Slutrapport för anslag från AFA Bertil Rydenhag, professor i neurokirurgi, Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Göteborg

Transkript

1 1 Slutrapport för anslag från AFA Bertil Rydenhag, professor i neurokirurgi, Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Göteborg Tidsplan Medlen beviljades våren 2011, blev disponibla hösten Ursprungligen var tidsplanen 2011 tom 2013, men den prospektiva inklusionen kunde starta först pga fördröjning med kompletterande etiktillstånd. Detta var ett avgörande skäl för mig att fråga om förlängning av dispositionstiden, vilket beviljades tom Förkortning Glioblastoma multiforme (Astrocytom grad IV) anges med GBM. Tillskott i forskningsgruppen Bredden avseende kompetensen i forskargruppen har väsentligt utökats sedan ansökan 2011 med tillskott av professor Rolf Heckemann professor i imaging vid Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Helena Carén, forskarassistent med egen grupp på cancercentrum vid Sahlgrenska Akademin, professor Anja Smits, neurologin i Uppsala, samt samarbete med professor Omar Skalli, Dep of Biological Sciences, University of Memphis. Under innevarande år har Asgeir Jakola knutits till gruppen. Han har precis tillträtt tjänst inom neurokirurgin och har nu blivit 20% adjungerad lektor vid Sahlgrenska Akademin. Dr Jakola har från Norge ett välmeriterat arbete bakom sig avseende gliom, både avseende kirurgisk behandling och basalvetenskaplig forskning. Vetenskaplig rapport Skalli O, Wilhelmsson U, Orndahl C, Fekete B, Malmgren K, Rydenhag B, Pekny M. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Human pathology 2013;44: Danielsson A, Tisell M, Rydenhag B, Carén H. Characterizing the radioresponse of pediatric brain tumor stem cells cultured in vitro. RO-023. Neuro Onco 2014;16:i117-i122. Mollerstrom E, Rydenhag B, Andersson D, Lebkuechner I, Puschmann TB, Chen M, Wilhelmsson U, Stahlberg A, Malmgren K, Pekny M. Classification of subpopulations of cells within human primary brain tumors by single cell gene expression profiling. Neurochemical research 2015;40: Chen M, Puschmann TB, Wilhelmsson U, Malmgren K, Rydenhag B, Pekny M. Epileptic tissue in the human brain cortex contains cells with neural stem/progenitor cell properties. Submitted Fekete B, Werlenius K, Örndal C, Rydenhag B. Prognostic factors for patients operated for glioblastoma at at Sahlgrenska University Hospital - a retroospective population based study. Submitted 2015.

2 2 Danielsson A, Tuzesi A, Tisell M, Rydenhag B, Carén H. Growth characteristics, selfrenewal and differentiation of primary glioma tumor cells following radiation. Manuscript Rydenhag B, Fekete B, Malmgren K, Örndal C, Pekny M. Navigation at neurosurgery as a tool for defining exact location of research specimens at brain surgery. Manuscript Resultat från förstudien, kliniska data Som grund för den prospektiva studien gjordes en retrospektiv populationsbaserad studie på patienter opererade för GBM På Sahlgrenska Universitetssjukhuset Medianåldern var 59,8 år vid operationen och medianöverlevnaden var 0,73 år, se figur 1. De viktigaste faktorerna som påverkade överlevnaden var ålder vid insjuknandet, tumörens lokalisation, neurologiska deficit preoperativt, hur mycket tumör som kunde tas bort, efterföljande radio- och kemoterapi. Resultaten från denna studie är nu inskickat för publicering 1. Figur 1. Överlevnad efter operation av GBM. Hittills uppnådda basalvetenskapliga resultat Patienter med kort respektive lång överlevnad efter operation för GBM från identifierades 1 och vi analyserade de kliniska variablerna och uttrycket av intermediär filament markörer. Vi identifierade två undergrupper; de som levde mindre än 8 månader och de som levde mer än 18 månader. Kirurgin värderades som biopsi, subtotal eller radikal. Tumörvolymen bestämdes, information om onkologisk behandling och överlevnad. Den starkaste faktorn för överlevnad var optimal kirurgi (p<0.0008) och strålning (p<0.0008). Tumörpreparaten genomgick immunofärgning för intermediär filament proteinerna synemin, nestin, GFAP och vimentin. Baserat på dessa resultat föreslog vi en subklassificering av grad IV astrocytom med hänsyn till uttrycket av dessa proteiner; grad IV astrocytom typ A, B och C 2. Resultaten pekade på att dessa intermediär filament proteiner samregleras och att uttrycket av dem kan ha en

