P R O D U K T I N L A G A

Transkript

1 Immucor Transplant Diagnostics, Inc 5 West Avenue, Stamford, Connecticut USA Tel: eller (i USA och Kanada), Fax: Produktdokumentation och översättningar på: P R O D U K T I N L A G A LIFECODES HLA SSO TYPNINGSPAKET används till Luminex För invitrodiagnostik. INNEHÅLLSFÖRTECKNING Symboler... 1 Bruksanvisning... 5 er med katalognummer... 2 A. Rening av genomiskt DNA... 5 Användningsområde... 4 B. Förstärkning... 5 Översikt och förklaring... 4 C. Hybridisering... 7 Procedurens principer... 4 D. Analys med Luminex... 7 er... 4 Resultat... 7 A. Identifiering... 4 Kvalitetssäkring... 7 B. Varningstexter... 4 Procedurens begränsningar... 7 C. sanvisningar... 4 Felsökning... 8 D. Rening eller förbehandling... 4 Förväntade värden... 8 E. Instabilitetsindikatorer... 4 Specifika funktionsegenskaper... 8 Instrumentkrav... 4 Referenser... 8 Provtagning och förberedning... 4 Begränsad licens... 9 Procedur... 5 Använda varumärken... 9 A. Tillhandahållet material... 5 Bilaga A... 9 B. Material, reagenser och utrustning som Gelektrofores... 9 behövs, men inte tillhandahålls... 5 Geltolkning... 9 SYMBOLER (Produktetiketter och dokumentbilagor) Partinummer Katalognummer Temperaturomfång Övre temperaturgräns Utgångsdatum Lämpligt för N-tester Får ej frysas Varning Se bruksanvisning Se bruksanvisning Tillverkare Europeisk auktoriserad representant EC REP Sida 1 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)

2 REAGENSER MED KATALOGNUMMER BM-A LIFECODES HLA-A Sondblandning µl 2-8 C LM-A LIFECODES HLA-A Typningspaket används till Luminex Produktnr Räcker till prover MX-A LIFECODES HLA-A Huvudblandning µl 2 till 8 C LC-AE LIFECODES HLA-A eres Typningspaket används till Luminex Produktnr Produktnumme r Räcker till prover MX-A LIFECODES HLA-A Huvudblandning µl 2 till 8 C BM-A LIFECODES HLA-A Sondblandning µl 2 till 8 C BM-AeRES LIFECODES HLA-A eres Sondblandning 2 till 8 C µl DS Förtunning ,7mL 18 till 30 C LM-B LIFECODES HLA-B Typningspaket används till Luminex Produktnr Räcker till prover MX-B LIFECODES HLA-B Huvudblandning µl 2 till 8 C BM-B LIFECODES HLA-B Sondblandning 2 till 8 C µl LC-BE LIFECODES HLA-B eres Typningspaket används till Luminex Produktnr Produktnumme r Räcker till prover MX-B LIFECODES HLA-B Huvudblandning µl 2 till 8 C BM-B LIFECODES HLA-B Sondblandning µl 2 till 8 C BM-BeRES LIFECODES HLA-B eres Sondblandning 2 till 8 C µl DS Förtunning ,7mL 18 till 30 C LM-C LIFECODES HLA-C Typningspaket används till Luminex Produktnr Räcker till prover MX-C LIFECODES HLA-C Huvudblandning µl 2 till 8 C BM-C LIFECODES HLA-C Sondblandning 2 till 8 C µl Sondblandningarna är ljuskänsliga. Undvik ljus i görligaste mån. VARNING: Använd ej produkterna efter utgångsdatum. Sida 2 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)

3 DS Förtunning ,7 ml 18 till 30ºC LM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Typningspaket används till Luminex Produktnr Räcker till prover MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Huvudblandning µl 2 till 8 C BM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Sondblandning 2 till 8 C µl LC-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eres Typningspaket används till Luminex Produktnr Räcker till prover LIFECODES HLA-DRB1 MX-DR µl 2 till 8 C Huvudblandning LIFECODES HLA-DRB1 BM-DR1 Sondblandning µl 2 till 8 C LIFECODES HLA-DRB1 eres BM-DR1eRES Sondblandning µl 2 till 8 C DS Förtunning ,7mL 18 till 30 C LC-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Typningspaket används till Luminex Produktnr LIFECODES HLA DRB 3,4,5 MX-DRB3,4, µl 2 till 8 C Räcker till prover Huvudblandning LIFECODES HLA DRB 3,4,5 BM-DRB3,4,5 Sondblandning µl 2-8ºC LM-DQB LIFECODES HLA-DQB Typningspaket används till Luminex Produktnr Räcker till prover MX-DQB LIFECODES HLA-DQB Huvudblandning µl 2 till 8 C BM-DQB LIFECODES HLA-DQB Sondblandning 2 till 8 C µl Sondblandningarna är ljuskänsliga. Undvik ljus i görligaste mån. VARNING: Använd ej produkterna efter utgångsdatum. Sida 3 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)

