Microdissection of well defined cell populations for RNA isolation in the analysis of normal human skin and basal cell carcinoma

Transkript

1 Examensarbete 10 poäng C-nivå Biomedicinska analytikerprogrammet Microdissection of well defined cell populations for RNA isolation in the analysis of normal human skin and basal cell carcinoma Karolina Edlund Handledare: Anna Asplund Institutionen för Genetik och Patologi Uppsala Universitet

2 ABSTRACT The human skin provides us with an excellent protective barrier and possesses a remarkable ability of constant renewal. Basal cell carcinoma is the most common type of skin cancer. The aim of this project was to verify results from an earlier study investigating the molecular differences between basal cell carcinoma (BCC) and basal cells of normal human epidermis. In that study microdissection of cell populations from BCC and basal cells of normal epidermis respectively was performed in five cases of confirmed BCC. Following RNA extraction and amplification, a gene expression analysis was performed using a 46 k human cdna microarray. Comparison of expression profiles showed a differential expression of approximately 300 genes in BCC. An upregulation of signaling pathways previously known to be of importance in BCC development could be observed, as well as a downregulation of differentiation markers, MHC class II molecules, and proteins active in scavenging of oxygen radicals. We wanted to confirm these findings for a number of selected genes, using real time PCR. The focal point of this project was microdissection of cells from BCC and subsequent isolation of RNA. Microdissection based methods offer a possibility of selecting well defined cell populations for further analysis by using a focused laser beam. Initially tests in order to optimize the method were also performed, concerning the dehydration process and choice of slides used in microdissection. Isolation of RNA may, as we experienced, be associated with problems due to destruction of RNA by degrading enzymes. KEYWORDS Skin, epidermis, basal cell carcinoma, microdissection, RNA extraction 2

3 INTRODUKTION Hos en vuxen människa utgör huden ungefär 16% av kroppsvikten och täcker en kroppsyta som kan uppnå två kvadratmeter. Huden är ett av kroppens största organ och har många viktiga funktioner. Den bildar en barriär mot omgivningen som skyddar kroppens inre miljö mot skadlig påverkan från yttervärlden. Hudbarriären skyddar oss mot uttorkning, infektion, mekanisk skada och UV-strålning. Dessutom är huden är viktig för kroppens temperaturreglering samt syntes av D-vitamin. Receptorer i huden förmedlar sinnesintryck från omgivningen, såsom beröring och smärta, till centrala nervsystemet. Huden är uppbyggt av flera skikt: epidermis, dermis och subcutis. Epidermis (ytterhuden) består av ett flerskiktat förhornat skivepitel, samt tillhörande hårfolliklar, talgkörtlar och svettkörtlar. Det har en tjocklek på 0.1-1mm beroende på vilken kroppsdel det täcker. I epidermis kan flera olika typer av celler urskiljas. Keratinocyter utgör huvuddelen av epidermis. De producerar keratin, som är det huvudsakliga strukturella proteinet i epidermis, samt i hår och naglar. Keratin är mycket motståndskraftigt och skyddar mot både mekanisk och kemisk skada. Melanocyter tillverkar pigmentet melanin som ger oss ett skydd mot solens ultravioletta strålning. Pigmentkorn med melanin produceras i melanocyter och distribueras sedan vidare till keratinocyterna som upptar dessa via endocytos. Langerhans celler har en immunologisk funktion genom att fungera som antigenpresenterande celler. De bildas i benmärgen och transporteras via blodet till huden. Merkelceller är känselceller som reagerar på tryck och står i förbindelse med nervceller. Mellan epidermis och dermis finns ett basalmembran, som består av ett tunt hårt packat lager av proteiner (t. ex. kollagen, proteoglykaner och lamininer). Dermis (läderhuden) är ett 1-2 mm tjockt lager under epidermis och består till största delen av bindväv. Det är uppbyggt av ett nätverk av kollagena och elastiska fibrer med ett fåtal celler, såsom fibroblaster, makrofager och mastceller. Dermis utgör ett strukturellt stöd för epidermis och via dess rika nätverk av blodkärl tillförs huden näring. Genom att reglera blodcirkulationen genom dermis kan kroppen reglera sin temperatur. Subcutis (underhuden), som även kallas hypodermis, består av lucker bindväv och binder huden till underliggande vävnad. I subcutis finns också fettceller i varierande mängd. Denna fettdepå fungerar som en energireserv och isolerar mot stötar och kyla. I underhuden finns också en viktig vätskedepå. Epidermis är uppbyggt av skikt av keratinocyter i olika differentieringsstadier (figur 1). Stratum basale, eller basallagret, är det understa skiktet. Det består av cylindriska celler som 3