3 3 biologisk och klinisk betydelse vilket skall studeras i den prospektiva studien. Vi ville också studera subpopulationer av tumörceller med hjälp av ett protokoll för att erhålla enskilda viabla celler från färskfrusen isolerad tumör från människa. För jämförelse så utvärderades en cellpopulation från GBM, och från ett oligodendrogliom grad III, såväl som från penumbrazonen. Vi utvärderade uttrycket av 36 gener med reverse transcription quantitative PCR. Vi kunde identifiera subpopulationer av tumörceller via denna single-cells teknik 3, vilket kan vara en viktig metod i framtiden. Då våra studier visat på viktiga resultat och vi ansåg oss behöva ett modellsystem att utvärdera faktorerna i etablerades cellkulturer från patientmaterialet i Helena Caréns lab. Genom att odla cellerna under stamcellsförhållanden isoleras och bibehålles de celler som anses ge upphov till tumörer, reistensutveckling och tumöråterkomst efter behandling. Totalt har ett tjugotal sådana här kulturer etablerats och dessa patient-deriverade kulturer kommer att i fortsättningsvis under projektet att etableras för att möjliggöra funktionella studier av en specifik patients tumörceller. Då strålning identifierades som en stark faktor för överlevnad har vi börjat att studera de biologiska effekterna av strålning med avsikt att kunna identifiera faktorer för ytterligare förbättrad effekt från strålningbehandling. I samarbete med Helena Caréns forskargrupp har därför strålningsrespons studerats i de patient-deriverade cell kulturerna (Figur 2). Fig 2. Strålningsrespons. Obestrålade celler (vänster), bestrålade celler (höger). Bestrålade celler uppreglerar specifika proteiner och reducerar proliferationshastigheten. Dock svarar inte alla celler på samma sätt i de bestrålade cellerna finns fortfarande snabbt prolifererande celler (gröna).

4 4 Pågående arbete Den prospektiva inklusionen av patienter opererade för GBM startade Dessutom registreras och följs alla patienter som har ett sannolikt GBM utifrån värderingen på MR, men där patientens tillstånd har gjort att operation ej är ett alternativ. Från de opererade patienterna har tumörpreparat tagits. Vi har också använt neuronavigation för säker kartläggning av var forskningspreparat är tagna 4. För närvarande är 170 patienter inkluderade. Analysen av pre-och postoperativt radiologiskt utseende kommer i det nu pågående arbetet att få en ökad precision genom samarbetet med professor Rolf Heckemann avseende implementering av automatiserad radiologisk analys 5, 6. Samarbetet med Rolf Heckemann är avgörande för att på det stora patentmaterialet med god reliabilitet göra värderingen av radikalitet eller ej. Dessutom har inom ramen för studien samarbete upprättats med professor Anja Smits, neurologin i Uppsala, avseende ytterligare studier av intermediär filament proteiner på ett befintligt stort tumörmaterial i Uppsala. Samarbetet med Anja Smits ger en möjlighet att få en tillgång till ett större, retrospektivt, material för att öka säkerheten i bedömningen av uttrycket av olika intermediärfilament hos astrocyterna vid gliomsjukdom. Anja Smits har ett långvarigt forskningsarbete avseende såväl låggradiga som höggradiga gliom 7. Statistikkonsult Aldina Pivodic, Statistiska konsultgruppen i gör de statistiska analyserna. För grupptester kommer Fisher s exakta test att användas för dikotoma variabler, Mantel-Haenszel Chi-2 för ordnade kategoriska variabler och Mann-Whitney U-test för kontiuerliga variabler. Uni- och multivariat analys kommer att användas. På basen av tidigare studie har antalet patienter kalkylerats till för att med 80% power beräkna en 31% minskning av dödligheten för radikal mot icke radikal kirurgi. För studien behöver då 320 patienter inkluderas. Eftersom vi nu har 170 inkluderade, kommer detta mål att nås inom de 2 återstående åren av inklusion. Rapporter under de kommande två åren avseende kliniska variabler. Då återstående material är insamlat kommer överlevnadstid att beräknas i relation till läge av tumör, ålder, radikalitet i denna prospektiva populationsbaserade kohort. Förväntat är att överlevnaden bör ha ökat i gruppen jämfört med materialet Detta då den onkologiska behandlingen har strukturerats upp väsentligt de sista 10 åren. Ytterligare analys kommer att ske av den grupp som bedöms ha glioblastom på MR men där man ej har rekommenderat operation pga utbredd tumör eller dåligt allmäntillstånd hos patienten. Redan i materialet är åldern hos patienter som blir avböjda ca 10 år äldre vid diagnos än den opererade gruppen, och därav var de sannolikt i ett sämre allmäntillstånd än den yngre opererade gruppen, figur 3. Ytterligare analys kommer att ske med hänsyn taget till läget av tumören även för de avböjda, denna analys har ej kunnat göras i det retrospektiva materialet

5 5 Figur 3. Ålder vid diagnos för dels gruppen opererade patienter, dels för gruppen avböjda patienter med sannolikt GBM. Basalvetenskapligt, translationellt fortsatt arbete Fortsatt analys kommer att ske i samarbetet med prof Milos Pekny avseende det prospektivt insamlade materialet, avseende intermediärfilamentens möjliga roll som prognostisk faktor. Den vanligaste kemoterapin som används vid GBM är temozolamid. Verkningseffekten av detta läkemedel är dock beroende på om MGMT genen är aktiv eller inaktiv vilket bestäms av dess metyleringsstatus. Helena Carén att analysera MGMT status hos patienternas tumörer för att kunna inkludera denna variabel i de statistiska beräkningarna 8, Figur 4.