4 ANVÄNDNINGSOMRÅDE DNA-typning av HLA-alleler klass I och klass II. ÖVERSIKT OCH FÖRKLARING DNA-baserad HLA-typning med PCR-förstärkt DNA är en vanlig laboratorieprocess. PCR-förstärkning av DNA används i syfte att anrika en viss DNA-region. Vid HLA-typning används en efterföljande analys som ska fastställa egenskaperna hos förstärkt DNA. Flera analystyper, som t ex. SSP (1), direkt SSOP (2), RFLP (3) och omvänd SSOP punktblottningsteknik (4) har använts vid HLA-typning. LIFECODES HLA-SSO typningspaket använder, precis som SSOP och omvänd punktblottningsteknik, sekvensspecifika oligonukleotider (SSO) för att identifiera de HLA-alleler som förekommer i ett PCR-förstärkt prov. Det är SSOuppsättningen och inte metoderna som avgör förmågan att urskilja olika alleler i PCR-förstärkningen. För omvänd punktblottningsteknik och SSOP används enzymetiketter och kolorimetriska substrat vilket kräver vidareutveckling, medan LIFECODES-analysen är ett homogent multiplexsystem. Det innebär att SSOanalyserna sker simultant och hela analysen utförs i ett och samma reagensrör vid tillsättningen av en enskild reagens. PROCEDURENS PRINCIPER Själva LIFECODES HLA-SSO-typningen är baserad på hybridisering av etiketterade enkelsträngade PCR-produkter till SSO-sonder. Vid PCR-förstärkning av DNA används vanligtvis ekvimolara mängder av både framåt- och bakåtprimerer för att skapa en dubbelsträngad DNA-produkt. Men om mängden av en primer mycket överskrider de övriga, kan reaktionen generera några enkelsträngade DNA-produkter utöver de dubbelsträngade. Under LIFECODESförstärkningens initiala cykler genereras dubbelsträngat DNA. När den begränsande primeren är slut använder återstående primerer den dubbelsträngade produkten som mall för att skapa enkelsträngat DNA. Den här metoden ger alltså både dubbel- och enkelsträngade produkter, som båda vid denaturering deltar i hybridiseringsreaktionen. Var och en av sonderna är ev. homolog till en sekvens i kopierad DNA-produkt, som är unik för en allel eller en grupp av alleler. Dessa sonder är alltså utformade så att var och en av dem prioriterar hybridiseringen av en kompletterande region, som ev. förekommer i den kopierade DNA-produkten. Förstärkt DNA hybridiseras också mot en eller flera konsensussonder som ska är homologa till sekvenserna i samtliga alleler i ett lokus. SSO-typningen kan påverkas av typen av biologiskt material, reningsmetod, den genomiska DNA-produktens mängd och integritet. Den signal som erhålls för konsensussonden/-sonderna kan således fungera som en indikator för en framgångsrik förstärknings- och hybridiseringsprocess. Den signal som konsensussonden ger kan även användas för att normalisera signalen från allelspecifika sonder, och korrigera för ev. varierande mängder av den kopierade produkten i hybridiseringsreaktionen. Analyserna av resultaten från SSO-typningen kan användas för att fastställa närvaro eller frånvaro av en viss DNA-sekvens i förstärkt DNA, samt identifiera möjliga alleler i provet. Vid LIFECODES HLA-SSO-typningen fästs sonder vid Luminex Microspheres som är avsedda för Luminex. Upp till 100 olika populationer av Luminex Microspheres kan blandas och analyseras av Luminex eftersom varje population av mikrosfärer kan urskiljas med hjälp av unika fluorescerande signaturer eller färger. Olika SSO-sonder kan kopplas till varje färgmikrosfär. På så sätt kan en blandning av olika sonder särskiljas från varandra genom att de kan associeras med en viss färgmikrosfär. Luminex kan även kvantifiera de relativa mängderna etiketterade PCR-produkter som hybridiseras i varje Luminex Microsphere. Den relativa signalen som erhålls med SSO-sonderna vid LIFECODES-analysen kan därför, precis som med andra SSOP-metoder, användas för att fastställa sondernas positiva eller negativa reaktivitet med det kopierade DNA-provet (se avsnittet Resultat). Härmed erhålls den information som krävs för att fastställa provets HLA-fenotyp. REAGENSER A. Identifiering I tabellerna i avsnittet er efter katalognummer hittar du kompletta listor över produkter och katalognummer. B. Varningstexter 1. För invitrodiagnostik. 