4 vilar på ett basalmembran. Cellerna är förankrade i varandra via desmosomer och till basalmembranet via hemidesmosomer. I basallagret sker nybildningen av hudceller. Merkelceller och melanocyter återfinns i epidermis basallager, där de utgör en minoritet av det totala cellantalet. Utanför basallagret ligger stratum spinosum. I detta skikt är cellerna kubiska eller något utplattade. De har en central kärna och en cytoplasma fylld med buntar av keratinfilament. Dessa buntar strålar samman till tagglikande utskott med desmosomer längst ut. Cellerna i detta skikt är starkt bundna till varandra via dessa filamentfyllda cytoplasmatiska utskott och desmosomer. Stratum spinosum är särskilt tjock i områden som utsätts för kraftig nötning, t ex fotsulor och handflator. Langerhanska celler återfinns i stratum spinosum. Stratum granulosum består av mellan tre och fem lager platta celler som är viktiga för hudens barriärfunktion. Cellernas cytoplasma är fylld av icke-membranomslsutna basofila granula, sk keratohyalina granula. En annan struktur som är karaktärisktisk för celler i stratum granulosum, och som endast kan urskiljas i elektronmikroskop, är membranomslutna lamellära granula, som innehåller lipider. Dessa lipider frisätts i utrymmet mellan cellerna, där de fungerar som en slags cement och bildar en barriär. Stratum lucidum är ett skikt som är synbart främst i tjock hud. Det består av ett tunt genomskinligt lager av platta celler utan cellkärna och organeller. Stratum corneum, eller hornlagret, är hudens yttersta skikt. Det består av lager av platta keratiniserade celler, utan cellkärna och cellorganeller. Hornlagret har en viktiga funktioner, t. ex. att reflektera UV-strålning, förhindra intrång av smuts och mikroorganismer, samt förhindra vätskeförlust. Då huden nöts skalas de yttersta cellerna av och lossnar i små grupper, stratum disjunctum. Cellerna i epidermis förändras under sin vandring mot ytan. När cellerna med tiden vandrar utåt mot hudytan kommer antalet keratinfilament att öka och i slutändan utgöra hälften av den totala proteinmängden i cellen. Under differentieringsprocessen förlorar cellen sina organeller, för att slutligen bilda det lager av terminalt differentierade döda celler som utgör hornlagret. Stratum corne um Stratum granulosum Epiderm is Stratum spinosum Stratum basale Basalmembran Derm is Fig. 1. Epidermis uppbyggnad med keratinocyter i olika skikt. 4

