar av att påbörja kolonisation i låga ph-värden och är de mest syratoleranta bakterierna i dentalt plack (22). Av den här anledningen är de intressanta att använda i försöken. I Figur 6 ses ett fotografi av L. paracasei på blodagar. Figur 6. Fotografi på koloni av L. paracasei odlad på blodagar. 11

Actinomyces odontolyticus Actinomyces spp. är gram-positiva, anaeroba eller fakultativt anaeroba stavar som utgör en stor del av mikrofloran i dentalt plack, speciellt approximalt och i tandköttsfickor (23). De finns vid tidig plackbildning och koaggregrar initialt med varandra, men därefter även med streptokocker (5). Actinomyces spp. är acidogena (24) och fermenterar glukos vilket ger slutprodukter som succinat, acetat och laktat. Actinomyces spp. är inte lika syratoleranta som S. mutans och laktobaciller (7), men de förknippas ändå med rotytekaries. De ökar även i antal vid gingivit. Den vanligaste arten i dentalt plack är A. naeslundii (11). A. naeslundii och Actinomyces odontolyticus är tidiga kolonisatörer i munnen hos barn. A. odontolyticus bildar i 50 procent av fallen kolonier med karakteristiska rödbruna pigment vid odling på blodagar, vilket gör dem lättidentifierade och fördelaktiga att ha med i försöken. I Figur 7 ses ett fotografi av A. odontolyticus på blodagar. A. odontolyticus valdes därför istället för den mer Figur 7. Fotografi på koloni av A. odontolyticus odlad på blodagar. vanligare arten A. naeslundii. A. odontolyticus är en viktig medlem i den supra- och subgingivala biofilmen, och förknippas med tidiga stadier av emaljdemineralisering och progression av små karieslesioner (11, 25). A. odontolyticus har förmågan att adherera till ytor och koaggregera med andra orala bakterier. De är liksom fusobakterier sekundära kolonisatörer som kan binda samman tidiga och sena eventuellt mer patogena kolonisatörer. Veillonella parvula och Veillonella dispar Det finns 11 arter inom gruppen Veillonella, där Veillonella parvula och V. dispar är de mest dominanta (26, 27). Veillonella är obligat anaeroba, gram-negativa kocker som ofta finns på tunga, buckal mukosa och i dentalt plack som en del av normalfloran (26). Veillonella verkar dock ha begränsad förmåga att fästa till värdens vävnad. De fäster svagt till salivtäckt hydroxylapatit, och endast en liten mängd hittas på tandytor en timme efter rengöring. De har däremot visat sig koaggregera med många orala bakterier, som Streptococcus salivarius, S. mutans och Actinomyces viscosus. V. parvula utgör större delen av Veillonella-floran i subgingivalt plack, där de koaggregerar med subgingivala bakterier som Streptococcus sanguinis och A. naeslundii. V. dispar förekommer också i det subgingivala placket, men är mer dominant på ställen utanför, och koaggregerar med bakterier exempelvis på tungan. Veillonella kan inte metabolisera kolhydrater. De konsumerar istället laktat, gruvat, malat, fumarat, och/eller oxalacetat (26, 28). Slutprodukter från metaboliseringen blir acetat, propionat, koldioxid, och väte som källa till energi. Deras restprodukter kan ge näring till bakterier som Porphyromonas och Prevotella. Genom att använda laktat från kolhydratfermenterande laktobaciller, S. mutans, Actinomyces spp., kan Veillonella minska laktatkoncentrationen genom att omvandla dessa till svagare syror. Detta kan i sin tur påverka kariesprocessen, eftersom de svagare syrorna inte kan bryta ner emaljen (27). I försöken inkluderas V. parvula/dispar, de två vanligaste arterna i gruppen som tillhör normalfloran och har en känd samverkan med bland annat streptokocker och laktobaciller. Den stam av Veillonella som används kan inte särskiljas med 16S sekvensering mellan de båda arterna V. parvula och V. dispar. För att särskilja dem krävs ytterligare sekvensering, därför benämns de i försöken som V. parvula/dispar. 12

Capnocytophaga gingivalis Capnocytofager är gram-negativa fakultativt anaeroba stavar som är en liten del av normalfloran och kan hittas i subgingivalt plack, men ökar i antal vid gingivit (29, 30). De är opportunistiska patogener och har isolerats från flera infektioner hos immunnedsatta patienter. De bildar enzymer som kan ha virulenta egenskaper genom att direkt bryta ner parodontal vävnad, men även indirekt genom att bidra till produktion av bradykinin som har inflammatorisk potential (29). Vissa stammar producerar IgA1-proteas som kan inaktivera immunrespons från mukosan (11). De kräver koldioxid för tillväxt och fermenterar glukos, maltos, sackaros, och mannos (29), med acetat och succinat som sura slutprodukter (31, 32). I försöken används Capnocytophaga gingivalis då det var den enda arten ur capnocytophaga som fanns sekvenserad på laboratoriet vid laborationstillfället. I Figur 8 ses ett fotografi av C. gingivalis på blodagar. Fusobacterium nucleatum Fusobakterier är gram-negativa, obligat anaeroba stavar och finns ofta i friska tandköttsfickor. De har inte glukos som främsta energikälla, men kan vid brist på aminosyror ta upp kolhydrater för syntes av makromolekyler intracellulärt (33-35). Små mängder av det intracellulära sockret kan utsöndras då det är brist på socker i omgivningen, vilket gynnar andra bakterier (36). Fusobakterier får sin huvudsakliga energi genom att bryta ner aspartat, glutamat, histidin och lysin som fås i form av fria aminosyror eller peptider som innehåller dessa. Största restprodukten från metabolismen är butyrat. F. nucleatum är den vanligaste arten i gruppen. F. nucleatum kan bryta ut svavel från cystein och metionin och producerar då ammoniak, butyrat, vätesulfid och metylmerkaptan, vilket ger upphov till lukter som förknippas med halitosis (11). Fusobakterier kan aggregera med de flesta andra bakterier, och tros därför vara viktig som förbindelse mellan tidiga och senare kolonisatörer vid plackbildning. Fusobakterier har även förmågan att producera vävnadsirritanter (37-40) och kan leva synergistiskt med andra bakterier i olika infektioner (41). Dessa egenskaper och att fusobakterier finns i stort antal i tandköttsfickor, gör att de kan ha en patogen potential (37, 38, 42). I Figur 8. Fotografi på koloni av C. gingivalis odlad på blodagar. Figur 9. Fotografi på koloni av F. nucleatum odlad på blodagar. tandköttsfickor kan F. nucleatum få peptider från Porphyromonas gingivalis hydrolytiska aktivitet (43). I Figur 9 ses ett fotografi av F. nucleatum på blodagar. Syfte Se hur ett konsortium bestående av nio olika orala bakteriearter påverkas in vitro i olika ph samt vid närvaro/frånvaro av glukos, avseende samverkan och succession. Frågeställningar Hur påverkas bakteriesammansättningen, det vill säga sker det någon succession, vid ph 5.5, ph 7.2 och ph 7.2 med glukos? Kan placksammansättningen manipuleras så den förknippas med oral hälsa? 13

Hypoteser Succession vid lågt ph Ju lägre ph desto mer dominanta kommer S. mutans och L. paracasei att vara, dels för att deras aktivitet fungerar optimalt i en sur miljö, och dels för att de kan börja kolonisera trots det låga ph-värdet (24). Tack vare kolonisering av syratoleranta bakterier, kommer bakteriesuspensionens ph att sjunka ytterligare. Övriga bakterier kommer att finnas i mindre mängd, men då vara inaktiva och inte öka i antal efter 24 timmar. Succession vid låg glukostillgång De tidiga fakultativt anaeroba kolonisatörerna S. oralis, S. intermedius och S. gordonii kommer att vara de dominerande både initialt och efter 48 timmar. De reducerar syremängden då det används vid metabolism av kolhydrater, vilket gör att även de anaeroba bakterierna överlever trots aerob miljö. Syran som bildas vid fermenteringen sänker även phvärdet. Den anaeroba och något surare miljön som utvecklas, ger mer gynnsamma tillväxtförhållanden för S. mutans och L. paracasei. Tillgången på kolhydrater och möjligheterna att sänka ph ytterligare är dock för små för att dessa bakterier ska kunna dominera. F. nucleatum och V. parvula/dispar är anaeroba och trivs bäst i basisk miljö. De har även stor koaggregationsförmåga med andra bakterier och kan genom samverkan fylla sina behov. Till exempel metaboliserar V. parvula laktat (44). Dessa förutsättningar gör att de förekommer vid start, men i mindre mängd senare på grund av ph-sänkningen. Samverkan mellan de sackarolytiska och proteolytiska bakterierna kommer att ge en viss balans som gör att ph inte sjunker drastiskt. Succession vid hög glukostillgång Då glukos tillsätts får de sackarolytiska bakterierna näring, vilket leder till ökad metabolism och en mer anaerob miljö som följd. S. mutans och L. paracasei har egenskaper som gör att deras aktivitet kan fortsätta trots hög glukosnivå (24), vilket gör att de kan dominera till skillnad från övriga sackarolytiska bakterier. Deras glukosmetabolism kommer att leda till syrabildning och ph-sänkning som blir större än i föregående medium. ph-sänkningen kommer att gynna de syratoleranta arterna S. mutans och L. paracasei som har optimal aktivitet vid lågt ph (24). Till följd av deras aktivitet kommer ytterligare ph-sänkning att ske, och försämra tillväxtmöjligheter för de bakterier som inte trivs i lågt ph. C. gingivalis, F. nucleatum och V. parvula/dispar, kommer under de första 24 timmarna inte kunnat växa lika mycket som resterande bakterier, då de trivs bäst i anaerob miljö. Material och metod Beredning av medium För att skildra olika tillstånd i munnen valdes medium med olika ph-värden. Två av tre medium gavs ett neutralt ph på 7.2. För att spegla ph-förändring vid förtäring tillsattes glukos till ett av de två medium med neutralt ph som utgångsläge. Det tredje mediumet fick ph 5.5 för att återge miljön när ph sjunkit till emaljens kritiska ph-värde (45), eftersom det är intressant att studera hur bakterierna samverkar i denna miljö. Medium med ph 5.5 15 g Todd Hewitt odlingsmedium (Becton Dickinson, Sparks, MD 21152 USA) löstes i 500 ml dh 2 O och steriliserades i 15 minuter i 121 C. Därefter späddes det till 25 % med steril PBS ph 5.5. ph justerades vid behov med 10 % HCl och sterilfiltrerades med 0,2 µm filter. 14

Medium med ph 7.2 15 g Todd Hewitt odlingsmedium löstes i 500 ml dh 2 O och steriliserades i 15 minuter i 121 C. Därefter späddes det till 25 % med steril PBS ph 7.2. ph justerades vid behov med 10 % HCl och sterilfiltrerades. Medium med ph 7.2 med tillsats av glukos Stocklösning 200 mm glukos sterilfiltrerades (0,2 µm filter), och späddes till 10 mm i 25 % Todd Hewitt med ph 7.2 precis innan inokulering av mediumet. Beredning av bakteriellt konsortium med flera arter Nio bakteriearter från avdelning Oral biologi, Malmö högskola, användes i försöken: S. mutans (B4B), S. intermedius (31B:D), S. oralis (89C), S. gordonii (JD13A), V. parvula/dispar (10BB), L. paracasei (B4I), C. gingivalis (BK:F), F. nucleatum (BK:O), A. odontolyticus (G3H). Stammarna var färska isolat från friska personer. Artbestämning av dessa utfördes genom sekvensering av 16S rrna på Klinisk mikrobiologi, Labmedicin Skåne i Lund. 1µl av varje bakterieart inokulerades med hjälp av en inokuleringsloop till varje medium. Bakteriesuspensionerna skakades under 30-60 sekunder i ett 15 ml rör. Inkubation Bakteriesuspensionen överfördes till 12-Well Tissue Culture Plates (VWR International, Fagerstagatan 18A, 163 94 Stockholm, Sverige), 2 ml/brunn, och två brunnar per medium. Från varje bakteriekultur överfördes 100 µl i duplikat till tre Nunc MicroWell 96-Well Microplates (VWR International, Fagerstagatan 18A, 163 94 Stockholm, Sverige), en platta för varje tidpunkt. Som kontroll användes medium utan bakterier. Plattorna med 12 respektive 96 brunnar inkuberades i 0, 24 och 48 timmar i 5 % CO 2 vid 37 C. För att förhindra avdunstning placerades plattorna i en fuktkammare. Varje försök gjordes minst i duplikat, två gånger oberoende av varandra. En illustration av arbetsgången ges i Figur 10a-b. Figur 10a. Arbetsgång för inkubation i försök A. 15

Figur 10b. Arbetsgång för inkubation i försök B. Bakteriell sammansättning av konsortium 200 µl av varje bakteriekultur späddes ut efter 0, 24 och 48 timmar i 1800 µl prereducerat dilution blank, en buffrande salt- och minerallösning med reduktionsmedel (L-cystein) för att bibehålla viabiliteten av framförallt anaeroba bakterier. I försök A späddes provet 10 6 gånger. Från bakteriekulturer spädda och 10 6 sattes 200 µl ut på blodagar och inkuberades anaerobt under 7 dagar i 37 C. Vid 24 och 48 timmar avlägsnades biofilmen i brunnarna med en cellskrapa och suspenderades i mediumet innan efterföljande utspädningar. I försök B späddes varje bakteriekultur gånger. Bakteriekultur 10 3, 10 4 samt sattes sedan ut på blodagar. En illustration av arbetsgången ges i Figur 11. Figur 11. Arbetsgång för odling. Efter 7 dagars växt på blodagar, artbestämdes bakteriekolonierna med hjälp av gramfärgning, morfologi och flertalet biokemiska test. Gram-positiva, katalas-negativa kocker i 16