6 6 Fig 4. MGMT metyleringsstatus där patienter med metylerad MGMT gen (röda staplar) har en bättre effekt av temozolamid och däred kan förväntas ha längre överlevnad. I Helena Caréns lab kommer vi vidare att fortsätta med de funktionella studierna i de patientderiverade cellkulturerna. Strålning och i kombination med kemoterapi och ny riktad behandling kommer att studeras. Specifikt är vi intresserade av hur vi ska kunna slå mot de celler i tumören som inte tar skada av dagens behandling (t ex de gröna cellerna i Fig 2). Även djurmodeller håller på att sättas upp som kommer att ytterligare förfina analyserna att patienternas tumörceller och hur de kan slås mot terapeutiskt (etikansökan godkänd mars 2015). Kortfattat specifikt vad anslaget från AFA har betytt. - De vetenskapliga resultaten är presenterade ovan, - Byggandet av en unik prospektiv populationsbaserad databas över patienter opererade för glioblastom i Västra Götalandsregionen f o m november Bildandet av en translationell forskargrupp med specifikt intresse för behandlingsmöjligheter av glioblastoma multiforme, (se detaljer ovan). I forskargruppen finns en registrerad doktorand. - Ett ökat intresse från närstående klinikers kollegor avseende forskning inom glioblastom Kortfattat specifikt vad anslaget från AFA kan ge i form av publikationer inom en nära framtid - Detaljerad kunskap hos patienter prospektivt populationsbaserat inkluderade november 2012 tom 2015 avseende prognostiska faktorer för överlevnad efter operativ och okologisk behandling för GBM - Ytterligare basalvetenskaplig kunskap av egenskaper avseende de analyserade tumörproverna ställda i relation till kliniska variabler. - Detaljerad kunskap avseende karakteristika hos de patienter som avböjs från kirurgisk behandling av sitt GBM - Detaljerad kunskap avseende karakteristika hos de patienter som har en mycket kort överlevnad trots operativ behandling av GBM - På längre sikt förväntas resultaten kunna leda till förändringar i handläggning och vårdprogram för patienter med GBM

7 7 Referenser 1. Fekete B, Werlenius K, Örndal C, Rydenhag B. Prognostic factors for patients operated for glioblastoma at at Sahlgrenska University Hospital - a retroospective population based study. Manuskript Skalli O, Wilhelmsson U, Orndahl C, Fekete B, Malmgren K, Rydenhag B, Pekny M. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Human pathology 2013;44: Mollerstrom E, Rydenhag B, Andersson D, Lebkuechner I, Puschmann TB, Chen M, Wilhelmsson U, Stahlberg A, Malmgren K, Pekny M. Classification of subpopulations of cells within human primary brain tumors by single cell gene expression profiling. Neurochemical research 2015;40: Rydenhag B, Fekete B, Malmgren K, Örndal C, Pekny M. Navigation at neurosurgery as a tool for defining exact location of research specimens at brain surgery. Manuscript Heckemann RA, Keihaninejad S, Aljabar P, Gray KR, Nielsen C, Rueckert D, Hajnal JV, Hammers A, Alzheimer's Disease Neuroimaging I. Automatic morphometry in Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. NeuroImage 2011;56: Heckemann RA, Keihaninejad S, Aljabar P, Rueckert D, Hajnal JV, Hammers A, Alzheimer's Disease Neuroimaging I. Improving intersubject image registration using tissue-class information benefits robustness and accuracy of multi-atlas based anatomical segmentation. NeuroImage 2010;51: Elsir T, Edqvist PH, Carlson J, Ribom D, Bergqvist M, Ekman S, Popova SN, Alafuzoff I, Ponten F, Nister M, Smits A. A study of embryonic stem cell-related proteins in human astrocytomas: identification of Nanog as a predictor of survival. International journal of cancer Journal international du cancer 2014;134: Wick W, Weller M, van den Bent M, Sanson M, Weiler M, von Deimling A, Plass C, Hegi M, Platten M, Reifenberger G. MGMT testing--the challenges for biomarker-based glioma treatment. Nature reviews Neurology 2014;10: