CINtec PLUS Cytology Kit

Transkript

1 CINtec PLUS Cytology Kit Figur 1. Cervikala epitelceller som är positiva för p16 INK4a (brun cytoplasmisk färgning) och för Ki-67 (röd nukleär färgning) AVSEDD ANVÄNDNING CINtec PLUS Cytology Kit är en immuncytokemisk analys för samtidig kvalitativ detektion av proteinerna p16 INK4a och Ki-67 i cervikala cytologipreparat. Produkten är ett hjälpmedel avsett för att identifiera kvinnor med höggradiga cervikala intraepiteliala lesioner i en screeningpopulation, och i delgrupper med Pap-cytologiresultatet ASC-US (atypiska skvamösa celler av obestämd signifikans) eller LSIL (låggradig skvamös intraepitelial lesion), eller hos patienter med positiva testresultat med hög risk för HPV (humant papillomvirus). Tolkning av testresultat får endast utföras av certifierad personal där hänsyn tas till patientens kliniska anamnes och ytterligare diagnostik. Produkten är avsedd för in vitro-diagnostisk (IVD) användning. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING I eukaryotiska celler regleras progressionskontroll av celldelningscykeln genom ett komplicerat mönster av kontrollerat uttryck och posttranslationella modifieringar av cellcykelreglerande proteiner. Proteinet p16 INK4a spelar en avgörande roll i denna regleringsmekanism i den eukaryotiska cellcykeln. Det ingår i den retinoblastomproteinmedierade (prb) kontrollen av G1/S-fasövergången och utlöser cellcykelavbrott under celldifferentieringsprocesser. Därigenom skapar p16 INK4a en antiproliferativ effekt under normal cellcykelprogression. I terminalt differentierade epitelceller nedregleras p16 INK4a - uttryck till nivåer som normalt inte kan detekteras via immuncytokemi [1]. Ki-67 är ett proliferationsassocierat protein som endast kan detekteras i prolifererande cellkärnor. Detaljerade cellcykelanalyser har påvisat att detekterbara nivåer av Ki-67- antigenen förekommer i alla faser av cellproliferation såväl som i mitos, medan passiva eller vilande celler i G0-fasen inte uttrycker antigenen [2]. Eftersom celler som överuttrycker p16 INK4a aktivt prolifererar endast när deras cellcykelkontrollmekanism skadats, bör uttrycket av både p16 INK4a och proliferationsmarkören Ki-67 i samma cell ömsesidigt utesluta varandra under normala fysiologiska förhållanden. Därför kan samtidigt uttryck av p16 INK4a och Ki-67 i vissa celler användas som indikator för avregleringen av cellcykelkontrollen i respektive cell. I cervikal neoplasi har p16 INK4a påvisats vara starkt överuttryckt som en följd av funktionell inaktivering av prb, medierat av E7-onkoproteinet från humana papillomavirustyper med hög risk (HR-HPV) [3;4]. Eftersom E7 behövs för att etablera och underhålla en malign fenotyp i HPV-associerade precancerösa och cancerösa lesioner, är överuttryck av p16 INK4a direkt länkat till onkogen aktivitet i olika HR-HPV-typer och har följaktligen föreslagits som surrogatmarkör för transformering av HPV-infektioner [1;5]. Många studier har analyserat och påvisat den kliniska nyttan av p16 INK4a -immunfärgning i cervikal histologi [1;3;5;7;8;4;9;10] och cervikal cytologi [5;11;12]. Samordnad tolkning av objektglas, som färgats för att hitta p16 INK4a, har i olika studier påvisats betydligt öka tillförlitligheten mellan olika observatörer, såväl som den diagnostiska precisionen för detektion av CIN2 och mer höggradiga lesioner i histologiska cervikalvävnadsprover [6;10;12]. I cervikal cytologi har immunfärgning för p16 INK4a påvisats vara ett värdefullt verktyg för effektiv prioritering av Pap-cytologifall som klassas som ASC-US eller LSIL, med känslighetsnivåer för detektion av underliggande CIN2 eller mer höggradiga lesioner som liknar dem som gäller för HPV-testning, men som har betydligt högre specificitet [12]. Vidare har det föreslagits att detektion av p16 INK4a i cytologiska prover kan användas som en värdefull tilläggsmarkör för prioritering av kvinnor som testat positivt för HR-HPV vid cervikalcancerscreening [11;13]. I princip alla höggradiga cervikala intraepiteliala lesioner (dvs. CIN2, CIN3 eller högre) har påvisats överuttrycka p16 INK4a [3;6;8]. Eftersom en stor del epitelceller i CIN-lesioner även visar proliferativ aktivitet, kan detektion av cervikala epitelceller som samtidigt uttrycker både p16 INK4a och Ki-67 användas som indikator på transformerad cellstatus. En metod, som baseras på utvärdering av cervikala cytologiprover avseende förekomsten av enskilda cervikala epitelceller som visar ett positivt tvåfärgat resultat för p16 INK4a och Ki-67, ger därför både högre känslighet och specificitet för förekomsten av precancerös och cancerös sjukdom [14;15;16;17;18;19;20;21]. PROCEDURPRINCIP CINtec PLUS Cytology Kit innehåller en uppsättning reagens för samtidig immuncytokemisk detektion av proteinerna p16 INK4a och Ki-67 i cytologiska prover som erhållits från livmoderhalsen. Proteinerna detekteras med hjälp av en bruksfärdig blandning av primära monoklonala antikroppar som innehåller en monoklonal musantikropp riktad mot humant p16 INK4a -protein (klon E6H4 ) och en primär rekombinant kaninantikropp riktad mot humant Ki-67-protein (klon AC3). Efter cellkonditionering, inhibering av endogen peroxidasaktivitet och inkubation med den primära antikroppsblandningen, använder analysen två bruksfärdiga detektionssystem som är optimerade för användning på cervikala cytologiprover: en sekundär antimusantikropp från get kovalent bunden till HQ-haptener (patentskyddad hapten) och en anti-hq-hapten, pepparrotsperoxidas (HRP)- konjugerad tertiär antikropp som är optimerad för detektion av den monoklonala musantikroppsklonen E6H4; en sekundär antikaninantikropp från get kovalent bunden till NP-haptener (patentskyddad hapten) och en NP-hapten, alkalisk fosfatas-konjugerad (AP) tertiär antikropp som är optimerad för detektion av den rekombinanta kaninantikroppsklonen AC3. De kromogena reaktionerna baseras på den HRP-medierade omvandlingen av 3,3 - diaminobensidintetrahydroklorid (DAB) och den AP-medierade omvandlingen av Fast Red med naftolfosfat vilket resulterar i en brun fällning på p16 INK4a -antigenplatsen respektive en röd fällning på Ki-67-antigenplatsen. Efter automatisk kontrastfärgning och blåning följer en monteringsprocedur i två steg. Först monteras objektglaset med ett vattenlösligt monteringsmedel. Därefter täcks objektglaset med permanent monteringsmedel. Färgningsresultaten utvärderas genom inspektion med ljusmikroskop / SV Rev D

2 Figur 2. Detektion av humant p16 INK4a -protein MEDFÖLJANDE REAGENS CINtec PLUS Cytology Kit innehåller tillräckligt med reagens för 100 tester. Röd fällning Cell DAB-fällning Cell HQ Linker p16 primär antikropp E6H4 NP Linker Ki-67 primär antikropp AC3 Figur 3. Detektion av humant Ki-67-protein HQ NP HQ Målantigen NP Målantigen H2O2 DAB HRP Multimer Naftolfosfat Fast Red AP Multimer CINtec PLUS Primary Antibody Cocktail (p16/ki-67) innehåller en blandning av monoklonal musantikroppsklon E6H4 riktad mot humant p16 INK4a -protein och primär rekombinant kaninantikroppsklon AC3 riktad mot humant Ki67-protein (< 5 µg/ml total antikropp) i en buffert innehållande protein med ProClin 300 som konserveringsmedel. CINtec PLUS Red anti-rabbit NP Linker innehåller NP-märkt antikanin- IgG från get (< 10 µg/ml; NP är en patentskyddad hapten som är kovalent bunden till getantikroppen) i en buffert innehållande protein med ProClin 300 som konserveringsmedel. CINtec PLUS Red AP Multimer innehåller en monoklonal anti-np-märkt tertiär AP-musantikropp (< 20 µg/ml) i en buffert innehållande protein med ProClin 300 som konserveringsmedel. CINtec PLUS DAB-peroxidashämmare innehåller väteperoxidlösning (< 5 %). CINtec PLUS DAB anti-mus HQ Linker innehåller HQ-märkt antimus-igg från get (< 40 μg/ml; HQ är en patentskyddad hapten som är kovalent bunden till getantikroppen) i en buffert innehållande protein med ProClin 300 som konserveringsmedel. CINtec PLUS DAB HRP Multimer innehåller en monoklonal anti-hqmärkt tertiär HRP-musantikropp (< 10 µg/ml) i en buffert innehållande protein med ProClin 300 som konserveringsmedel. CINtec PLUS DAB innehåller 3,3 -diaminobensidintetrahydroklorid (< 1 %) i en patentskyddad stabiliseringslösning med ett patentskyddat konserveringsmedel. CINtec PLUS DAB H2O2 innehåller väteperoxid (< 1 %) i en fosfatbuffertlösning. REKONSTITUERING, BLANDNING, SPÄDNING, TITRERING CINtec PLUS Cytology Kit är optimerat för användning på VENTANA BenchMark GX-, XToch ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning. Ingen rekonstituering, blandning, spädning eller titrering av kitreagensen krävs. Avvikelser från de rekommenderade procedurerna för fixering och ytterligare bearbetning av cervikala cytologiska prover kan leda till stora variationer i resultatet, vilket kräver regelbundna egna kontroller. I avsnittet Kvalitetskontroll finns mer information om kontroller. MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Nedanstående reagens och material krävs för färgning, men medföljer inte CINtec PLUS Cytology Kit. Eventuellt är inte alla produkter i produktbladet tillgängliga i alla länder. Rådfråga din lokala supportrepresentant. 1. Lämpliga kontroller (valfritt, se avsnittet Kvalitetskontroll) 2. Hematoxylin-kontrastfärg 3. Bluing Reagent 4. Reaction Buffer Concentrate (10X) 5. Cell Conditioning Solutions (CC1/ULTRA CC1) 6. Cell Conditioning Solutions (CC2/ULTRA CC2), används inte men krävs på instrumentet 7. EZ Prep Concentrate (10X), används inte men krävs på instrumentet 8. SSC Concentrate (10X), används inte men krävs på instrumentet 9. Liquid Coverslip (LCS/ ULTRA LCS) 10. Denaturerad etanol av reagenskvalitet (renhet 95 %) 11. VENTANA BenchMark GX-, XT- eller ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning 12. SuperFrost PLUS-objektglas för mikroskop (Thermo Fisher Scientific) för vanliga utstryk rekommenderas 13. ThinPrep Arcless-mikroskopobjektglas eller ThinPrep -mikroskopobjektglas FOR SPECIAL PROCESSING (Hologic-beställningsnummer ) 14. BD SurePath PreCoat-objektglas (medföljer SurePath GYN Kit) 15. CC/Mount vattenlösligt monteringsmedel (Diagnostic BioSystems, art.nr K 002, Sigma-Aldrich art.nr C9368) 16. Tillval: Torkugn som kan bibehålla en temperatur på 60 ºC ± 5 ºC 17. Xylen (histologikvalitet) 18. Avjoniserat eller destillerat vatten 19. Täckglas av glas och xylenbaserat monteringsmedel eller täckglas av plastfilm som täcker cytologipreparaten 20. Ljusmikroskop 21. Milt diskmedel CINtec PLUS Red Naphthol Phosphate innehåller naftolfosfat (< 1 %) med ProClin 300 som konserveringsmedel. CINtec PLUS Fast Red innehåller Fast Red (< 1 %) i en acetatbuffert med ProClin 300 som konserveringsmedel / SV Rev D