kedjor antogs vara streptokocker och identifierades ner på subspecies-nivå med biokemiska test (19). Gram-negativa kocker identifierades som Veillonella baserat på morfologi samt anaerob växt stimulerad av laktat, ej av glukos. Gram-negativa långa smala stavar särskildes mellan Capnocytophaga och Fusobacterium genom morfologi, lukt samt förmåga att växa aerobt. Actinomyces och Lactobacillus, som båda är gram-positiva stavar, identifierades genom morfologi, gramfärgning samt biokemiska test (46-48). ph-mätning ph mättes i 96-brunnsplattorna vid start, 24, och 48 timmar, med hjälp av en ph-meter. En illustration av arbetsgången ges i Figur 12. Figur 12. Arbetsgång för ph-mätning. Resultat Förändring i bakteriesammansättning över tid Redovisning av resultat fokuserar på förhållanden efter 24 timmar. Vid 48 timmar hade merparten bakterier dött eller minskat avsevärt i antal till följd av kontinuerlig celldelning, en situation som inte hade uppstått i en verklig oral miljö. Förhållanden efter 48 timmar är därför inte relevanta att analysera vidare. Resultaten tolkas utifrån två kategorier; bakterier som överlevt och bakterier som haft en tillväxt efter 24 timmar jämfört med start. Bakterieöverlevnad definieras som en skillnad understigande en tiopotens eller att bakterien minskat i antal men finns kvar över detektionsnivå. Bakterietillväxt definieras som en ökning av minst en tiopotens. Försök A Försök A:1 och A:2 gav varierande resultat vid undersökning av bakteriesammansättningen vid start och 24 timmar. Odling av bakteriekulturerna vid start visade en blandad sammansättning av de nio tillsatta bakterierna i alla tre bakteriekulturer. Försök B Försök B:1, B:2 och B:3 visade alla en dominans av L. paracasei och en variation på resterande bakterier. Vid odling av bakteriekulturerna vid start var L. paracasei mest förekommande, följt av S. gordonii. I Figur 13, 15 och 17 presenteras medelvärden av bakteriesammansättningen i varje bakteriekultur i försök A:1 och A:2 respektive B:1, B:2 och B:3. För exakta siffror samt fotografier av blodagar se Bilaga 1 respektive 2. Bakteriekultur vid ph 5.5 Vid start i försök A var spridningen av bakterietalen stor, där C. gingivalis förekom i störst antal cfu (9.5 x 10 6 ). Därefter förekom bakterier i fallande ordning; F. nucleatum, L. paracasei, A. odontolyticus, S. oralis, S. gordonii, V. dispar/parvula (2.5 x ). Ingen S. 17

mutans förekom över detektionsnivå > 5x10 3 cfu/ml. Vid 24 timmar var spridningen mindre, med dominans av L. paracasei (3.2 x 10 7 ), följd av S. oralis (1.1 x 10 7 ), och enstaka kolonier av A. odontolyticus (2.0 x 10 6 ) och S. gordonii (1.0 x 10 6 ). Sammanfattningsvis överlevde A. odontolyticus, och S. gordonii efter 24 timmar, medan S. oralis och L. paracasei dessutom hade ökad tillväxt. Vid start i försök B förekom L. paracasei i störst antal (6.2 x 10 7 ), följd av enstaka kolonier S. gordonii, V. dispar/parvula, S. mutans, A. odontolyticus, S. intermedius och F. nucleatum (1.5 x ). S. oralis och C. gingivalis förekom ej över detektionsnivå > 5x10 3 cfu/ml. Vid 24 timmar var L. paracasei fortsatt dominant (6.8 x 10 7 ), och endast en koloni A. odontolyticus (2.5 x ) förekom. Sammanfattningsvis överlevde L. paracasei och A. odontolyticus efter 24 timmar. L. paracasei dominerade stort i både försök A och B vid ph 5.5. Se Figur 13-14. Bakteriekultur vid ph 7.2 Vid start i försök A dominerade S. mutans (1.8 x 10 7 ), följd av F. nucleatum, C. gingivalis, L. paracasei, S. intermedius, S. oralis, S. gordonii och V. dispar/parvula (1.3 x 10 6 ). A. odontolyticus förekom inte över detektionsnivå > 5 x 10 3 cfu/ml. Vid 24 timmar dominerade S. oralis (2.8 x 10 7 ), följd av L. paracasei (6.0 x 10 6 ). Sammanfattningsvis överlevde L. paracasei efter 24 timmar, medan S. oralis hade en ökad tillväxt. Vid start i försök B dominerade L. paracasei stort (5.7 x 10 7 ), följd av S. gordonii och ett fåtal kolonier av V. dispar/parvula, A. odontolyticus, S. intermedius, S. mutans, och F. nucleatum (1.5 x ). Ingen S. oralis eller C. gingivalis förekom över detektionsnivå > 5 x 10 3 cfu/ml. Vid 24 timmar dominerade L. paracasei (1.9 x 10 7 ), och enstaka kolonier av S. oralis (2.8 x ) och S. gordonii (6.7 x 10 4 ) fanns. Sammanfattningsvis överlevde S. gordonii och L. paracasei, medan S. oralis hade en ökad tillväxt. Sammantaget för både försök A och B överlevde L. paracasei, och S. oralis ökade i tillväxt. Se Figur 15-16. Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos Vid start i försök A var samtliga bakterier representerade. Vid 24 timmar förekom L. paracasei i störst antal (1.2 x 10 7 ) följd av S. gordonii (5.8 x 10 6 ), S. oralis (1.0 x 10 6 ) och S. intermedius (7.5 x ). Sammanfattningsvis överlevde S. gordonii, S. oralis och S. intermedius efter 24 timmar medan L. paracasei hade en ökad tillväxt. Vid start i försök B förekom L. paracasei i störst antal (4.2 x 10 7 ), följd av S. gordonii (4.0 x 10 6 ) och enstaka kolonier A. odontolyticus, V. dispar/parvula, S. mutans och S. intermedius (5.0 x 10 4 ). Vid 24 timmar var L. paracasei fortsatt dominant (5.7 x 10 7 ), följd av S. gordonii (3.0 x 10 6 ), S. oralis (1.2 x 10 6 ) och A. odontolyticus (1.0 x 10 6 ). A. odontolyticus, S. gordonii och S. oralis överlevde efter 24 timmar, medan L. paracasei hade en ökad tillväxt. Sammantaget för både försök A och B överlevde S. gordonii och S. oralis, medan L. paracasei ökade i tillväxt. Se Figur 17-18. 18

ph 5.5 - Försök A:1 och A:2 ph 5.5 - Försök B:1, B:2 och B:3 100 90 100 90 6.2x10 7 6.8x10 7 80 3.2x10 7 80 70 70 60 60 Procent 50 40 9.5x10 6 Procent 50 40 30 20 4.0x10 6 1.1x10 7 30 20 10 0 1.0x10 6 0 h 24 h 10 0 4.3x10 6 <5x10 3 0 h 24 h Figur 13. Fördelning av bakterier angivet i procent från försök A respektive B (medelvärde), i bakteriekultur vid ph 5.5. Siffror angivna vid punkterna motsvarar det reella antalet bakterier. A. odontolyticus F. nucleatum L. paracasei L. paracasei S. oralis A. odontolyticus Figur 14. Fotografi på blodagar efter odling (0 respektive 24 timmar) i bakteriekultur vid ph 5.5, i försök A. 19