2. Använd separata pipetter för för- och efterhantering av PCR. 3. Bioriskvarning: Alla biologiska prover och blodprover ska behandlas som potentiellt smittsamma. Följ allmänna säkerhetsåtgärder vid hantering. 4. Förtunning, sondblandningar, Taq-polymeras och R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin innehåller farliga föreningar. Låt inte dessa komma i kontakt med hud och ögon, och avyttra materialen efter användning i enlighet med lokala föreskrifter. Se säkerhetsinformationen för ytterligare info. 5. Resultatet från dessa paket används ej som enda grund, på vilken ett kliniskt beslut som påverkar patienten fattas. C. sanvisningar 1. Information om korrekta lagringstemperaturer hittar du på förpackningens etikett. 2. Sondblandningar och R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin är ljuskänsliga, FÖRVARA MÖRKT; FÅR EJ FRYSAS. 3. Använd ej produkterna efter deras respektive utgångsdatum. D. Rening eller förbehandling Se Provtagning och förberedning. E. Instabilitetsindikatorer 1. Om salter har fällts ut ur lösningen under transport eller förvaring, måste dessa återlösas före användning. Vortexa i rumstemperatur (18 C till 30 C). 2. Använd inte R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin som har frysts under transport eller förvaring. INSTRUMENTKRAV 1. Luminex och XY-plattform (produktnummer , ) 2. Termocykler utrustad med uppvärmt lock, inställningsbara ramptider, ett minsta termiskt område på 2 C till 100 C och en noggrannhet på minst +/- 0,5. Villkoren för termocyklers kan behöva ändras för att profilerna ska kunna optimeras. En termoprofil kan erhållas genom att kontakta Technical Service på telefon. +1 (203) eller i USA och Kanada (888) PROVTAGNING OCH FÖRBEREDNING a. Mänskligt DNA kan renas från helblodprover, lättcellsskikt eller bukala svabbprover med hjälp av en validerad process som uppfyller kriterierna nedan. b. DNA extraherad från blod bevarat i EDTA och ACD (Acid Citrate Dextrose) har testats och har visat förväntade resultat i denna analys. DNA extraherat från blod bevarat i heparin kan inte användas i denna analys. Andra konserveringsmedel har inte testats. c. Isolerat DNA ska ligga i 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0 eller i sterilt vatten. Vid förekomst av ett kelatbildande medel som t ex. EDTA, får inte den slutgiltiga koncentrationen av det kelatbildande medlet överskrida 0,5 mm. d. Förekomst av alkohol, rengöringsmedel eller salter kan påverka DNA-förstärkningen negativt. e. Slutgiltig DNA-koncentration bör vara ng/µl. f. Mätning av absorberingen i DNA-proverna vid 260 och 280 nm bör ge en proportion på 1,65 till 2,0. Sida 4 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)

5 g. DNA-produkten kan användas omedelbart efter isoleringen, eller lagras vid 20 C i upp till ett år. Upprepad infrysning/upptining bör undvikas eftersom det kan försämra kvaliteten. PROCEDUR A. Tillhandahållet material (I tabellerna i avsnittet er efter katalognummer finns mer information) Lämplig huvudblandning (MX) Lämplig sondblandning/sondblandningar (BM) Förtunning (DS) Tröskeltabell(er), träffmönstertabell(er) B. Material, reagenser och utrustning som behövs, men inte tillhandahålls (listat eller motsvarande) R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin (SA-PE), 1 mg/ml (Lifecodes kategorinr ) Luminex Sheath Fluid (1X eller 20X, Lifecodes kategorinr eller ) Rekombinant Taq-polymeras Vortexmixer Sterilt vatten (Lifecodes kategorinr ; 20 ml) PCR-rör och hattar (AB Gene 0,2 ml Thermo Strip, nr. AB0451/G) Termocykler (PCR) 96 brunnar (Costar nr. 69) Microseal -film (Bio-Rad. nr. MSA-01) eller -tejp (Costar nr. 6524) BRUKSANVISNING Termocykler (se Instrumentkrav, sidan 3) Badsonikator (Fisher Scientific, nr. FS15 eller FS20) Mikrocentrifug Spärrfiltermunstycken Luminex kalibreringskulor (Cal 1, Cal 2, Con 1 och Con 2, Lifecodes kat.nr , , respektive ) Pipettorer, flerkanaliga pipettorer och munstycken (1-20µL, µL, 1000µL) Kalkylprogramvara för presentation av kommaseparerade filer (csv) Värmeblock (Fisher Scientific standardvärmeblock, nr ) 70 % isopropanol eller 20 % blekmedel ANMÄRKNINGAR: Sondblandningar och SA-PE är ljuskänsliga: förvaras mörkt och får ej frysas. Värm kulorna till C i minst 5-10 minuter så att komponenterna solubiliseras ordentligt i sondblandningen. Sonikera helt kort (~15 sek), mixa i vortexsond i minst 15 sekunder tills kulorna är helt uppslammade. Var mycket försiktig vid alikvoteringen, använd kalibrerade pipetter. Annars får du ev. ingen reagens och provet misslyckas. Alla temperaturangivelser måste iakttas noggrant. Så små fluktuationer som +/- 0,5 C kan påverka resultatet. I hybridiseringsfasen får proverna inte förbli i utspätt tillstånd vid 56 C i mer än fem minuter (se avsnittet Resultat). Vi rekommenderar att de kopierade proverna analyseras så snart som möjligt. Om proverna inte kan köras i Luminex samma dag, kan den kopierade produkten lagras i upp till tre dagar vid 2-8 C innan den används. Vid längre förvaring rekommenderas 20ºC under upp till en vecka fram till tidpunkten för analysen. Den kopierade produkten kan bara frysas och tinas en gång. Upprepad infrysning och upptining gör att de kopierade proverna bryts ned, vilket ger sämre resultat vid analysen. A. Rening av genomiskt DNA, med valfri metod. Slutgiltig koncentration ska ligga på ng/µl. Justera vid behov med sterilt vatten. Se till att alla prover håller samma koncentration. B. DNA-förstärkning (PCR) 1. Värm huvudblandningen (MX) till rumstemperatur (18 till 30 C). 2. Vortexa försiktigt reagenserna i cirka 10 sekunder. På så sätt garanteras salthalterna i lösningen. Snurra försiktigt (5-10 sekunder) i mikrocentrifug så att innehållet hamnar på botten av röret. 3. Använd Tabell 1 nedan när du förbereder komponenterna för förstärkning av n+1 reaktioner. Använd mängdanvisningarna för respektive komponent per reaktion (utom för DNA). Den slutgiltiga volymen ska vara µl per reaktion med sterilt vatten. Vortexa försiktigt, centrifugera ner och lägg på is. 4. Pipettera lämplig mängd genomiskt DNA (100 till 300 ng) i PCR-rören. 5. Alikvotera huvudblandningen i PCR-rören med genomiskt DNA. (Den sammanlagda volymen av huvudblandningen och genomiskt DNA ska vara µl för respektive reaktion.) 6. Förslut rören väl för att undvika avdunstning vid PCR. 7. Placera proverna i termocyklern och kör programmet, se Tabell 2. Tabell 1. komponenter vid förstärkning förstärkning Komponent Mängd per PCRprovsreaktion LIFECODES Huvudblandningen 15 µl Genomiskt DNA ng/µl Totalt ~200 ng Taq-polymeras 0,5 µl (2,5 U) Sterilt vatten Till µl slutgiltig volym Anmärkning: För att provet säkert ska kopieras, se bilaga A Produktgelelektrofores. Tabell 2. Termocyklerns förutsättningar för 95 C i 5 min Ant. cykler: 1 95 C i 30 sek 60 C i 45 sek 72 C i 45 sek Ant. cykler: 8 95 C i 30 sek 63 C i 45 sek 72 C i 45 sek Ant. cykler: C i 15 min Ant. cykler: 1 Sida 5 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)

6 C. Hybridisering Kontrollera att hybridiseringens buffertkomponenter i LIFECODES sondblandning solubiliseras och att kulorna är helt uppslammade. Starta Luminex och XY-plattformen och låt värma upp i 30 minuter. 1. Värm sondblandningen i C i minst 5-10 minuter, så att komponenterna solubiliseras ordentligt i sondblandningen. 2. Sonikera helt kort (~15 sek), mixa i vortexsond i minst 15 sekunder tills kulorna är helt uppslammade. 3. Alikvotera 5 µl av lokusspecifik PCR-produkt i en termocykler med 96 brunnar (Costar nr. 69). 4. Alikvotera 15 µl av lämplig sondblandningen i respektive brunn. eres-paketet kräver två brunnar per prov, en för eres sondblandning och en för standardsondblandningen. eres-sondblandningen och standardsondblandningen behöver inte köras samtidigt. Båda sondblandningarna krävs för att erhålla eres-resultat. Vid alikvotering av sondblandning till mer än 10 brunnar ska man försiktigt vortexa sondblandningen efter varje uppsättning om tio. Försegla plattan med polyetentejp (Costar No. 6524). 5. Hybridisera proverna med följande inkubationstemperaturer: Tabell 3. Termocyklerns förutsättningar för hybridisering 97 C i 5 minuter 47 C i 30 minuter 56 C i 10 minuter 56 C vänta (HOLD) 6. Medan proverna hybridiseras, förbered en 1:200 förtunning/sa-pe-blandning. Kombinera 170 µl förtunning (DS) och 0,85 µl 1 mg/ml SA-PE per prov. Här rekommenderas att förtunning för n+1 prover tillverkas, i händelse av pipetteringsförlust. (Se Tabell 4) 7. Förvara förtunningen/ SA-PE-blandningen i mörker, i rumstemperatur; SA-PE är ljuskänsligt! Förtunningen kan värmas i 45 C i 5 minuter och vortexas vid ankomst, så att alla komponenter ligger kvar i lösningen. Förtunningen ska hålla rumstemperatur (18-30 C) innan du blandar. Förbered omedelbart före användning och avyttra ev. rester. Tabell 4. Förberedning av förtunning Volymer Antal prov Förtunning (DS) SA-PE µl 0,85 µl 5 8 µl 4,25 µl µl 8,5 µl µl 17 µl 80 µl 42,5 µl Anmärkning: STÄNG INTE AV HYBRIDISERINGSPROGRAMMET INNAN BRICKAN HAR AVLÄGSNATS FRÅN TERMOCYKLERN! 8. Vid väntan i 56 C, medan brickan befinner sig i termocyklern, späd proverna med 170 µl förtunning/ SA-PE-blandning. Det är viktigt att alla prov späds ut inom 5 minuter (efter 10 minuters väntan (HOLD) i 56 C). 9. Ta ut provbrickan från termocyklern och placera i Luminex. D. Analysera provet med Luminex* Bäst resultat får du om du analyserar proverna i Luminex omedelbart. Proverna kan läsas upp till 30 minuter efter utspädning. Om du inte ska läsa proverna omedelbart, förvara dem i mörker. 1. Starta Luminex mellan 30 minuter och 4 timmar innan proverna ska analyseras. 2. Innan proverna analyseras i Luminex, ställ in den körning som ska användas vid analysen. a) Välj Create a New Batch (Skapa ny batch) i File-menyn (Arkivmenyn). Om du t ex. analyserar HLA-DRB1, lägg till Batch för HLA-DRB. En Batchmall öppnas och döps, i det här fallet, till HLA-DRB. Tänk på att mallversionerna är partispecifika och motsvarar partinumren på paketen. Följ de stegvisa anvisningarna på skärmen när du skapar batchar. När du namnger en batch, lägg inte in kommatecken i namnet eftersom all information efter ett komma går förlorad vid exportering av data. Mer information om hur du skapar batchar och multibatchar finns i bruksanvisningen till Luminex. b) Klicka på utmatningsikonen för att mata ut platthållaren. Placera termocyklerns platta med proverna i platthållarens XYP-värmeblock. c) Klicka på ikonen för inmatning av plattan. Nu är proverna klara att analyseras. En inledande fas utförs innan själva körningen startas. d) När proverna har körts igenom instrumentet följer en saneringsfas med 70 % Isopropanol eller 20 % vanligt blekmedel, följt av två tvättfaser. Om instrumentet inte ska användas mer under dagen, kan det stängas av nu. 3. När en batch är klar, exporteras dina data som en kommaseparerad fil (csv). Dessa filer döps till OUTPUT.CSV och sparas i en mapp med samma batchnamn som matades in i Luminex IS. Dessa data är nu tillgängliga för typning enligt nedanstående anvisningar. *I bruksanvisningen till Luminex IS hittar du information om hanteringsprcedurer, inkl. initiering, kalibrering, underhåll och avstängning. Sida 6 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)

7 RESULTAT Så här kan typningen gå till: De genererade CSV-filerna kan öppnas och dess data bearbetas i vanliga kalkylprogram som t ex. Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro eller motsvarande. Analysen består av följande faser: 1) Se till att antalet event för respektive SSO i varje prov är minst 60. Du hittar den här informationen under DataType (Datatyp): Count (Räkna) i CSV-filen. 2) Kontrollera att värdena för respektive provs konsensussonder ligger över det lägsta medianvärdet för fluorescensintensitet eller MFI. Lägsta tröskelvärdet är partispecifikt. Du hittar det i tröskelvärdestabellen. Varning: För att resultaten ska bli tillförlitliga måste tillräcklig mängd data hämtas in av Luminex. Samla in minst 60 händelser för varje SSO. 3) Genom att dra ifrån sondens bakgrundskontrollvärde från provets värde, erhålls en korrigerad uppsättning bakgrundsdata. Bakgrundskontrollens värden återfinns i tröskelvärdestabellen och är partispecifika. Bakgrundsvärdena är genomsnittliga MFI-värden för respektive kula och ska kompensera för bakgrundsbrus orsakat av avvikelser. 4) Genom att, för respektive prov, dela varje sonds korrigerade bakgrundsdata med motsvarande konsensussonds korrigerade bakgrundsvärde, erhålls en normaliserad uppsättning data. MFI (sond) MFI (kontrollämne för sonden) MFI (konsensus) MFI (kontrollämne för konsensus) 5) Vid respektive sond anges det normaliserade värdet i tröskelvärdestabellen. 6) När samtliga sonder har tilldelats värden kan träffmönstret (d v s kombinationen av alla positiva och negativa uppgifter för ett givet prov) jämföras med de medföljande träfftabellerna för sonder. Varning: Varje lokus och varje sondblandning har en separat tröskelvärdestabell. Dessa tröskelvärdestabeller är partispecifika. Kontrollera att partinumret i tabellen matchar partinumret på typningspaketet. Om ett normaliserat värde för en viss sond hamnar över maxgränsen för en negativ uppgift, och under minimigränsen för en positiv uppgift, ska sondens prov anses resultatlöst. Provet ska typas, först genom att värdet antas vara negativt och sedan genom att värdet antas vara positivt. I avsnittet FÖRVÄNTADE VÄRDEN finns mer information om tröskelvärden. KVALITETSSÄKRING Det rekommenderas att en negativ och en positiv kontroll körs med varje prov, till exempel ett blindprov med vatten och ett tidigare typbestämt prov. Consensus sekvensspecifika oligonucleotid (SSO) sonder, som listas i tröskeltabellen, hybridiseras till respektive lokusspecifika alleler. Värden som inhämtas med Consensus SSO från positiva kontroller ska överskrida tröskelvärdet för SSO enligt vad som anges i arbetsbladet med tröskeltabellen. Värden som inhämtas med Consensus SSO från blindprov med ska ligga under tröskelvärdet för SSO enligt vad som anges I arbetsbladet med tröskeltabellen. LIFECODES sondblandningar innehåller en eller flera Consensus SSO sonder identifierade I arbetsbladen för typningspaketet. Dessa konsensussonder hybridiserar till alla alleler och fungerar som interna kontroller för att verifiera förstärkning och för att bekräfta att hybridisering skett. Om minimivärdet inte inhämtas för dessa SSO, kan det inträffa att provet inte ger rätt typ. Provet får då upprepas. Analysen bör köras enligt rekommendationen i förpackningen, samt enligt övriga kvalitetskontrollmetoder i enlighet med gällande lokala, delstatliga, federala och/eller andra kontrollorgan. PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR De beskrivna förutsättningarna för PCR och utvärdering kräver noggranna kontroller. Avvikelser från dessa parametrar kan leda till felaktigheter. Alla instrument ska kalibreras enligt tillverkarens anvisningar och användas inom ramen för tillverkarens parametrar. 1) Kulorna värms upp i förväg och ska vara väl uppslammade före användning. På så sätt garanteras att hybridiseringsbuffertens komponenter finns med i lösningen. 2) Inkubation vid 47 C respektive 56 C kräver precision på hög nivå (+/- 0,5 C). Använd termocykler. Temperaturen ska kontrolleras på plattan i en termocykler med 96 brunnar, med hjälp av en termoomkopplare (t ex. Bio-Rad, VPT-0300 eller motsvarande). Temperaturen i och mellan brunnarna får inte avvika mer än +/- 0,5 C. 3) Tiden vid 56 C är kritisk och får inte överskrida sammanlagt 15 minuter. Här ingår 10 minuters inkubation plus max 5 minuter för spädning av samtliga prov med förtunning/ SA-PE-blandningen. 4) Efter spädning är proven stabila i rumstemperatur i upp till 2 timmar (förvaras mörkt). Det kan ta hela 1,5 timme att köra en hel 96-brunnsplatta genom Luminex, och för att garantera att det sista provet analyseras inom tvåtimmarsgränsen bör analysen startas max 30 minuter efter spädningen. 5) Blanda inte komponenter från olika paket och partier. På grund av HLA-typningens komplexa natur bör endast kvalificerad personal hantera datatolkningen och typningsuppgifterna. Sida 7 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)

8 FELSÖKNING PROBLEM MÖJLIG ORSAK LÖSNING Låg kulräkning Sondlösningen är dåligt uppslammad Förvärm, sonikera och vortexa sondlösningen och upprepa analysen. CON-tröskelfel Instrumentet fungerar inte som det ska Provet gick inte att kopiera/resultatet blev dåligt* Kalibrering ej utförd Provets flödesväg blockeras Lågt DNA Salter i huvudblandning saknas i lösningen Kalibrera instrumentet. (Se bruksanvisningen till Luminex IS.) Nålen avlägsnas och sonikeras. Gör en backspolning. Om problemet kvarstår, kontakta Immucor Transplant Diagnostics, Inc Kontrollera DNA-produktens koncentration och renhet. Värm Huvudblandning vid 37 C i 5 minuter, vortexa försiktigt och centrifugera helt kort. Flerfaldiga SSO-fel alt. provet producerar ej HLAtypningsresultat Dålig Taq-polymeras Förstärkningsförhållandena följer inte angivna parametrar Lågt medianvärde för fluorescensintensitet (MFI) Allelspecifik förstärkning Förorenat DNA-prov Delvis nedbruten DNA-produkt Avdunstning i samband med hybridisering Förstärkningsförhållandena följer inte angivna parametrar * PCR-förstärkning kan bekräftas med gelelektrofores (se bilaga A). Använd endast rekombinant Taq. Prova Lifecodes nr Kör en termoprofil på termocyklern och kontrollera att angivna parametrar efterföljs. Värm förtunningen i 45 C i 5 minuter före användning och vortexíng. Förvara i rumstemperatur. Byt ut R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin. Kör en termoprofil på termocyklern och kontrollera att angivna parametrar efterföljs. Återisolera DNA från blodprovet. Om du inte använder hela plattan, låt en rad på respektive sida om analysproverna vara tom, så att plattan kan förseglas ordentligt. FÖRVÄNTADE VÄRDEN Värden kan normalt bestämmas som positiva och negativa. I vissa fall kan värdena vara resultatlösa. Resultatlöst värde innebär att varken positiva eller negativa värden har kunnat iakttas. Om ett prov innehåller resultatlösa värden för en viss SSO-sond, ska provet typas med den sond som är negativ och därefter med den sond som är positiv. Tre utfall finns: 1. Ett av alternativen (t.ex. positiv eller negativ) matchar. 2. Båda alternativen ger matchningar. Provet kan analyseras på nytt eller också kan allelerna från båda typningarna rapporteras. 3. Inget av alternativen ger matchning. I det här fallet finns troligtvis flera sonder med felaktiga uppgifter. Provet måste analyseras på nytt och möjligtvis kopieras om. Om fler än två sonder är resultatlösa, ska hela provet analyseras om. Om ett träffmönster inte resulterar i en HLA-typning, ska provet kopieras om och analyseras på nytt. Eventuellt måste även DNA återisoleras ur provet, samt kopieras och analyseras på nytt. Som angavs i avsnittet Procedurens begränsningar, är det mycket viktigt att protokollet följs exakt. Eventuella avvikelser kan leda till en misslyckad typning. SPECIFIKA FUNKTIONSEGENSKAPER När LIFECODES HLA SSO typningspaket används enligt proceduren som beskrivs i produktinlagan kan DNA-typning av HLA i klass I och klass II fastställas. HLA A eres-paketet visar 98,46 % överensstämmelse (95,24 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) och HLA B eres, DRB1 eres och DRB 3-, 4-, 5- paketen visar 100 % överensstämmelse (97,72 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) för 130 prover utvärderade vid jämförelse med resultat som inhämtats med dubbelriktad sekvensering. HLA A-, B-, C- och DQB-paket visar 100 % överensstämmelse (92,9 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) och DRB-paket visar 98 % överensstämmelse (89,4 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) för prover utvärderade vid jämförelse med resultat som inhämtats med Pel- Freez SSP UniTray-metoden. HLA DRB1-paketet visar 98 % överensstämmelse (91,1 % under gräns på 95 % konfidensintervall) för 60 prover utvärderade vid jämförelse med resultat som inhämtats med LIFECODES HLA DRB-paket. REFERENSER 1. Olerup, O., o.a. (1992) Tissue Antigens 39: Saiki, RK., o.a. (1986) Nature 324: Maeda, M., o.a. (1989) Tissue Antigens 34: Bugawan, TL., o.a. (1990) Immunogenetics 32: 231 Sida 8 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)

9 BEGRÄNSAD LICENS Denna produkt tillhandahålls ej med Taq-polymeras och inkluderar ej en licens under de utländska patenten, vilka ägs av F. Hoffmann-La Roche Ltd. och Roche Molecular Systems, Inc. att utföra den PCR-process ( Polymerase Chain Reaction ) som beskrivs i dessa patent. Mer information om kravet på att erhålla inköpslicenser i ditt land kan erhållas från F. Hoffmann-La Roche Ltd. eller Roche Molecular Systems, Inc. Vid inköp av den här produkten erhålls en begränsad, icke överförbar licens enligt amerikanskt patent 5,981,180 eller utländsk motsvarighet, som innehas av Luminex Corporation, för utförandet av flerfaldiga HLA-typningsanalyser av kliniska prover. Tillverkare: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 5 West Avenue, Stamford, Connecticut USA Telefon: eller (i USA och Kanada), Fax: Auktoriserad representant: Emergo Europe, Molenstraat 15, 2513 BH, The Hague, The Netherlands. Telefon: (31) (0) Fax: (31) (0) Europeisk teknisk service: Telefon: +32/ Dokumentets senaste revidering och utgivning: Rev 17, ANVÄNDA VARUMÄRKEN AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. Luminex Luminex Corporation IDNA Agarose QIAAmp GelStar Cambrex Bio Science Qiagen Inc. Cambrex Bio Science BILAGA A Gelektrofores PCR-reaktionerna som utförs med LIFECODES HLA-SSO typningspaket är avsedda att generera både dubbel- och enkelsträngade produkter, d v s de produkter som i huvudsak hybridiseras till SSO. Vid kvalitetskontroll eller felsökning av ett experiment kan ev. en gelelektrofores krävas för att kontrollera förekomsten av förstärkt DNA i PCR-reaktionen. Erforderligt material (listat eller motsvarande) Elektrofores agaros (Cambrex IDNA agaros nr. 170) Elektroforesinstrument/nätanslutning 1x gelbuffert (40xTAE, Promega nr. V4281) GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Cambrex nr. 535) UV-transilluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. modell TM36) Bildhanteringssystem Den relativa migreringen av den enkelsträngade produkten beror på gelkoncentrationen och vilket buffertsystem som används. Ungefärlig migrering vid varje förstärkning listas nedan, för prov som körs i 2 %-ig agarosgel i 1x TAE-buffert. Elektroforesens förutsättningar 1. Ta ut GelStar Nucleic Acid Stain (Cambrex nr. 535) ur frysen och låt tina. Förvara mörkt. 2. Den gel som används här måste vara 2 %-ig, d v s till en 200 ml gelbädd används 4 gram agaros till 200 ml 1X TAE (späd från 40X TAE). Tillsätt 10 µl GelStar Nucleic Acid Stain till den smälta agarosen. När gelen öses, lämna rikligt med utrymme för DNA-produktens stigning (3-5 cm). VAR FÖRSIKTIG: GelStar är en potentiell carcinogen. ANMÄRKNING: Det går att köra geler med 20 µl av 10 mg/ml etidiumbromid i stället för GelStar Nucleic Acid Stain. Produktbandets intensitet är lägre med gel som innehåller etidiumbromid än gel med GelStar. VAR FÖRSIKTIG: Etidiumbromid är en känd carcinogen. 3. Förvara gelen mörkt och låt stelna. 4. Läsa in en blandning av 2,5 µl av varje PCR-produkten och 2,5 µl 2 X lastning buffert med synliga färgämnet per prov, per förstärkning. Kör gelen i mörker vid cirka 160 V i ungefär 45 minuter, eller tills provet har körts så länge att det går att iaktta separata band för singel- och dubbelsträngad produkt (bromofenolblå band eller annan synlig markör migrerar 3-5 cm från brunnarna). 5. Fotografera med UV-transilluminator och ett GelStar gult fotofilter (Cambrex nr. 536). VARNING: Vid hantering av GelStar Nucleic Acid Stain eller etidiumbromid, samt vid fotografering av gel med UV-transilluminator, ska skyddsutrustning bäras. 6. Gelanalys HLA-A HLA-B HLA-C HLA- DRB1 HLA-DRB 3,4,5 HLA-DQB Dubbelsträngad(e) ~420 ~370, ~340 ~476, ~447 ~280 ~280 ~260, ~160 Enkelsträngad(e) ~240 ~200 ~2, ~200 ~180 ~180 ~170, ~100 Geltolkning Brunn Förstärkning Icke-förstärkning Dubbelsträngat DNA Enkelsträngat DNA Primerband ----(ljus) (mindre ljust) Sida 9 av 9 LC775IVDSV.17 (02/14)