3 FÖRVARING Förvaras vid 2 8 C. Får inte frysas. Detta reagenskit kan användas så snart det har tagits ut ur kylskåpet. För att garantera rätt reagensleverans och reagensens stabilitet måste locket efter varje körning sättas på igen på n som omedelbart ska placeras i kylskåp i upprätt läge. Det finns ett utgångsdatum på CINtec PLUS Cytology Kit. Vid korrekt förvaring är reagensen stabila till det datum som anges på etiketten. Använd inte produkten efter utgångsdatumet för föreskriven förvaringsmetod. Det finns inga uppenbara tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför bör en positiv kontroll köras samtidigt med okända prover. Kontakta omedelbart din lokala supportrepresentant om det finns tecken på reagensinstabilitet. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER 1. För in vitro-diagnostisk (IVD) användning. 2. Endast för yrkesbruk. 3. Använd inte produkten om förpackningen eller någon av komponenterna har skadats. Om förpackningen eller komponenterna är skadade ska du omedelbart informera din lokala supportrepresentant. 4. Reagensen har blivit optimalt spädda och ytterligare spädning kan resultera i utebliven antigenfärgning. Användaren måste bekräfta alla sådana förändringar. 5. ProClin 300 används som ett konserveringsmedel. Det har klassificerats som ett retande ämne och kan orsaka sensibilisering genom hudkontakt. Iaktta lämpliga försiktighetsåtgärder vid hantering. Undvik reagenskontakt med ögon, hud och slemhinnor. Använd skyddskläder och handskar. I avsnittet Medföljande reagens finns en lista över dispensrar som innehåller detta konserveringsmedel. 6. Material av humant eller animaliskt ursprung ska hanteras som biologiskt riskavfall och omhändertas i enlighet med tillämpliga försiktighetsåtgärder. 7. Vidta rimliga försiktighetsåtgärder vid hantering av reagens. Undvik reagenskontakt med ögon, hud och slemhinnor. Undvik att andas in reagens. Använd engångshandskar och lämpliga skyddskläder vid hantering av misstänkta carcinogener eller giftiga material. Om reagens kommer i kontakt med känsliga områden ska dessa sköljas med rikliga mängder vatten. 8. Undvik mikrobiell kontaminering av reagens eftersom det kan orsaka felaktiga resultat. 9. Kontakta lokala och/eller statliga myndigheter angående rekommenderad metod för avfallshantering. 10. Det finns ytterligare säkerhetsinformation i produktens säkerhetsdatablad och i symbol- och riskinformationen på Vid hantering och kassering av cytologiska prover, inklusive alla prover före och efter fixering, såväl som material som exponeras för dessa, ska försiktighetsåtgärder för hantering av potentiellt smittsamt material följas. Tillämpliga krav för kassering måste också följas. PROVBEREDNING Cytologiska prover måste hanteras korrekt för att bevaras för immuncytokemiska procedurer. Alla prover bör hanteras enligt gängse metoder för cellbearbetning. Kliniker bör följa de provtagningsmetoder som rekommenderas för att undvika skymmande element som blod och slem samt för att säkerställa att provet anses vara lämpligt enligt riktlinjerna från Bethesda [22;23]. Följande beredningsmetoder för objektglas är lämpliga att använda med CINtec PLUS Cytology Kit: ThinPrep -objektglas (från Hologic Inc.) som har beretts på en ThinPrep 2000 eller 5000 Processor (Hologic Inc.) med ThinPrep Arcless-mikroskopobjektglas eller ThinPrep -mikroskopobjektglas FOR SPECIAL PROCESSING (Hologic, beställningsnummer ) enligt tillverkarens rekommendation. BD SurePath -objektglas (BD Diagnostics Tripath) som har beretts enligt tillverkarens rekommendation. Manuellt beredda objektglas (objektglas för vanliga utstryk). Du rekommenderas att köra lämpliga kontroller samtidigt med patientprover (mer information finns i avsnittet Kvalitetskontroll). Provberedning med ThinPrep Cytologiprov i PreservCyt -lösning som är avsett för immuncytokemi-färgning med CINtec PLUS Cytology Kit kan förvaras i 4 30 C och testas inom 6 veckor efter provtagning. ThinPrep Arcless-mikroskopobjektglas eller ThinPrep -mikroskopobjektglas FOR SPECIAL PROCESSING (Hologic-beställningsnummer ) krävs för immuncytokemisk färgning med CINtec PLUS Cytology Kit på VENTANA Benchmark GX-, XT- och ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning. Provberedning med ThinPrep på ThinPrep 2000 Processor ThinPrep -objektglas (från Hologic Inc.) bereds på en ThinPrep 2000 Processor (Hologic Inc.) enligt tillverkarens instruktioner. Efter att ThinPrep 2000 Processorsekvensen har slutförts sitter det bearbetade objektglaset i en fixeringsflaska som innehåller etanollösning av reagenskvalitet ( 95 %). Ta försiktigt bort flaskan från fixeringsbadhållaren på ThinPrep 2000 Processor och överför det bearbetade objektglaset från flaskan till en objektglasbehållare som innehåller etanollösning av reagenskvalitet ( 95 %). Inkubera objektglaset i etanol i minst 15 minuter och högst 60 minuter. Byt etanollösning i fixeringsflaskan och objektglasbehållaren varje gång 20 objektglas har beretts. När inkubationstiden är slut tar du ut objektglaset ur etanolbehållaren och låter objektglaset torka vågrätt på en plan yta i minst 60 minuter. Torkade objektglas kan förvaras i rumstemperatur i skydd mot ljus och måste färgas med CINtec PLUS Cytology Kit inom 3 dagar efter beredningen. Provberedning med ThinPrep på ThinPrep 5000 Processor ThinPrep -objektglas (från Hologic Inc.) bereds på en ThinPrep 5000 Processor (Hologic Inc.) enligt tillverkarens instruktioner. Efter att ThinPrep 5000 Processorsekvensen har slutförts sitter de bearbetade objektglasen i ett objektglasställ som sänks ned i etanollösning av reagenskvalitet ( 95 %) som omfattar fixeringsbad. Ta försiktigt bort fixeringsbadet från ThinPrep 5000 Processor och inkubera objektglasen i ytterligare minst 15 minuter och högst 60 minuter. Byt etanollösningen i fixeringsflaskan och objektglasbehållaren efter varje körning. När inkubationstiden är slut tar du ut objektglasen ur etanolbehållaren och låter dem torka vågrätt på en plan yta i minst 60 minuter. Torkade objektglas kan förvaras i rumstemperatur i skydd mot ljus och måste färgas med CINtec PLUS Cytology Kit inom 3 dagar efter beredningen. Innan immuncytokemisk färgning med CINtec PLUS Cytology Kit utförs ska du ta bort den ursprungliga objektglasetiketten som används av ThinPrep 5000 Processor och i stället applicera motsvarande etikett som genererats av VENTANA BenchMark GX-, XT- eller BenchMark ULTRA-enheten för automatiserad objektglasfärgning. Provberedning med BD SurePath Cytologiprov i SurePath -konserveringsvätska som är avsett för immuncytokemi-färgning med CINtec PLUS Cytology Kit kan förvaras i upp till 4 veckor vid rumstemperatur (15 30 C) eller i 6 månader i kylskåp vid 2 10 C. Provberedning med BD SurePath omedelbart efter bearbetning av ett Pap-objektglas När en anrikad cellpellet har skapats för att bereda ett objektglas för Pap-färgning kan den användas omedelbart för att bereda ytterligare ett objektglas som ska färgas med CINtec PLUS Cytology Kit. Följ tillverkarens rekommendation för att använda objektglasberedning [alternativ 2] för GYN-prover på PrepStain -instrumentet. Återsuspensionvolymen ska ändras till 0 ml i menyalternativet Ändra prov-/färgningsparametrar. Provberedning med BD SurePath från en konserverad cellpellet Anrikade cellpelletar kan konserveras genom att cirka 2 ml SurePath konserveringsvätska tillsätts och provrören försluts för förvaring (mer information finns i tillverkarens instruktioner). Cellpelletar som har återsuspenderats i konserveringsvätska kan förvaras i upp till 4 veckor efter provtagning vid rumstemperatur (15 30 C) eller i 6 månader i kylskåp vid 2 10 C. Om ett objektglas ska beredas för CINtec PLUS Cytology Kit måste provet först stå i 60 minuter för att anta rumstemperatur. Börja med det andra centrifugeringssteget i GYN-anrikningsprocessen och följ de återstående förbearbetningsstegen enligt tillverkarens instruktioner för bearbetning av konserverade cellpelletar. Följ tillverkarens rekommendation för att använda objektglasberedning [alternativ 2] för GYN-prover på PrepStain -instrumentet. För alla beredningsalternativ som anges ovan gäller att objektglasstället ska tas bort från PrepStain -instrumentet när provöverföringssteget har slutförts. Vänd på stället så att vätskan dekanteras. Pipettera 2 ml etanollösning av reagenskvalitet ( 95 %) i varje kammare och dekantera omedelbart. Skölj med 2 ml etanollösning av reagenskvalitet ( 95 %) en andra gång och inkubera i 10 minuter. Dekantera en andra gång genom att vända på stället. Ta bort kamrarna från objektglasen och låt objektglasen torka horisontellt på en plan yta i minst 60 minuter. Torkade objektglas kan förvaras i rumstemperatur i skydd mot ljus och måste färgas med CINtec PLUS Cytology Kit inom 3 dagar efter beredningen / SV Rev D

4 Beredning av vanligt utstryk Vanliga utstryk ska fixeras med ett cytologiskt sprejfixeringsreagens som innehåller polyetylenglykol (t.ex. Safetex Cytology Fixative, Andwin Scientific) omedelbart efter provinsamling. Sprejfixerade objektglas för vanliga utstryk kan förvaras i rumstemperatur i skydd mot ljus och måste färgas med CINtec PLUS Cytology Kit inom 7 dagar efter beredningen. Det krävs ingen ytterligare förbearbetning innan objektglasen laddas på VENTANA BenchMark GX-, XT- och ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning. FÄRGNINGSPROCEDUR CINtec PLUS Cytology Kit har utvecklats för att användas med VENTANA BenchMark GX-, XT- och ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning tillsammans med hjälpreagens och tillbehör från VENTANA. Tabell 1, 2 och 3 innehåller rekommendationer om färgningsprotokoll. CINtec PLUS Cytology Kit har optimerats med de parametrar som anges i tabell 1, 2 och 3 men användaren måste ändå validera de resultat som erhållits med kittet. Parametrarna för de automatiserade protokollen kan visas, skrivas ut och redigeras enligt instruktionerna i användarhandboken till respektive instrument. Tabell 2. Rekommenderat färgningsprotokoll för ThinPrep - och SurePath -objektglas samt objektglas för vanliga utstryk på VENTANA BenchMark XT-enheten för automatiserad objektglasfärgning med Hematoxylin (art.nr ) och Bluing Reagent (art.nr ). Färgningsprocedur Valbara alternativ XT CINtec PLUS Cytology Provberedningstyp ThinPrep SurePath Vanlig ThinPrep Vald Inte vald Inte vald SurePath Inte vald Vald Inte vald Annat Inte vald Inte vald Vald Cellkonditioneringsalternativ Kan inte väljas Kan inte väljas 16 min Ink.tid för antikropp 16 min 20 min 16 min Ink.tid för HQ Linker 12 min 16 min 12 min Tabell 1. Rekommenderat färgningsprotokoll för ThinPrep - och SurePath -objektglas samt objektglas för vanliga utstryk på VENTANA BenchMark GX-enheten för automatiserad objektglasfärgning med Hematoxylin (art.nr ) och Bluing Reagent (art.nr ). Färgningsprocedur Valbara alternativ GX CINtec PLUS Cytology Provberedningstyp ThinPrep SurePath Vanlig ThinPrep Vald Inte vald Inte vald SurePath Inte vald Vald Inte vald Annat Inte vald Inte vald Vald Cellkonditioneringsalternativ Kan inte väljas Kan inte väljas 16 min Ink.tid för antikropp 16 min 20 min 16 min Ink.tid för HQ Linker 12 min 16 min 12 min Ink.tid för HRP Multimer Inc 6 min 8 min 8 min Ink.tid för NP Linker 8 min 16 min 8 min Ink.tid för AP Multimer 8 min 8 min 8 min Kontrastfärgning Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Kontrastfärgning Bluing 4 min Bluing 4 min Bluing 4 min Ink.tid för HRP Multimer Inc 8 min 8 min 8 min Ink.tid för NP Linker 8 min 16 min 8 min Ink.tid för AP Multimer 8 min 8 min 8 min Kontrastfärgning Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Kontrastfärgning Bluing 4 min Bluing 4 min Bluing 4 min Tabell 3. Rekommenderat färgningsprotokoll för ThinPrep - och SurePath -objektglas samt objektglas för vanliga utstryk på VENTANA BenchMark ULTRA-enheten för automatiserad objektglasfärgning med Hematoxylin (art.nr ) och Bluing Reagent (art.nr ). Färgningsprocedur Valbara alternativ U CINtec PLUS Cytology Provberedningstyp ThinPrep SurePath Vanlig ThinPrep Vald Inte vald Inte vald SurePath Inte vald Vald Inte vald Annat Inte vald Inte vald Vald Cellkonditioneringsalternativ Kan inte väljas Kan inte väljas 16 min Ink.tid för antikropp 16 min 16 min 16 min Ink.tid för HQ Linker 12 min 16 min 12 min Ink.tid för HRP Multimer Inc 8 min 8 min 8 min Ink.tid för NP Linker 8 min 16 min 8 min Ink.tid för AP Multimer 8 min 8 min 8 min Kontrastfärgning Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Hematoxylin 4 min Kontrastfärgning Bluing 4 min Bluing 4 min Bluing 4 min / SV Rev D

5 Användning av BenchMark GX-, XT- och ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning 1. Sätt på en streckkodsetikett som motsvarar det protokoll som ska utföras. 2. Ladda dispensrarna för CINtec PLUS Cytology Kit och nödvändiga hjälpreagens på reagensbrickan och placera dem på enheten för automatiserad objektglasfärgning. 3. Kontrollera bulkvätskorna och töm avfallet. 4. Ladda objektglasen på enheten för automatiserad objektglasfärgning. 5. Starta färgningskörningen. 6. Ta bort objektglasen från enheten för automatiserad objektglasfärgning när körningen är klar. EFTERBEARBETNING MONTERING OCH TÄCKGLAS Det krävs två monteringssteg för att bibehålla optimal känslighet och förhindra att kromogener bleks. Ta bort objektglasen från VENTANA BenchMark GX-, XT- eller ULTRA-enheten för automatiserad objektglasfärgning och skaka varsamt objektglasen och skölj dem i kranvatten, avjoniserat vatten eller destillerat vatten och ett milt diskmedel tills Liquid Coverslip har avlägsnats helt från objektglasen. OBS! Undvik en hård vattenstråle direkt mot objektglasen. Spola vattnet med minimal stråle. Objektglasen monteras enligt ett tvåstegsprotokoll. Följande steg måste utföras i ordning: 1. Vattenlösligt monteringsmedel: Inkubera objektglasen i destillerat eller avjoniserat vatten i minst 1 minut. Objektglas som inte förses med täckglas ska vara kvar i destillerat eller avjoniserat vatten medan det vattenlösliga monteringsmedlet CC/Mount appliceras på de andra objektglasen. Ta upp det enskilda objektglaset ur det destillerade eller avjoniserade vattnet och torka försiktigt bort överflödigt vatten från objektglasets baksida med en pappershandduk. Låt inte vatten rinna av och torka inte heller bort vatten från objektglasens framsida (provsidan). Håll objektglaset lätt vinklat och applicera 4 6 droppar vattenlösligt CC/Mount -monteringsmedel (Diagnostic BioSystems art.nr K 002, Sigma- Aldrich art.nr C9368) per ThinPrep - eller SurePath -objektglas och 8 droppar per objektglas för vanliga utstryk. Undvik att luftbubblor bildas. Det gör du genom att hälla av första droppen på en pappershandduk innan CC/Mount appliceras på objektglasets provberedningsyta. Luta och rotera försiktigt objektglaset för att skapa ett tunt skikt monteringsmedel som helt täcker provberedningsytan (applicera inte glaseller filmtäckglas än!). Kontrollera fördelningen av monteringsmedlet på objektglaset genom visuell inspektion. Torka bort överflödigt vattenlösligt CC/Mount -monteringsmedel från objektglasets baksida och kanter. Använd vid behov en fuktad pappershandduk. Vid torkning ska objektglasen placeras i vågrätt läge: a) Inkubera ThinPrep - eller SurePath -objektglas i C i 1 timme eller alternativt över natten i rumstemperatur. b) Inkubera objektglas för vanliga utstryk i 37 C i 4 timmar eller i 60 C i 1 timme, eller alternativt över natten i rumstemperatur. 2. Täckglas av glas eller film: När det vattenlösliga CC/Mount -monteringsmedlet har torkat helt ska du i förekommande fall låta objektglasen anta rumstemperatur. Inkubera objektglasen i xylen i minst 1 minut och högst 20 minuter. Sätt sedan täckglas av glas på objektglasen med ett xylenbaserat monteringsmedel eller använd en xylenbaserad metod med täckglas av plastfilm. OBS! Objektglasen får inte dehydreras med en stigande alkoholserie innan de förses med täckglas av glas eller film. Torka det xylenbaserade monteringsmedlet i rumstemperatur. OBS! För att minimera blekning ska objektglasen skyddas mot ljus och förvaras i rumstemperatur. KVALITETSKONTROLL Avvikelser från de rekommenderade procedurerna för fixering och ytterligare bearbetning av cervikala cytologiska prover kan leda till stora variationer i resultatet. Det förekommer inga tydliga tecken när det är fel på produkten på grund av hanteringsproblem eller instabilitet. Därför bör lämpliga kontroller köras samtidigt med patientprover. Positiv kontroll Prover som bearbetas på samma sätt som patientprover ska användas som positiva kontroller. Positiva kontroller indikerar att proverna är korrekt beredda och att lämpliga färgningsmetoder har använts. En positiv kontroll ska inkluderas i varje färgningskörning. Känt positiva vävnadskontroller får endast användas för att kontrollera korrekt funktion hos bearbetade prover och testreagens, inte som ett hjälpmedel för att ställa en specifik diagnos på patientprover. Om positiva kontroller inte uppvisar positiv färgning ska testprovresultaten anses ogiltiga. Negativ kontroll Många olika celltyper som finns i representativa cervikala cytologiprover och är bekräftat negativa för uttrycket av p16 INK4a - och Ki-67-antigener (t.ex. ytliga celler) kan fungera som en intern negativ kontroll för att utvärdera bakgrundsfärgning. Analysverifiering Användaren bör verifiera prestandan hos CINtec PLUS Cytology Kit på positiva och negativa prover med kända prestandaegenskaper innan det används för första gången i en diagnostisk procedur. TOLKNING AV FÄRGNINGSRESULTAT/FÖRVÄNTADE RESULTAT Vid färgning med CINtec PLUS Cytology Kit skapas två olikfärgade reaktionsprodukter: en brun fällning på p16 INK4a -antigenplatserna och en röd fällning på Ki-67-antigenplatserna. Brun färgning av celler (cytoplasma och/eller kärnor) indikerar överuttryck av p16 INK4a. Röd färgning av celler (kärnor) indikerar uttryck av Ki-67. Celler som uppvisar färgning för båda antigenerna uppvisar brun cytoplasmisk färgning där röda kärnor vanligen är mycket tydliga. En kvalificerad patolog/cytolog med erfarenhet av immuncytokemiska procedurer och utbildning i tolkningen av objektglas som färgats med CINtec PLUS Cytology Kit ska utvärdera kontrollerna (om sådana används) innan resultaten tolkas. Tolkning av testresultat får endast utföras av certifierad personal där hänsyn tas till patientens kliniska anamnes och ytterligare diagnostik. För tolkning av objektglas med cervikala cytologiprover som färgats med CINtec PLUS Cytology Kit ska objektglasen utvärderas med avseende på förekomsten av cervikala epitelceller som uppvisar både cytoplasmisk brun och nukleär röd färgning som tyder på samtidigt uttryck av p16 INK4a och Ki-67. Dessutom ska, liksom vid rapportering av Papcytologiresultat, prover bedömas för noggrannhet enligt riktlinjerna från Bethesda 2001 (eller TBS) [23] när CINtec PLUS Cytology-testresultat rapporteras. Positivt testresultat Förekomsten av en eller flera cervikala epitelceller med samlokalisering av specifik brun cytoplasmisk immunfärgning och specifik röd nukleär immunfärgning i samma cell anses vara ett positivt CINtec PLUS Cytology-testresultat. Negativt testresultat Om inga cervikala epitelceller uppvisar samtidig brun cytoplasmisk immunfärgning och röd nukleär immunfärgning anses CINtec PLUS Cytology-testresultatet vara negativt. Förekomst av cervikala epitelceller, som uppvisar immunreaktivitet för bara den ena men inte båda markörerna (t.ex. brun färgning endast för p16 INK4a eller röd färgning endast för Ki-67), anses inte vara ett positivt testresultat för CINtec PLUS Cytology Kit. BEGRÄNSNINGAR 1. Endast för yrkesbruk. Särskild utbildning krävs för utförande av immuncytokemiska procedurer. 2. Utvärdering av mikroskopobjektglas som färgats med CINtec PLUS Cytology Kit får endast utföras av certifierad personal som har utbildning i hur sådana testresultat tolkas. 3. Den kliniska tolkningen av en positiv eller negativ färgning ska utvärderas utifrån kliniska omständigheter och cytologiska kriterier. 4. Tolkningen av resultaten av färgningen med CINtec PLUS Cytology Kit beror på hematoxylin-kontrastfärgningens intensitet och kvalitet. Avvikelse från de reagens och inkubationstider som rekommenderas måste valideras av kunden eftersom för mycket eller för lite kontrastfärgning kan försämra tolkningen av resultatet / SV Rev D

6 5. Objektglas för vanliga utstryk som är avsedda att användas för färgning med CINtec PLUS Cytology Kit ska beredas med hjälp av SuperFrost PLUS-objektglas för mikroskop (Thermo Fisher Scientific) och Safetex Cytology Fixative (Andwin Scientific), ett cytologiskt sprejfixeringsreagens som innehåller polyetylenglykol. Avvikelse från detta måste valideras av kunden. 6. Du rekommenderas att inte använda ThinPrep 3000 Processor för beredning av ThinPrep -prover eftersom sprejfixeringsproceduren som utförs av instrumentet kan leda till betydande cellförlust när beredda objektglas färgas med CINtec PLUS Cytology Kit. 7. ThinPrep Arcless-mikroskopobjektglas eller ThinPrep -mikroskopobjektglas FOR SPECIAL PROCESSING (Hologic-beställningsnummer ) krävs för beredning av ThinPrep -prover för immuncytokemisk färgning med CINtec PLUS Cytology Kit på VENTANA BenchMark GX-, XT- och ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning. ThinPrep -objektglas för mikroskop med ett märkt screeningområde kan leda till inkonsekventa färgningsresultat. 8. Tillverkaren tillhandahåller dessa antikroppar/reagenser i optimal utspädning för användning enligt bruksanvisningen häri, för immuncytokemisk testning på preparerade vätskebaserade cytologiobjektglas (LBC) eller vanliga utstryk. Avvikelser från rekommenderade testprocedurer kan göra det förväntade resultatet ogiltigt. Korrekta kontroller bör därför tillämpas och dokumenteras. Användare som avviker från rekommenderade testprocedurer måste ansvara för tolkningen av patientresultat under sådana omständigheter. FELSÖKNING 1. Om en reagens inte ar vätska ska primningskammaren eller menisken kontrolleras med avseende på främmande material eller partiklar, såsom fibrer eller fällningar. Om n är blockerad ska den inte användas och den lokala supportrepresentanten ska kontaktas. I annat fall ska n flödas om, vilket du gör genom att hålla n över en avfallsbehållare, ta bort munstyckslocket och trycka ned ns överdel. 2. Om den positiva kontrollen uppvisar svagare färgning än väntat ska du kontrollera om det valda protokollet överensstämmer med den specifika provtypen. SurePath -cytologipreparat kräver exempelvis längre tid för cellkonditionering än ThinPrep -objektglas eller vanliga utstrykspreparat. Säkerställ också att alla hylsor är fria från smuts. 3. Om den positiva kontrollen är negativ ska den kontrolleras för att säkerställa att objektglaset har korrekt streckkodsetikett. Om objektglaset har korrekt märkning kontrollerar du att alla hylsor är fria från smuts. 4. Om stark bakgrundsfärgning observeras ska du minska inkubationstiderna i färgningsprotokollen. Kontrollera dessutom att bulklösningen med reaktionsbuffert har formulerats korrekt. 5. Om svag bakgrundsfärgning observeras ska du öka inkubationstiderna i färgningsprotokollen. På objektglas för vanliga utstryk kan också inkubationstiden för cellkonditionering justeras. 6. Den röda fällning som används för att indikera Ki-67-proteinuttryck är löslig i alkohol. Om Ki67-färgning är svag eller inte förekommer ska du säkerställa att du inte har använt hematoxylin som innehåller alkohol och att du har följt den efterbearbetningsprocedur som rekommenderas enligt anvisningarna i Efterbearbetning montering och täckglas. 7. Om provet sköljs av från objektglaset bör du kontrollera objektglasen för att säkerställa att provet har beretts korrekt enligt anvisningarna i avsnittet Provberedning och att den rekommenderade mikroskopobjektglastypen har använts. 8. Se avsnittet Färgningsprocedur eller instrumentets användarhandbok för korrigeringsåtgärder, eller kontakta din lokala supportrepresentant. PRESTANDAEGENSKAPER Prestandan hos CINtec PLUS Cytology Kit har utvärderats genom analytisk specificitet, reproducerbarhet och överensstämmelsestudier enligt beskrivningen i nedanstående avsnitt. Analytisk specificitet Den analytiska specificiteten för CINtec PLUS Cytology Kit utvärderades genom inhibering av de primära antikroppsklonerna E6H4 och AC3 med motsvarande epitopspecifika peptider. Vätskebaserade cytologiobjektglas (LBC) från en cellinje med överuttryck för båda antigenerna användes för att bedöma effekten av specifik peptidinhibering på färgningsprestandan för båda antikropparna. Bindning av antikropparna till deras epitopspecifika peptider resulterade i inhibering av antikropparna, vilket upptäcktes genom minskad färgning jämfört med en kontroll utan peptider. Dessutom inhiberades ingendera antikropp av den andra antikroppens epitopspecifika peptid, vilket visar att icke-specifika peptider inte inhiberar dessa antikroppar. Reproducerbarhet Reproducerbarhetsstudier för CINtec PLUS Cytology Kit utfördes för att påvisa: reproducerbarhet mellan olika partier av CINtec PLUS Cytology Kit reproducerbarhet inom och mellan körningar på VENTANA BenchMark GX-, XToch ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning reproducerbarhet inom plattformar på VENTANA BenchMark GX-, XT- och ULTRAenheter för automatiserad objektglasfärgning reproducerbarhet mellan plattformar mellan VENTANA BenchMark GX-, XT- och ULTRA-enheterna för automatiserad objektglasfärgning. Alla studier uppfyllde de förbestämda acceptanskriterierna. Överensstämmelsestudier Prestandan för CINtec PLUS Cytology Kit för användning med VENTANA BenchMark GX-, XT- och ULTRA-enheter för automatiserad objektglasfärgning utvärderades i förhållande till Roche mtm CINtec PLUS Kit (jämförelseprodukt, Roche mtm laboratories AG, Mannheim) vilket tidigare har uppvisat hög känslighet och specificitet för förekomsten av precancerös och cancerös sjukdom i cervikala cytologiprover avseende förekomsten av enskilda cervikala epitelceller som visar ett positivt tvåfärgat resultat för p16 INK4a och Ki-67 [14;15;16;17;18;19;20;21]. Överensstämmelsestudier har utförts på patientprover från avsedd patientpopulation med Pap-cytologiresultaten NILM (negativt för intraepitellesion eller -malignitet), ASC-US, LSIL och HSIL för var och en av beredningsmetoderna för cervikala cytologipreparat: ThinPrep (Hologic Inc.), BD SurePath (BD Diagnostics Tripath) och objektglas för vanliga utstryk. För LBC-prover bereddes två objektglas från varje patientprov. När det gäller vanliga utstryk skapades två objektglas, från samma patient vid samma besök, genom att det provtagna materialet delades upp på två objektglas (metod med delat prov). Ett objektglas testades med CINtec PLUS Cytology Kit på en VENTANA BenchMark-enhet för automatiserad objektglasfärgning och ett objektglas färgades med jämförelseprodukten. Avläsningsalgoritm för LBC-prover: Varje objektglas avlästes av två kvalificerade avläsare. I de fall avläsarna var överens om resultatet betraktades detta som det slutliga resultatet för objektglaset. I de fall avläsarna inte var överens om resultatet utfördes en prövning av en tredje avläsare. Resultatet med flest röster blev då det slutliga resultatet för objektglaset. Avläsningsalgoritm för objektglas för vanliga utstryk: Varje objektglas avlästes av två kvalificerade avläsare. Om båda avläsarna poängsatte objektglaset som positivt blev också det slutliga resultatet för objektglaset positivt. I de fall avläsarna inte var överens om resultatet granskades objektglaset av en panel med tre avläsare i syfte att nå konsensus. Resultatet av granskningen blev då det slutliga resultatet för objektglaset. I de fall båda avläsarna poängsatte objektglaset som negativt kontrollerades objektglaset av en tredje avläsare, i syfte att bekräfta det negativa resultatet. I de fall den tredje avläsaren bekräftade det negativa resultatet blev det slutliga resultatet för objektglaset negativt. I de fall den tredje avläsaren bedömde resultatet som positivt skickades objektglaset till en panel i syfte att nå konsensus. Resultatet därav blev det slutliga resultatet för objektglaset. Överensstämmelse mellan testresultaten rapporteras som positiv överensstämmelse i procent (PPA) och negativ överensstämmelse i procent (NPA) mellan CINtec PLUS Cytology Kit för användning på en VENTANA BenchMark-enhet för automatiserad objektglasfärgning och jämförelseprodukten / SV Rev D

7 Tabell 4. Överensstämmelse mellan testresultaten för CINtec PLUS Cytology Kit och för jämförelseprodukten vad avser preparat på ThinPrep -objektglas för cervikal cytologi. CINtec PLUS Cytology Kit (n) Jämförelseprodukt (N) Totalt PPA (n/n) (95 % konfidensintervall) = 140/157 x 100 % = 89,2 % (83,3-93,1 %) NPA (n/n) (95 % konfidensintervall) = 147/172 x 100 % = 85,5 % (79,4 90,0 %) Tabell 5. Överensstämmelse mellan testresultaten för CINtec PLUS Cytology Kit och för jämförelseprodukten vad avser preparat på SurePath -objektglas för cervikal cytologi. CINtec PLUS Cytology Kit (n) Jämförelseprodukt (N) Totalt PPA (n/n) (95 % konfidensintervall) = 56/65 x 100 % = 86,2 % (75,7 92,5 %) NPA (n/n) (95 % konfidensintervall) = 108/111 x 100 % = 97,3 % (92,4 99,1 %) Tabell 6. Överensstämmelse mellan testresultat för CINtec PLUS Cytology Kit och för jämförelseprodukten vad avser preparat på objektglas för cervikal cytologi med vanliga utstryk. CINtec PLUS Cytology Kit (n) Jämförelseprodukt (N) Totalt PPA (n/n) (95 % konfidensintervall) = 98/118 x 100 % = 83,1 % (75,3-88,8 %) NPA (n/n) (95 % konfidensintervall) = 72/89 x 100 % = 80,9 % (71,5-87,7 %) REFERENSER 1. Wentzensen N, von Knebel Doeberitz M. Biomarkers in cervical cancer screening. Dis Markers. 2007;23: Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 2000;182: Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, et al. Overexpression of p16 INK4a as a specific marker for dysplasia and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer 2001;92: Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, et al. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. Am J Pathol. 1998;153: Cuschieri K, Wentzensen N. Human papillomavirus mrna and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17: Bergeron C, Ordi J, Schmidt D, et al. Conjunctive p16 INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2010;133: Del Pino M, Garcia S, Fusté V, et al. Value of p16 INK4a as a marker of progression/ regression in cervical intraepithelial neoplasia grade 1. Am J Obstet Gynecol. 2009; 201(5): Ordi J, Garcia S, del Pino M, et al. p16 INK4a immunostaining identifies occult CIN lesions in HPV-positive women. Int J Gynecol Pathol. 2008;28: Wang SS, Trunk M, Schiffman M, et al. Validation of p16 INK4a as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a populationbased cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004;13: Galgano MT, Castle PE, Atkins KA, et al. Using biomarkers as objective standards in the diagnosis of cervical biopsies. Am J Surg Pathol. 2010;8: Carozzi F, Confortini M, Dalla Palma P, et al. Use of p16 INK4a over-expression to increase the specificity of human papillomavirus testing: a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2008;9: Denton K, Bergeron C, Klement P, et al. The sensitivity and specificity of p16 INK4a Cytology versus HPV Testing for Detecting High-Grade Cervical Disease in the Triage of ASC-US and LSIL Pap Cytology Results. Am J Clin Pathol. 2010;134: Carozzi F, Gillio-Tos A, Confortini M, et al. Risk of high-grade cervical intraepithelial neoplasia during follow-up in HPV-positive women according to baseline p16- INK4a results: a prospective analysis of a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2013;14(2): Ikenberg H, Bergeron C, Schmidt D, et al., PALMS study group (2013). Screening for Cervical Cancer Precursors with p16/ki-67 Dual-stained Cytology: Results of the PALMS Study. J Natl Cancer Inst. 2013;105(20): Schmidt D, Bergeron C, Denton KJ, et al. p16/ki-67 Dual-stain cytology in the triage of ASCUS and LSIL Papanicolaou cytology: Results from the European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study (EEMAPS). Cancer Cytopathol. 2011;119(3): Petry KU, Schmidt D, Scherbring S, et al. Triaging Pap cytology negative, HPV positive cervical cancer screening results with p16/ki-67 Dual-stained cytology. Gynecol Oncol. 2011;121(3): Ravarino A, Nemolato S, Macciocu E, et al. CINtec PLUS immunocytochemistry as a tool for the cytologic diagnosis of glandular lesions of the cervix uteri. Am J Clin Pathol. 2012;138(5): Singh M, Mockler D, Akalin A, et al. Immunocytochemical colocalization of p16( INK4a ) and Ki-67 predicts CIN2/3 and AIS/adenocarcinoma. Cancer Cytopathol. 2012;120(1): Waldstrøm M, Christensen RK, Ornskov D. Evaluation of p16 INK4a /Ki-67 dual stain in comparison with an mrna human papillomavirus test on liquid-based cytology samples with low-grade squamous intraepithelial lesion. Cancer Cytopathol. 2013;121(3): Wentzensen N, Schwartz L, Zuna RE, et al. Performance of p16/ki-67 immunostaining to detect cervical cancer precursors in a colposcopy referral population. Clin Cancer Res. 2012;18(15): Killeen JL, Dye T, Grace C, et al. Improved Abnormal Pap Smear Triage Using Cervical Cancer Biomarkers. J Low Genit Tract Dis Jun 11. [Epub ahead of print] 22. Birdsong G., Husain M., Faison T, et al. Cervicovaginal Cytology Based on the Papanicolaou Technique; Approved Guideline- Third Edition. CLSI document GP15- A3. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; Solomon D, Davey D, Kurman R, et al. The 2001 Bethesda system. Terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA. 2002;287: IMMATERIELL EGENDOM BENCHMARK, CINtec, VENTANA och logotypen VENTANA är varumärken som tillhör Roche. Alla andra varumärken tillhör respektive ägare Ventana Medical Systems, Inc. KONTAKTINFORMATION Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D Mannheim Germany / SV Rev D