100 ph 7.2 - Försök A:1 och A:2 ph 7.2 - Försök B:1, B:2 och B:3 100 90 90 1.9x10 7 80 70 60 80 70 60 5.7x10 7 Procent 50 40 1.8x10 7 2.8x10 7 Procent 50 40 30 30 20 10 2.3x10 6 6.0x10 6 20 10 5.2x10 6 2.8x 0 0 Figur 15. Fördelning av bakterier angivet i procent från försök A respektive B (medelvärde), i bakteriekultur vid ph 7.2. Siffror angivna vid punkterna motsvarar det reella antalet bakterier. L. paracasei S. oralis S. oralis S. mutans L. paracasei Figur 16. Fotografi på blodagar efter odling (0 respektive 24 timmar) i bakteriekultur vid ph 7.2, i försök A. 20

ph 7.2 + glukos - Försök A:1 och A:2 100 ph 7.2 + glukos - Försök B:1, B: 2 och B:3 100 90 90 4.2x10 7 Procent 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1.2x10 7 5.8x10 6 80 5.7x10 7 70 60 50 40 30 6.3x10 6 3.0x10 6 20 4.0x10 6 1.0x10 6 10 1.2x10 6 0 h 24 h 0 Procent Figur 17. Fördelning av bakterier angivet i procent från försök A respektive B (medelvärde), i bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos. Siffror angivna vid punkterna motsvarar det reella antalet bakterier. S. oralis L. paracasei L. paracasei F. nucleatum A. odontolyticus Figur 18. Fotografi på blodagar efter odling (0 respektive 24 timmar) i bakteriekultur vid ph 7.2 och tillsats av glukos, i försök A. 21

Förändringar av ph över tid Följande diagram visar medelvärden av försök A för respektive bakteriekultur. Resultat för försök A återspeglade sig i försök B. Vid mätning av ph efter 0, 24 och 48 timmar kunde en sänkning av ph ses i alla tre bakteriekulturer, där största sänkningen sågs i bakteriekulturen vid ph 7.2 med glukostillsats, följt av bakteriekulturen vid ph 5.5 och sist bakteriekulturen vid ph 7.2. Störst sänkning av ph ägde rum inom 24 timmar i samtliga bakteriekulturer. ph i kontrollerna hade också sänkts något. Resultaten redovisas i Figur 19. För exakta värden se Bilaga 2. ph 5.5 ph 7.2 ph 7.2 + glukos 8 8 8 7,5 7,5 7,5 7 7 7 6,5 6,5 6,5 6 6 6 ph 5,5 5,5 5,5 5 5 5 4,5 4,5 4,5 4 4 4 3,5 3,5 3,5 3 Tid 3 Tid 3 Tid Kontroll Bakteriekultur Figur 19. ph-förändringar i respektive bakteriekultur (+/- 1 S.D). Diskussion I studien har biologiskt material använts, det vill säga något levande som inte har ett konstant tillstånd, vilket kan begränsa reproducerbarheten. Användning av bakteriekonsortium är en standardiserad metod, men kräver rätt förutsättningar för att bli reproducerbar, exempelvis är det fördelaktigt om samma personer utför försöken. Dessutom gör ett definierat konsortium att försöken blir mer reproducerbara än om naturligt dentalt plack hade använts. Fördelen då är att samma bakterierarter kan användas och att man kan kontrollera att de finns med i varje försök. I denna studie utfördes dock försök A och B med en tids mellanrum, vilket kan ha gjort att bakteriernas skick skiftat. I försök B observerades en påtaglig dominans av L. paracasei, jämfört med i försök A, trots nära på identiskt utförande. Vad detta beror på kan enbart hypotetiseras om, men möjligtvis fick de övriga bakterierna minskad motståndskraft med tiden, alternativt har L. paracasei fått ökad motståndskraft. Något som emellertid upptäcktes var liknande tendenser inom försöken, vilket tyder på en viss reproducerbarhet inom samma försökstillfälle. 22

ph Vid mätning av ph sågs en sänkning i samtliga bakteriekulturer, i synnerhet inom de första 24 timmarna. Störst procentuell ph-sänkning sågs i bakteriekulturen vid ph 7.2 med tillsats av glukos. Minst procentuell ph-sänkning sågs i bakteriekulturen vid ph 7.2 utan tillsats av glukos. Dessa resultat stämmer i stort sett överens med hypoteserna och tillgänglig faktabas om sackarolytiska bakteriers egenskaper. ph sjönk aldrig under 4.0, möjligtvis eftersom L. paracasei slutat att bilda syror och därmed bibehållit denna nivå. Skälet till att ph-värdet inte sjönk avsevärt efter 24 timmar i någon av bakteriekulturerna kan bero på att alla de sackarolytiska bakterierna initialt bidrog till en radikal ph-sänkning genom sina metaboliter. Vidare har inte alla bakterier förutsättningar att överleva i ett lågt ph, vilket kan ha lett till en mer homogen sammansättning med stor dominans av L. paracasei, som har dokumenterad hög syratolerans. Denna teori stämmer framför allt för bakteriekulturerna vid ph 5.5 och ph 7.2 med tillsats av glukos, där L. paracasei blev mest framträdande i samband med den stora ph-sänkningen. ph sjönk även i kontrollsuspensionerna, men sänkningen kan inte ha varit bakteriellt betingad, då odling på suspensionerna inte visade på kontaminering. Skälet till phförändringen är sannolikt kopplat till temperaturen under inkubationen. Värme ökar molekylära rörelser i en lösning vilket ger färre vätebindningar, varpå vätejoner frigörs och ph sjunker. Bakteriekultur vid ph 5.5 I hypotesen förväntades dominans av S. mutans och L. paracasei. Detta verifierades delvis då L. paracasei dominerade i samtliga försök, vilket bekräftar kunskapen om att de är de mest syratoleranta bakterierna, men det kan även tyda på att stammen som användes var väl anpassad till de förutsättningar som fanns, och bra på att utnyttja det dextran som fanns i Todd Hewitt-lösningen. S. mutans framträdde däremot inte i förväntad utsträckning. En möjlig orsak kan vara att färre S. mutans oavsiktligt tillsatts, i relation till de andra bakterierna. En annan förklaring kan vara att S. mutans eventuellt är beroende av adhesion till en yta för att syratolerans ska utvecklas, och tveksamhet råder kring vilka förutsättningar till adhesion som de har haft i studiens tester. I tester där glasplattor använts finns en adekvat yta för S. mutans adhesion (49). Ytterligare en förklaring till resultaten kan vara att stammen som användes hade sämre syratolerans. Eftersom resterande bakteriearter inte anses ha lika stor syratolerans som S. mutans och L. paracasei förväntades det inte att de skulle överleva efter 24 timmar. Till skillnad från hypotesen fanns små mängder S. oralis, S. gordonii och A. odontolyticus efter 24 timmar. Anledningen till att svagt syratoleranta S. gordonii identifierades efter 24 timmar trots ph-sänkningen kan vara bakteriens förmåga att neutralisera syran lokalt, men även dess antagonistiska effekt mot S. mutans kan ha spelat roll i att öka chanserna för andra mindre syratoleranta arter. F. nucleatum, C. gingivalis, S. intermedius och V. dispar/parvula förekom vid start, men inte över detektionsnivå efter 24 timmar, vilket överensstämmer med hypotesen. En förklaring kan vara att de är mindre syratoleranta än de bakterier som överlevde efter 24 timmar. F. nucleatum fanns troligen initialt tack vare sin förmåga att koaggregera med olika bakterier, vilket möjliggör synergistiska interaktioner. Dessutom behövde de inte konkurrera om proteinerna, då de var de enda proteolytiska bakterierna i bakteriekulturen. Dessa faktorer verkade dock inte vara tillräckliga för att bakterierna skulle klara ph-sänkningen under längre tid. Bakteriekultur vid ph 7.2 I hypotesen förväntades S. oralis, S. intermedius och S. gordonii dominera i bakteriekulturen vid alla tidpunkter, vilket inte kunde bekräftas. Dessa tre bakteriearter fanns i varierande mängd, men generellt kunde ingen tydlig dominans av dem ses förutom i ett av försöken där S. oralis var störst i antal. Orsaken till att S. intermedius och S. gordonii inte förekom i större 23

mängd har inte identifierats. En tydlig dominans av L. paracasei kunde ses efter 24 timmar i övriga försök, och ytterst få kolonier av S. gordonii och S. oralis i förhållande till mängden L. paracasei. S. oralis var dock den enda bakterien som hade en tillväxt efter 24 timmar. Bakteriekulturens ph sjönk som mest de första 24 timmarna, men inte lika mycket som övriga medium vilket stämmer överens med hypotesen. ph-sänkningen och de anaeroba förhållandena förväntades gynna S. mutans och L. paracasei, men inte så pass mycket att de skulle ta över helt med tanke på de begränsade mängderna kolhydrater. Det sågs dock ingen ökning av S. mutans, trots att de förekom vid start. Det kan, som tidigare nämnts, möjligen bero på att just den stammen var mindre anpassad till förutsättningarna. Även närvaron av S. gordonii, som har en antagonistisk effekt mot S. mutans, kan ha begränsat S. mutans tillväxt. Anledningen till att L. paracasei dominerade kan i sin tur återigen bero på att stammen hade god förmåga att klara av förutsättningarna. I övrigt stämde hypotesen om att F. nucleatum och V. parvula/dispar kunde förekomma utan att växa i mängd efter 24 timmar, med motiveringen att V. parvula/dispar kan metabolisera laktat från de sackarolytiska bakteriernas fermentering, men har svårt att utstå vidare ph-sänkning på grund av sin begränsade syratolerans. Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos I hypotesen förväntades att S. mutans och L. paracasei skulle vara dominerande tack vare förmågan att fermentera kolhydrater vid stor glukostillgång, och möjligheten att överleva i sjunkande ph. L. paracasei dominerade i försöken efter 24 timmar, medan S. mutans förekom i varierande mängd vid start och ökade inte efter 24 timmar. I försök A fanns S. mutans i större mängd än L. paracasei vid start. Trots att antalet S. mutans varit stort vid start, har det alltså inte ökat chanserna för överlevnad och tillväxt efter 24 timmar. I försök A kan dominansen av L. paracasei inte förklaras av att de varit fler till en början. Anledningen till att S. mutans och L. paracasei inte utvecklats likartat över tid, skulle även i detta fall kunna förklaras av att S. mutans-stammen ej kunnat adaptera sig till förutsättningarna, att de inte kunnat utveckla syratolerans då adhesion saknades, och/eller närvaron av S. gordonii. Mängden L. paracasei kan ånyo bero på att en välanpassad stam använts. Vidare fanns även S. gordonii, A. odontolyticus, S. intermedius, S. oralis och C. gingivalis i större mängd än S. mutans efter 24 timmar. Med tanke på ph-sänkningen förväntades omvända förhållanden, då S. mutans har en högre syratolerans. Detta kan möjligtvis vara ytterligare ett tecken på att det saknas något för att S. mutans ska trivas optimalt. Som väntat inträffade ingen ökning av F. nucleatum och V. parvula/dispar efter 24 timmar. Däremot återfanns C. gingivalis vid ett enstaka tillfälle efter 24 timmar, vilket kan ha varit en tillfällighet, då den generella trenden visar att C. gingivalis inte överlever efter 24 timmar trots varierande mängd vid start. Det som har kunnat observeras i studien är att samexistens förekom mellan vissa bakteriearter i de olika bakteriekulturerna. I bakteriekulturer vid lågt ph samexisterade L. paracasei och S. gordonii, S. oralis eller A. odontolyticus. I bakteriekulturer vid begränsad glukostillgång förekom samexistens mellan L. paracasei och S. gordonii eller S. oralis. I bakteriekulturer vid stor glukostillgång förekom även samexistens mellan L. paracasei och S. gordonii, S. oralis, S. intermedius, A. odontolyticus eller C. gingivalis. Sammanfattningsvis samexisterade L. paracasei och S. gordonii eller S. oralis oavsett bakteriekultur. Eventuellt förekommer ett synergistiskt samspel där streptokockerna sänker ph i närmiljön till lactobacillernas fördel. L. paracasei hade förmåga att överleva eller växa i alla medium, trots varierande mängd vid start. Detta eventuellt kan bero på att den stam som användes. I försök B skulle det också kunna förklaras av att fler bakterier tillsatts. Vid ytterligare studier av denna sort kan det varit klokt att byta ut denna stam för att kunna studera övriga bakterier bättre. S. mutans hade i 24

försöken inte den slagkraft som förväntats. Anledningarna till detta kan vara att L. paracasei konkurrerade ut S. mutans, att S. mutans inte fick de förutsättningar som behövs i form av adhesion till adekvat yta, antagonistisk effekt från S. gordonii eller att en mindre anpassningsbar stam användes till försöken. Initialt misstänktes det att ett fel hade uppstått vid loopning, men då S. mutans förekom i varierande mängder vid start utan att senare öka, har loopingmängd inte påverkat avsevärt mycket. Anledningen till övriga bakteriers närvaro och frånvaro kan bero på synergistiska och antagonistiska effekter inom bakteriekulturen. Begränsningar En faktor som kan påverka reproducerbarheten är looping-mängden vid inokulering. Denna metod innebär att en likvärdig mängd bakterier på ett ungefär kan mätas upp, men i och med skillnader i bakteriestorlek och ögonmått kan den exakta mängden inte kontrolleras. Om mängden bakterier blir för stor eller för liten kan det ändra sammansättningen vid start, vilket i sin tur skulle kunna påverka resultaten. Vid analys av reella antalet bakterier i studien var dock skillnaden försumbar. Spädningen spelar roll för resultatet. Användning av en högre spädning kan göra det svårt att hitta bakterierna, medan en för låg spädning ibland gör det svårt att kvantifiera bakterierna. I försök A användes spädningsfaktor och 10 6, och i försök B 10 3, 10 4 och. Anledningen till dessa skillnader var att fel spann användes i försök A, något som kan ha gjort att mängden bakterier vid odling blivit otillräckliga för identifiering. De anaeroba arterna F. nucleatum och V. parvula/dispar var relativt frånvarande i resultaten, något som möjligtvis kan förklaras av att brunnarna inte inkuberades i en syrefattig miljö. Vid inkubation under mer anaeroba förhållanden hade kanske fördelningen av bakterier blivit annorlunda. Artbestämningen kan ha drabbats av observatörsvariationer, och eventuella felräkningar kan ha gjorts. I och med att vissa kolonier växte ihop eller var för små för att identifieras uteslöts de från resultaten. I ett fåtal fall tilläts de fortsätta växa i inkubation tills artbestämning var möjlig. Detektionsgräns var > 5 x 10 3 cfu/ml, vilket betyder att provet fortfarande kan innehålla bakterier, men att de inte kan detekteras för att de är för få för analysmetoden. Med facit i hand hade det varit intressant att studera resultaten flera gånger inom de första 24 timmarna, eftersom det var inom detta tidsintervall som störst ph-sänkning skedde. Möjligtvis hade trenderna i bakterieskiftningen då kunnat studeras mer noggrant. Detta hade dock gjort hela studien svårare att utföra. Eftersom försöken utförts in vitro kan det ifrågasättas hur väl de representerar eventuella händelseförlopp in vivo. Användningen av Todd Hewitt och selektivt utvalda bakterier motsvarar inte orala förhållanden helt verklighetstroget. Viabiliteten hos biofilmen är inte heller enbart beroende på interaktioner mellan organismerna, utan också på interaktioner med värden. Till exempel finns antimikrobiella ämnen i saliven som påverkar bakterier. Vissa ämnen från orala vätskor kan även inkorporeras i pellikeln och verka som receptorer för bakterier, vilket vidare påverkar kolonisering och förökning av dem. Stundtals har det varit svårt att hitta relevanta fakta om inkluderade bakterier i tillgänglig litteratur. Detta har gjort att resultaten och bakteriernas beteende inte kunnat förklaras till fullo. Dessutom har omfattningen av studien inneburit en del svårigheter. I efterhand har vi kommit till insikten att det inkluderats för många bakterier i konsortiumet, något som 25

komplicerat dels utförandet och dels tolkandet av resultat. Detta har gjort det svårt att dra slutsatser kring kommunikation i det mikrobiologiska samhället. Signifikans Trots begränsningar och brister har vi genom studien förstått att interaktioner mellan olika bakterier kan ge upphov till egenskaper som inte kan ses individuellt. Det är således viktigt att studera bakterier i samverkan som komplement till studier på renkulturer, för att spegla de interaktioner som kan ske i verkligheten. Vi har i denna studie sett att vissa bakterier förekommer i samexistens med andra. Kan vi med hjälp av denna kunskap förutspå exempelvis kariesutveckling? Är det möjligt att ta bakterieprover på patienter för att bedöma risken för patologi? Denna studie utökar faktabasen genom större förståelse för hur utvalda bakterier samverkar i miljöer med olika ph och glukosmängd. På längre sikt ger detta ökad kunskap om successionen kan manipuleras till en placksammansättning som förknippas med oral hälsa. Detta skulle kunna bidra till mer evidensbaserad vård, minska lidande för patienter samt minska kostnader för både samhället och individen. Konklusion L. paracasei hade störst förmåga att överleva i alla bakteriekulturer oavsett miljöförändring, och visade även på högst syratolerans. Det förekom en samexistens mellan L. paracasei och S. gordonii eller S. oralis oavsett bakteriekultur. Övriga bakterier klarade sig inte lika bra, däribland S. mutans som inte överlevde i detta konsortium i den utsträckning som förväntats. Den procentuella ph-sänkningen var störst i bakteriekulturen med initialt ph 7.2 och tillsats av glukos, och minst i bakteriekulturen med initialt ph 7.2 utan tillsats av glukos. Vidare studier av flerartiga bakteriekulturer krävs för att få kunskap om hur bakteriell succession kan manipuleras. 26

Referenser 1. Theilade E. The non-specific theory in microbial etiology of inflammatory periodontal diseases. J Clin Periodontol. 1986; 13: 905-911. 2. Marsh PD. Are dental diseases examples of ecological catastrophes? Microbiology. 2003; 149: 279-294. 3. Marsh PD. Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease. Adv Dent Res. 1994; 8: 263-271. 4. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology. : Edinburgh : Churchill Livingstone Elsevier, 2009; 5. ed; 2009. 5. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology Chapter 5 - Dental plaque. 2009: 74-102. 6. Kolenbrander PE, Andersen RN, Moore LV. Intrageneric coaggregation among strains of human oral bacteria: potential role in primary colonization of the tooth surface. Appl Environ Microbiol. 1990; 56: 3890-3894. 7. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology Chapter 2 - The mouth as a microbial habitat. 2009: 8-23. 8. Corcoran BM, Stanton C, Fitzgerald GF, Ross RP. Survival of probiotic lactobacilli in acidic environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars. Appl Environ Microbiol. 2005; 71: 3060-3067. 9. Bradshaw DJ, Marsh PD. Analysis of ph-driven disruption of oral microbial communities in vitro. Caries Res. 1998; 32: 456-462. 10. McKee AS, McDermid AS, Ellwood DC, Marsh PD. The establishment of reproducible, complex communities of oral bacteria in the chemostat using defined inocula. J Appl Bacteriol. 1985; 59: 263-275. 11. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology Chapter 3 - The resident oral microflora. 2009: 24-44. 12. Kreth J, Merritt J, Qi F. Bacterial and Host Interactions of Oral Streptococci. DNA Cell Biol. 2009; 28: 397-403. 13. Dahlén G, Fiehn N, Olsen I. Oral microbiology and immunology : The Scandinavian approach. 2012: s 185. 14. Kuramitsu HK, He X, Lux R, Anderson MH, Shi W. Interspecies Interactions within Oral Microbial Communities. Microbiol Mol Biol Rev. 2007; 71: 653-670. 15. Whiley RA, Freemantle L, Beighton D, Radford JR, Hardie JM, Tillotsen G. Isolation, Identification and Prevalence of Streptococcus anginosus, S. intermedius and S. constellatus from the Human Mouth. Microb Ecol Health Dis. 1993; 6: 285-291. 16. Wells CL WT. Anaerobic Cocci. 1996; In: Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th edition. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston: Chapter 19. 27

17. Ahmed NA, Petersen FC, Scheie AA. Biofilm formation and autoinducer-2 signaling in Streptococcus intermedius: role of thermal and ph factors. Oral Microbiol Immunol. 2008; 23: 492-497. 18. Mishra AK, Fournier PE. The role of Streptococcus intermedius in brain abscess. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2013; 32: 477-483. 19. Whiley RA, Beighton D. Current classification of the oral streptococci. Oral Microbiol Immunol. 1998; 13: 195-216. 20. Liu Y, Burne RA. Multiple two-component systems modulate alkali generation in Streptococcus gordonii in response to environmental stresses. J Bacteriol. 2009; 191: 7353-7362. 21. Sánchez E, Sanz Y. Lactobacillus. Molecular Detection of Human Bacterial Pathogens. 2011: 257-267. 22. Loesche W. Microbiology of Dental Decay and Periodontal Disease. 1996; In: Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th edition. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston: Chapter 99. 23. Paul D, Reddy D, Mukherjee D, Paul B, Paul D. Actinomyces. Molecular Detection of Human Bacterial Pathogens. 2011: 23-30. 24. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology Chapter 4 - Acquisition, adherence, distribution and metabolism of the oral microflora. 2009: 45-74. 25. Vielkind P, Jentsch H, Eschrich K, Rodloff AC, Stingu CS. Prevalence of Actinomyces spp. in patients with chronic periodontitis. Int J Med Microbiol. 2015; 305: 682-688. 26. Hughes CV, Kolenbrander PE, Andersen RN, Moore LV. Coaggregation properties of human oral Veillonella spp.: relationship to colonization site and oral ecology. Appl Environ Microbiol. 1988; 54: 1957-1963. 27. Liu D. Veillonella. Molecular Detection of Human Bacterial Pathogens. 2011: 447-452. 28. Delwiche EA, Pestka JJ, Tortorello ML. The veillonellae: gram-negative cocci with a unique physiology. Annu Rev Microbiol. 1985; 39: 175-193. 29. Winn, Washington C., Koneman, Elmer W.,$d 1932-,. Koneman's color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Chapter 9. 2006: 474-475. 30. Zbinden R, von Graevenitz A. Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, Pasteurella, and Other Fastidious or Rarely Encountered Gram-Negative Rods*. 2011. 31. Leadbetter ER. The Genus Capnocytophaga. 2006: 709-711. 32. Leadbetter ER, Holt SC, Socransky SS. Capnocytophaga: new genus of gram-negative gliding bacteria. I. General characteristics, taxonomic considerations and significance. Arch Microbiol. 1979; 122: 9-16. 33. Robrish SA, Oliver C, Thompson J. Sugar metabolism by fusobacteria: regulation of transport, phosphorylation, and polymer formation by Fusobacterium mortiferum ATCC 25557. Infect Immun. 1991; 59: 4547-4554. 28

34. Robrish SA, Thompson J. Regulation of fructose metabolism and polymer synthesis by Fusobacterium nucleatum ATCC 10953. J Bacteriol. 1990; 172: 5714-5723. 35. Rogers AH, Zilm PS, Gully NJ, Pfennig AL, Marsh PD. Aspects of the growth and metabolism of Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 in continuous culture. Oral Microbiol Immunol. 1991; 6: 250-255. 36. Kolenbrander PE, London J. Ecological Significance of Coaggregation among Oral Bacteria. 1992: 183-217. 37. Bartold PM, Gully NJ, Zilm PS, Rogers AH. Identification of components in Fusobacterium nucleatum chemostat-culture supernatants that are potent inhibitors of human gingival fibroblast proliferation. J Periodontal Res. 1991; 26: 314-322. 38. Claesson R, Edlund MB, Persson S, Carlsson J. Production of volatile sulfur compounds by various Fusobacterium species. Oral Microbiol Immunol. 1990; 5: 137-142. 39. Persson S, Edlund MB, Claesson R, Carlsson J. The formation of hydrogen sulfide and methyl mercaptan by oral bacteria. Oral Microbiol Immunol. 1990; 5: 195-201. 40. Singer RE, Buckner BA. Butyrate and propionate: important components of toxic dental plaque extracts. Infect Immun. 1981; 32: 458-463. 41. Brook I, Walker RI. The relationship between Fusobacterium species and other flora in mixed infection. J Med Microbiol. 1986; 21: 93-100. 42. Bolstad AI, Jensen HB, Bakken V. Taxonomy, biology, and periodontal aspects of Fusobacterium nucleatum. Clin Microbiol Rev. 1996; 9: 55-71. 43. Rogers AH, Gully NJ, Pfennig AL, Zilm PS. The breakdown and utilization of peptides by strains of Fusobacterium nucleatum. Oral Microbiol Immunol. 1992; 7: 299-303. 44. Ng SK, Hamilton IR. Lactate metabolism by Veillonella parvula. J Bacteriol. 1971; 105: 999-1005. 45. Fejerskov Oe, Kidd EAMe. Dental caries : the disease and its clinical management. 2008: p 197. 46. Kalfas S, Edwardsson S. Identification procedures for oral Actinomyces species. Oral Microbiol Immunol. 1990; 5: 39-42. 47. MacFaddin JF. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. : Baltimore (Md.) : Williams and Wilkins; 1985. 48. ROGOSA M, MITCHELL JA, WISEMAN RF. A selective medium for the isolation and enumeration of oral lactobacilli. J Dent Res. 1951; 30: 682-689. 49. Welin-Neilands J, Svensater G. Acid tolerance of biofilm cells of Streptococcus mutans. Appl Environ Microbiol. 2007; 73: 5633-5638. 29

Bilaga 1 Bakteriell sammansättning Försök A:1 Bakteriekultur vid ph 5.5 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 9 15 4 3 nd nd S. mutans nd nd nd nd nd nd S. gordonii 4 7 nd nd 9 20 S. intermedius nd nd nd nd nd nd S. oralis 3 5 39 31 nd nd L. paracasei 9 15 82 66 36 80 C. gingivalis 30 50 nd nd nd nd V. dispar/parvula nd nd nd nd nd nd F. nucleatum 8 14 nd nd nd nd Antal cfu på agar 59 125 45 Spädningsfaktor Antal bakterier (cfu/ml) 2,95 x 10 7 6,25 x 10 7 2,25 x 10 7 nd not detected (< 5 x cfu/ml) Försök A:2 Bakteriekultur vid ph 5.5 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 5 16 nd nd nd nd S. mutans nd nd nd nd nd nd S. gordonii nd nd 2 4 8 13 S. intermedius 1 3 nd nd nd nd S. oralis 1 3 3 6 nd nd L. paracasei 6 19 46 90 53 87 C. gingivalis 8 26 nd nd nd nd V. dispar/parvula 1 3 nd nd nd nd F. nucleatum 8 29 nd nd nd nd Antal cfu på agar 31 51 61 Spädningsfaktor Antal bakterier (cfu/ml) 1,55 x 10 7 2,55 x 10 7 3,05 x 10 7 nd not detected (< 5 x cfu/ml) 30

Försök B:1 Bakteriekultur vid ph 5.5 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 2 1 nd nd nd nd S. mutans 3 2 nd nd nd nd S. gordonii 9 5 nd nd nd nd S. intermedius nd nd nd nd nd nd S. oralis nd nd nd nd nd nd L. paracasei 153 87 62 100 158 100 C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula 8 5 nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 175 62 158 Spädningsfaktor 10 3 Antal bakterier (cfu/ml) 8,75 x 10 7 3,10 x 10 7 7,90 x nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) Försök B:2 Bakteriekultur vid ph 5.5 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 2 2 nd nd nd nd S. mutans 2 2 nd nd nd nd S. gordonii 12 11 nd nd nd nd S. intermedius nd nd nd nd nd nd S. oralis nd nd nd nd nd nd L. paracasei 91 82 160 100 188 100 C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula 3 3 nd nd nd nd F. nucleatum 1 1 nd nd nd nd Antal cfu på agar 111 160 188 Spädningsfaktor 10 3 Antal bakterier (cfu/ml) 5.55 x 10 7 8,00 x 10 7 9,40 x nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) Försök B:3 Bakteriekultur vid ph 5.5 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 2 1 1 <1 nd nd S. mutans 3 2 nd nd nd nd S. gordonii 5 4 nd nd nd nd S. intermedius 1 1 nd nd nd nd S. oralis nd nd nd nd nd nd L. paracasei 129 92 188 99 141 100 C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula nd nd nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 140 189 141 Spädningsfaktor 10 3 Antal bakterier (cfu/ml) 7,00 x 10 7 9,45 x 10 7 7,05 x nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) 31