5 Andra strukturer som associeras med huden är hårfolliklar, talgkörtlar och svettkörtlar. Hårfolliklar återfinns över hela huden, utom på handflator, fotsulor och läppar. Dessa är uppbyggda av en yttre rotskida (ORS) som är sammanväxt med basallagret i epidermis, en inre rotskida (IRS) och själva hårskaftet. Det nedre segmentet av en hårfollikel går igenom cykler av aktiv tillväxt, nedbrytning och vila [1]. Talgkörtlar mynnar i den översta delen av hårfollikeln och producerar det lipidrika talg som gör epidermis smidigt och vattenavstötande. Svettkörtlar finns i dermis och har utförsgångar som leder upp till hudytan. Svettning är en viktig mekanism för reglering av kroppstemperaturen. Hudceller nybildas i en ständigt pågående process och cellerna i epidermis omsätts normalt på dagar. Denna enorma kapacitet till förnyelse genereras av stamceller i epidermis [2]. I huden återfinns stamceller i den sk `bulge regionen i hårfolliklar samt i epidermis basallager [3]. Stamcellerna i hårfolliklarna har visats kunna ge upphov till såväl hårfollikelepitel som epidermis och talgkörtlar, medan stamceller i basallagret i epidermis endast verkar ge upphov till epidermis [3,4]. Balansen mellan förnyelse av stamceller och differentiering åstadkoms genom sk asymmetrisk delning (figur 2), där varje stamcell som delar sig ger upphov en ny stamcell och en sk `transit amplifying (eller `transient amplifying ) cell (TA). TA celler delar sig ett fåtal gånger innan de lämnar cellcykeln och genomgår terminal differentiering. En funktion hos dessa TA celler är att öka antalet terminalt differentierade celler som produceras vid varje stamcellsdelning [4]. Stamcell Transit Amplifying celler (TA) Differentierade celler Fig. 2. Stamceller nybildas och bildar TA celler som delar sig ett fåtal gånger och sedan differentieras. En cells liv och död är i normala fall en kontrollerad process. Proliferation, differentiering och apoptos är noga reglerade förlopp. Cancerceller å andra sidan karakteriseras av en okontrollerad och ofta snabb tillväxt, där den normala regleringen har satts ur funktion. Egenskaper som är kännetecknande för cancerceller är att de är självförsörjande på 5

6 tillväxtfaktorer, ej mottagliga för tillväxtinhiberande signaler, har en förmåga att undgå apoptos, besitter en obegränsad proliferativ potential, uppvisar en ökad angiogenes, samt har en förmåga att växa invasivt och bilda metastaser [5]. Omvandlingen av en normal cell till en cancercell är en flerstegsprocess, där en cell ackumulerar flera olika skadliga mutationer som förändrar cellen. Det kan vara mutationer som inaktiverar suppressorgener eller mutationer som aktiverar onkogener. Tumörsuppressorgener kodar vanligtvis för proteiner som bromsar celldelning, t ex receptorer för tillväxtinhibitorer. Onkogener kodar vanligtvis för proteiner som stimulerar till celldelning [6]. Hudcancer är den vanligaste cancerformen i västvärlden [7]. Den tveklöst största riskfaktorn för utvecklandet av alla former av hudcancer är UV-strålning [8]. UV-spektrat kan indelas i UVC ( nm), UVB ( nm) och UVA ( nm). UVC absorberas av det atmosfäriska ozonlagret som omger jorden. UVB och UVA leder till DNA-skada, genom att inducera mutationer. UVB inducerar bildandet av kovalenta bindningar mellan bredvidliggande baser (tymin och cytosin) i DNA, sk pyrimidindimerer, vilket genererar fotoprodukter som är mutagena. Förutom den direkta skadorna på DNA kan UV-strålning, framförallt UVA framkalla bildandet av fria radikaler, t ex reaktiva syreradikaler (reactive oxygen species, ROS) som i sin tur kan angripa DNA och orsaka mutationer [8]. På grund av sitt utsatta läge besitter keratinocyterna i epidermis en hög risk att förvärva cancerframkallande mutationer. Ändå är det relativt få celler som verkligen utvecklas till cancerceller, eftersom celler i huden omsätts i en relativt snabb process och de celler som muterat går förlorade i den normala differentieringsprocessen. Stamcellerna är förmodligen de enda celler som finns kvar i epidermis under tillräckligt lång tid för att hinna ackumulera de multipla skadliga mutationer som är nödvändiga för uppkomsten av en tumör [2]. Malignt melanom, som härstammar från melanocyter i epidermis, är den cancerform som vanligtvis associeras med begreppet hudcancer. Denna form är inte den vanligaste, men det är den form av hudcancer som orsakar flest dödsfall. Basalcellscancer (BCC) och skivepitelcancer (SCC) är de två vanligaste typerna av hudcancer [2]. Hudcancer, förutom maligna melanom kommer på femte plats i listan över de mest diagnostiserade cancersjukdomarna i Sverige enligt statistik från cancerfonden. BCC är den allra vanligaste formen och man har beräknat att ungefär svenskar varje år får denna diagnos [9]. Det finns tre huvudtyper av BCC: nodulär, ytlig (superficial) och infiltrativ, där den nodulära formen är 6

7 den vanligaste (figur 3). Tumörer uppstår i ungefär 80% av fallen på huvud och i nacke [10]. BCC är en långsamt växande tumör som sällan metastaserar [10]. Till skillnad från SCC, som vanligtvis uppstår stegvis via förstadier som aktinisk keratos och cancer in situ, verkar BCC uppstå utan föregående varningstecken. Tumören består av celler som är negativa för markörer för terminal differentiering, d v s cellerna i tumören är odifferentierade [2]. Även om det inte är fastställt så härstammar med största sannolikhet BCC från antingen stamceller i epidermis eller hårfollikels yttre rotskida [2]. Fig. 3. Nodulär BCC i histologiskt snitt. Signalvägen som involverar genen Sonic Hedgehog (figur 4) tros spela en viktig roll för uppkomsten av BCC och man misstänker att mutationer som påverkar Sonic Hedgehog signalering ger upphov till BCC. Hedgehog signalering beskrevs först i Drosophila och är där inblandad i tillväxt och segmentell utveckling av insekten. Idag har man funnit homologa reaktionsvägar i ryggradsdjur. I människa och i mus har denna signaleringskaskad bl a viktiga funktioner i embryonal utveckling av neuralrör, muskel- och skelett, hud, tänder, hårfolliklar och hematopoesen [7]. Det utsöndrade proteinet Sonic Hedgehog (SHH) binder till ett membranreceptorkomplex bildat av transmembranreceptorerna Patched (PTCH) och Smoothened (SMO). SMO inhiberas av PTCH, men vid bindning av SHH till PTCH tillåts intracellulär signalering via SMO. Detta leder till aktivering av transkriptionsfaktorerna Gli1, Gli2 ochgli3 och transkription av målgener. Den exakta funktionen för var och en av Gliproteinerna är idag ej klarlagd [2]. SHH signalering i huden är i normala fall förbehållet tillväxtperioder i normalt hårfollikelepitel. I BCC är denna reaktionsväg ständigt aktiv, med en konstant signalering, även utan bunden ligand [7]. 7

8 SHH SMO PTCH Cellmembran Gli Kärna Transkription av målgener för Gli Fig. 4. Sonic Hedgehog pathway. Gorlins syndrom, även kallat `basal cell nevus syndrome (BCNS), är en ärftlig autosomal dominant sjukdom som bland annat leder till utvecklingsstörningar och utveckling av multipla BCC i ung ålder. Hos personer med BCNS är en PTCH allel inaktiverad pga av mutation. Också i sporadisk BCC är PTCH ofta muterad. Mutation av PTCH leder till en ökad aktivering av SHH pathway och därmed en ökad aktivering av dess målgener, men den exakta mekanism som leder till BCC har idag ej identifierats [7]. Gli2 tros undertrycka gener associerade med epidermal differentiering, samt aktivera anti-apoptosfaktor bcl-2. Gli inducerar även transkription av PTCH och Wnt gener. Proteiner i Wnt-familjen tros orsaka ackumulering av β-catenin, ett protein som man kunnat visa är överuttryckt i BCC [??]. Målet med molekylära studier är ofta att karaktärisera den genetiska bakgrund som ger upphov till en viss fenotyp. Trovärdigheten hos de data man får är beroende av renheten av den cellpopulation som analyseras. Mikrodissektion ger en möjlighet att med hög precision välja ut en viss population celler. Genom användning av en fokuserad laserstråle kan valda bitar av ett vävnadsprov skäras ut. De utskurna bitarna kan därefter med hjälp av laser katapultas från vävnadssnittet till en uppsamlingsbehållare, utan att cellernas DNA och RNA förstörs [11]. Med hjälp av cdna microarrays möjliggörs skapandet av en profil av genuttryck som inkluderar tiotusentals gener i ett enda experiment [12]. Denna teknik utnyttjar hybridisering mellan två komplementära nukleinsyrasekvenser. Ett stort antal genspecifika polynukleotidsekvenser deriverade från 3 änden i mrna (3 expressed sequence tags, ESTs) placeras på ett `chip. Detta `chip hybridiseras med fluorescensinmärkt cdna representativt för totala mängden RNA som extraherats från en utvald population celler. Genom att mäta fluorescensen som utsänds kan mängden transkriberat RNA i provet detekteras och jämföras med en referens. Detta ger, för varje gen, ett mått på i vilken 8

9 omfattning den uttrycks [13]. Realtids PCR är också en metod som kan användas för att få ett mått på vilken mängd av en viss nukleinsyrasekvens som finns i ett prov. Med hjälp av genspecifika primers amplifieras den utvalda nukleinsyrasekvensen. Mängden slutprodukt bestäms genom jämförelse med en standardkurva där man utgått från kända koncentrationer och är proportionell mot den ursprungliga mängden i provet. Målsättningen med detta projekt var att verifiera resultat från en tidigare studie, i vilken man genomfört en sk genuttrycksanalys av celler i basalcellscancer och basalceller i normalt epidermis. I denna studie visades att ungefär 350 gener är differentiellt uttryckta i basalcellscancer, varav 202 är uppreglerade och 161 nedreglerade. Ökat uttryck av PTCH genen observerade ej, men däremot visades att flera proteiner vars uttryck styrs av SHH / PTCH signalering är differentiellt uttryckta i tumörceller. En uppreglering av Gli1, Gli2, Wnt6 och två receptorer för proteiner i Wnt-familjen, samt β-catenin kunde påvisas. Erhållna resultat tyder också på en avsaknad av epidermal differentiering, nedreglering av MHC klass II, ändrad syntes av basalmembrankomponenter, samt nedreglering av proteiner som skyddar mot reaktiva syreradikaler [13]. Metoder som användes i denna studie inkluderade mikrodissektion av celler från tumör respektive epidermis basallager i normal vävnad, extraktion av RNA, samt RNA amplifiering och transkriptionsanalys med hjälp av cdna microarrays. Resultatet från denna studie vill man alltså nu, för ett tiotal utvalda gener, verifiera med hjälp av realtid PCR. Metoder som ska användas är också denna gång mikrodissektion av celler från basallager respektive tumör och RNA isolering, nu följt av realtids PCR. Detta arbete fokuserades i första hand på mikrodissektion av tumör och efterföljande RNA isolering. Inledningsvis utfördes tester för att optimera metoden, med avseende på dehydreringsprocessen och val av objektsglas. Isolering av RNA av bra kvalitet är ett viktigt steg för att möjliggöra vidare analyser. RNA isolering kan vara förknippat med ett flertal problem, vilket också vi fick uppleva. Efter lyckade inledande optimeringstester upplevde vi problem med att överhuvudtaget kunna detektera RNA när arbetet gick vidare med RNA isolering från mikrodissekerade cellpopulationer från basallager och BCC tumörvävnad 9

10 MATERIAL OCH METODER Provmaterial Frysta vävnadsprover erhölls från den upprättade biobanken på Avdelningen för Patologi, Akademiska Sjukhuset, Uppsala. Vävnadsproverna har tidigare skurits ut från färskt operationsmaterial, bäddats in i OCT substans (Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek Europe B.V.) och frysts i isopentan / torris, för att sedan förvaras i -70ºC. Fryssnittning Preparaten fryssnittades i 16 μm tjocka snitt och överfördes sedan till PALM membranglas (P.A.L.M. GmbH, Bernried, Germany), autoklaverade 180ºC i 3h. Snitten torkades ett ögonblick i rumstemperatur och förvarades sedan i -70ºC. Färgning, fixering och dehydrering av snitt Precis innan mikrodissektion tinades snitten och färgades 1 min med hematoxylin innehållande 0,8U/μl RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega). Därefter fixerades snitten 1 min i zinkfixeringsmedel (0,1M Tris-HCl ph 7,4, 0,003M kalciumacetat, 0,02M zinkacetat, 0,04M zinkklorid) och dehydrerades 30 sek i 70% EtOH och 1 min vardera i resp. 95% och 99,5% EtOH. Mikrodissektion Mikrodissektionen utfördes med hjälp av PALM Robot-Microbeam laser microdissection system (P.A.L.M. GmbH, Bernried, Germany). De utskurna cellerna katapultades upp i 25μl extraktionsbuffert (PicoPure TM RNA Isolation Kit, Arcturus). Röret förvarades upp och ner på torris. Cellerna centrifugerades ner och röret inkuberades 30 min i 42ºC för att sedan förvaras i 70ºC. Isolering av RNA RNA isolerades med hjälp av PicoPure TM RNA Isolation Kit (Arcturus) enligt medföljande protokoll. Kontroll av RNA kvalitet RNA kvaliteten kontrollerades med hjälp av RNA 600 Pico Assay Kit (Agilent Technologies) i en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) enligt tillverkarens protokoll (Reagent Kit Guide, 2003). Metoden grundar sig på en storleksseparation med hjälp av microchip 10

11 gelelektrofores. Som stege användes som rekommenderat RNA 6000 ladder (Ambion). RNaseZap (Ambion) och DEPC-vatten användes för dekontaminering av elektroder. Bestämning av RNA koncentration NanoDrop ND-1000 spektrofotometer användes för koncentrationsbestämning av RNA. Vid koncentrationsbestämning av RNA används 1 μl av provet. Som blank användes samma elueringsbuffert som vid isolering av RNA. M ed ovan beskrivna metoder ville vi få svar på följande: 1. Påverkas morfologin i snitten samt mängden och kvaliteten på isolerat RNA av dehydreringsprocessen? Vi ville undersöka om en bättre morfologi i snitten kan uppnås genom att avbryta dehydreringen vid 95% EtOH, istället för att fortsätta till 99,5% EtOH, och även hur detta påverkar kvalitet och mängd RNA. Utgångsmaterialet var här preparat av tonsill. Hela snitt skrapades ner i extraktionsbuffert (inget mikrodissektionssteg). 2. Har val av objektsglas någon betydelse för mängden och kvaliteten på isolerat RNA, samt har autoklavering av objektsglasen någon betydelse? Vid mikrodissektion kan man använda antingen PALM membranglas eller vanliga objektsglas och vi ville testa vilket som var bättre med avseende på mängd och kvalitet RNA. Autoklavering av glas ska enligt PALM minska mängden RNaser på glasytan och vi ville också testa om detta påverkade RNA kvalitet och mängd. Utgångsmaterialet var även här tonsillvävnad. Ca 5000 celler mikrodissekerades från snitt av tonsill och överfördes till antingen PALM membranglas eller vanliga objektsglas, autoklaverade (180ºC 3h) och icke autoklaverade. 3. Kan tillräckligt med RNA av god kvalitet isoleras från mikrodissekerat material från hud? På grund av att vi efter inledande tester upplevde stora problem med att överhuvudtaget kunna detektera RNA ville vi försöka finna felkällan och se att vi kunde få metoden att fungera igen innan arbetet gick vidare. Vi bytte ut dom rör som användes, då vi misstänkte att de kunde vara kontaminerade, samt blandade också nya lösningar och rengjorde noga alla utrymmen som användes till RNA arbete. 11

12 Utgångsmaterialet var här hud från patientfall av basalcellscancer. Ca 7000 celler mikrodissekerade från snitt bestående av både BCC tumörvävnad och normal vävnad. Även 7000 celler från snitt av tonsill inkluderades som en form av kontroll, då tonsillvävnad tidigare fungerat bra som utgångsmaterial. RESULTAT 1. Påverkas morfologin i snitten samt mängden och kvaliteten på isolerat RNA av dehydreringsprocessen? Det blir bättre morfologi om man slutar dehydreringen vid 95% EtOH, istället för att fortsätta till 99,5%, detta däremot på bekostnad av mängden RNA som kan isoleras, som framgår av figur 5 där A representerar 95%, och B 99,5%. I båda fallen var RNA kvaliteten god. (A) (B) Fig. 5. Kurvorna visar resultat från Bioanalyzer. De stora topparna representerar 18S och 28S rrna. Tydliga välseparerade toppar för 18S och 28S rrna indikerar välbevarad RNA integritet, och en RNA kvalitet som är tillräcklig för eventuella fortsatta analyser. En markörtopp (längst till vänster) ska också kunna ses vid lyckad körning (här väldigt liten pga skalan på x-axeln). Observera skillnad i skala på x-axeln mellan A och B. Figur 6 visar ett typiskt utseende hos en referens-rna-stege vid lyckad körning. Fig. 6. Sex toppar som visar hur Bioanalyzern tidsseparerar referens-rnatranskript av olika storlek och en topp som visar en markör ska vara synbara och väl avgränsade. 12

13 2. Har val av objektsglas nå gon betydelse för mängden och kvaliteten på isolerat RNA, samt har autoklavering av objektsglasen någon betydelse? Som framgår av figur 7 är membranglas bättre än vanliga objektsglas med avseende på mängden RNA som kan isoleras från ett visst antal celler. Det verkar dessutom som om mer RNA kan isoleras från glas som autoklaverats. Vid användning av autoklaverade membranglas (A) kan endast en topp, 18S rrna, urskiljas. Det har tidigare visat sig att det kan hjälpa att späda provet och då få två tydligt urskiljbara toppar. Detta testades inte denna gång, men troligtvis finns här tillräcklig mängd RNA av god kvalitet. Med icke autoklaverade membranglas (B) erhölls två tydliga RNA toppar vilket antyder bra kvalitet och tillräcklig mängd. Med autoklaverade vanliga objektsglas (C) blev resultatet att två små, men väl avgränsade, RNA toppar var synliga. Vid användning av vanliga icke autoklaverade glas (D) kunde RNA ej detekteras. (A) (B) (C) (D) Fig. 7. Bioanalyzer-kurvor erhållna med RNA som preparerats med användning av: (A) Autoklaverade membranglas. (B) Icke autoklaverade membranglas. (C) Autoklaverade vanliga objektsglas. (D) Icke autoklaverade vanliga objektsglas. 13

14 3. Kan tillräckligt med RNA av god kvalitet isoleras från mikrodissekerat material från hud? Tilläckliga mängder RNA av god kvalitet kunde som figur 8 visar detekteras från mikrodissekerat material bestående av ca 7000 celler. Den uppmätta RNA koncentration var i prov från hud 5,6 ng/ μl (medelvärde av två mätningar) och i prov från tonsill 9,9 ng/μl (medelvärde av två mätningar) (A) (B) Fig. 8. Bioanalyzer-kurvor erhållna med: (A) RNA isolerat från tonsill och (B) RNA isolerat från hud. (Topparna för 28S rrna bör i idealfallet vara högre eller lika höga som de för 18S.) 14