Försök A:1 Bakteriekultur vid ph 7.2 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus nd nd nd nd nd nd S. mutans 70 60 nd nd nd nd S. gordonii 6 5 nd nd nd nd S. intermedius 12 10 nd nd nd nd S. oralis nd nd 110 82 nd nd L. paracasei 5 4 24 18 nd nd C. gingivalis 21 18 nd nd nd nd V. dispar/parvula 3 3 nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 117 134 0 Spädningsfaktor 10 4 Antal bakterier (cfu/ml) 5,85 x 10 7 6,70 x 10 7 < 5 x 10 4 nd not detected (< 5 x 10 4 cfu/ml) Försök A:2 Bakteriekultur vid ph 7.2 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus nd nd nd nd nd nd S. mutans nd nd nd nd nd nd S. gordonii 3 10 nd nd nd nd S. intermedius 2 7 nd nd nd nd S. oralis 5 17 nd nd nd nd L. paracasei 5 17 nd nd nd nd C. gingivalis 3 10 nd nd nd nd V. dispar/parvula 2 7 nd nd nd nd F. nucleatum 9 31 nd nd nd nd Antal cfu på agar 29 0 0 Spädningsfaktor 10 4 10 4 Antal bakterier (cfu/ml) 1,45 x 10 7 <5 x 10 4 <5 x 10 4 nd not detected (< 5 x 10 4 cfu/ml) 32

Försök B:1 Bakteriekultur vid ph 7.2 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 2 1 nd nd nd nd S. mutans 1 1 nd nd nd nd S. gordonii 11 8 nd nd nd nd S. intermedius nd nd nd nd nd nd S. oralis nd nd 5 2 nd nd L. paracasei 101 74 308 98 nd nd C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula 4 3 nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 137 313 0 Spädningsfaktor 10 4 10 3 Antal bakterier (cfu/ml) 6,85 x 10 7 15,65 x 10 6 <5 x 10 3 nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) Försök B:2 Bakteriekultur vid ph 7.2 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 1 1 nd nd nd nd S. mutans nd nd nd nd nd nd S. gordonii 19 15 4 2 nd nd S. intermedius 1 1 nd nd nd nd S. oralis nd nd nd nd nd nd L. paracasei 100 80 220 98 nd nd C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula 3 2 nd nd nd nd F. nucleatum 1 1 nd nd nd nd Antal cfu på agar 125 224 0 Spädningsfaktor 10 4 10 3 Antal bakterier (cfu/ml) 6,25 x 10 7 11,20 x 10 6 <5 x 10 3 nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) Försök B:3 Bakteriekultur vid ph 7.2 Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 3 2 nd nd nd nd S. mutans 2 1 nd nd nd nd S. gordonii 1 1 nd nd nd nd S. intermedius 1 1 nd nd nd nd S. oralis nd nd 12 1 nd nd L. paracasei 139 95 622 99 nd nd C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula nd nd nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 146 634 0 Spädningsfaktor 10 4 10 3 Antal bakterier (cfu/ml) 7,30 x 10 7 31,7 x 10 6 <5 x 10 3 nd- not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) 33

Försök A:1 Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 7 8 nd nd nd nd S. mutans 32 38 nd nd nd nd S. gordonii 8 9 10 26 9 24 S. intermedius 4 5 nd nd nd nd S. oralis 5 6 4 11 nd nd L. paracasei 4 5 24 63 29 76 C. gingivalis 15 18 nd nd nd nd V. dispar/parvula 10 12 nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 85 38 38 Spädningsfaktor 10 3 Antal bakterier (cfu/ml) 4,25 x 10 7 1,90 x 10 7 1,90 x 10 7 nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) Försök A:2 Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 1 2 nd nd nd nd S. mutans nd nd nd nd nd nd S. gordonii 4 9 13 33 13 42 S. intermedius 3 7 3 8 nd nd S. oralis 2 5 nd nd nd nd L. paracasei 8 18 23 59 17 55 C. gingivalis 10 23 nd nd 1 3 V. dispar/parvula 1 2 nd nd nd nd F. nucleatum 15 34 nd nd nd nd Antal cfu på agar 44 39 31 Spädningsfaktor Antal bakterier (cfu/ml) 2,20 x 10 7 1,95 x 10 7 1,55 x 10 7 nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) 34

Försök B:1 Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 4 3 6 2 nd nd S. mutans 3 2 nd nd nd nd S. gordonii 8 6 nd nd nd nd S. intermedius nd nd nd nd nd nd S. oralis nd nd nd nd nd nd L. paracasei 122 85 281 98 84 100 C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula 7 5 nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 144 287 84 Spädningsfaktor Antal bakterier (cfu/ml) 7.20 x 10 7 1,44 x 10 9 4,20 x 10 7 nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) Försök B:2 Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 1 1 nd nd nd nd S. mutans 1 1 nd nd nd nd S. gordonii 15 11 19 33 nd nd S. intermedius nd nd nd nd nd nd S. oralis nd nd 7 12 nd nd L. paracasei 120 88 32 55 21 100 C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula nd nd nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 137 58 21 Spädningsfaktor 10 4 10 3 Antal bakterier (cfu/ml) 6,85 x 10 7 2,90 x 10 7 1,05 x nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) Försök B:3 Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos Arter Antal % Antal % Antal % A. odontolyticus 2 2 nd nd 1 3 S. mutans nd nd nd nd nd nd S. gordonii 12 9 10 15 nd nd S. intermedius 3 2 nd nd nd nd S. oralis nd nd nd nd nd nd L. paracasei 112 87 55 85 30 97 C. gingivalis nd nd nd nd nd nd V. dispar/parvula nd nd nd nd nd nd F. nucleatum nd nd nd nd nd nd Antal cfu på agar 129 65 31 Spädningsfaktor 10 4 Antal bakterier (cfu/ml) 6,45 x 10 6 3,25 x 10 7 1,55 x 10 7 nd not detected (< 5 x 10 3 cfu/ml) 35

Bilaga 2 Odling av bakteriekulturer Försök A:1 och A:2 Bakteriekultur vid ph 5.5 I II Figur 20. Blodagar som visar tillväxt efter 0, 24 respektive 48 timmar. Spädningsfaktor står under varje bild. 36

Försök B:1, B:2 och B:3 Bakteriekultur vid ph 5.5 I 10 3 II 10 3 III 10 3 Figur 21. Blodagar som visar tillväxt efter 0, 24 respektive 48 timmar. Spädningsfaktor står under varje bild. 37

Försök A:1 och A:2 Bakteriekultur vid ph 7.2 I II Figur 12. Efter 24 timmar syntes inga cfu på försök II. Efter 48 timmar syntes inga cfu på något försök. Spädningsfaktor står under varje bild 38

Försök B:1, B:2 och B:3 Bakteriekultur vid ph 7.2 I 10 3 II 10 3 III Figur 23. Blodagar som visar tillväxt efter 0, 24 respektive 48 timmar. Efter 48 timmar syntes inga cfu på något försök. Spädningsfaktor står under varje bild. 10 3 39

Försök A:1 och A:2 Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos I II Figur 24. Blodagar som visar tillväxt efter 0, 24 respektive 48 timmar. Spädningsfaktor står under varje bild. 40

Försök B:1, B:2 och B:3 Bakteriekultur vid ph 7.2 med tillsats av glukos I II 10 4 10 3 III 10 4 Figur 25. Blodagar som visar tillväxt efter 0, 24 respektive 48 timmar. Spädningsfaktor står under varje bild. 41