15 DISKUSSION Lyckad isolering av RNA är ett första steg och ofta ett kritiskt steg i många analyser, t ex analys av genuttryck. Isolering av RNA kan vara förknippat med ett flertal problem då RNA snabbt bryts ner i rumstemperatur. Vi upplevde stundtals stora problem med att överhuvudtaget kunna isolera RNA och i en experimentell process med många olika steg kan det vara svårt att identifiera var problemet ligger. Val av färgnings- och fixeringsmetod kan påverka kvalitet och koncentration av isolerat RNA och likaså kan närvaron av nedbrytande enzymer. RNA kan i rumstemperatur brytas ner av RNaser. RNaser är mycket stabila enzymer som är svåra att inaktivera. Även efter långvarig autoklavering kan de bibehålla sin aktivitet. RNaser finns överallt i omgivningen och även små mängder kan vara tillräckligt för att förstöra RNA i ett prov. Vid RNA arbete är det alltså mycket viktigt att försöka skapa en RNas-fri miljö. Den vanligaste källan till kontamination är RNaser som finns på huden, på dammpartiklar i luften eller på det material som används. Det är därför viktigt att alltid använda handskar vid arbete med RNA och att byta dem ofta. Man bör använda RNas-fria pipettspetsar, rör och annat förbrukningsmaterial. Om möjlighet finns kan det vara bra att avsätta en viss arbetsyta till RNA arbete och där använda särskilda pipetter, särskilt förbrukningsmaterial etc. Kemikalier som används vid RNA isolering och analys bör reserveras för detta arbete och hållas separat från kemikalier som används till annat, detta för att ytterligare minska risken för kontamination. Formalin är det mest använda fixeringsmedlet inom patologin. Rutinmässigt formalinfixeras och paraffininbäddas alla vävnader. En nackdel med formalin är att det har en negativ inverkan på kvaliteten hos isolerat DNA eller RNA, vilket leder till svårigheter vid analys av gener och genfunktion. Färsk vävnad är då att föredra framför formalinfixerad paraffininbäddad vävnad. I Biobanken har färsk vävnad, t ex operationsmaterial, samlats och kan användas inom forskning. Vid den låga temperaturen under förvaringen i Biobanken är RNA stabilt, då nedbrytande enzymer inaktiveras av den låga temperaturen. Under själva fryssnittningen är temperaturen i kryostaten 25ºC. För att minska risken att RNA bryts ner får man försöka arbeta snabbt, genast lägga snitten på torris och sedan förvara i -70ºC. Om man snittar bort det översta skiktet på klossen kan man räkna med att RNA i provet är intakt. Färsk vävnad måste fixeras för att motverka de normala nedbrytande processerna. Ett bra 15

16 fixeringsmedel ska vara förenligt med en så intakt och lättbedömd morfologi som möjligt. Istället för formalin användes här ett zinkbaserat fixeringsmedel (ZBF) som visats bevara RNA i vävnaden bättre. ZBF är dessutom ofarligt, billigt och lätt att framställa [14]. Användande av ZBF har tidigare visats fördelaktigt vid immunhistokemisk färgning av paraffininbäddade vävnadssnitt [15] och vid isolering av RNA från mikrodissekerat material [16]. Efter fixering bör vävnad dehydreras, då nedbrytande enzymer i vävnaden ej är verksamma i avsaknad av vatten. Efter färgning, fixering och dehydrering ska man kunna arbeta med snittet i rumstemperatur under mikrodissektionen utan att RNA påverkas nämnvärt. Efter att de utvalda utskurna delarna överförts till extraktionsbuffert ska röret frysas omedelbart för att motverka nedbrytning av RNA. Vid mikrodissektion används ofta relativt tjocka snitt, med följd att den morfologiska orienteringen blir försämrad och det kan vara svårt att tydligt urskilja olika strukturer. Detta leder till en osäkerhet vid utskärningen. Vi kunde erhålla en bättre morfologisk bedömning genom att stoppa dehydreringen vid 95% EtOH, men kunde då också se att mängden isolerat RNA minskade. Man får här alltså göra en avvägning av vad man prioriterar, bättre morfologi eller mer RNA. Vilken typ av objektsglas som används påverkar dels mängden RNA som erhålls och dels den tid och det arbete man får lägga ner. Antingen används membranglas (PALM), där ett stabiliserande membran på objektsglasets yta tillåter att man skjuter upp stora intakta utskurna bitar från snittet. Används vanliga objektsglas skjuts den utvalda biten upp med ett stort antal skott, vilket gör att vävnaden går sönder i småbitar. Mer RNA kan isoleras från ett bestämt antal celler om membranglas används, jämfört med vanliga objektsglas. Arbetet går dessutom lättare och snabbare. Ett problem som uppstår när man arbetar med hud är att epidermis inte fäster ordentligt på membranglas. Problemet som uppstår är att hela epidermis veckar ihop sig och ställer sig på högkant mot utskärningsytan, vilken i princip omöjliggör mikrodissektion. Anledningen till att detta händer vid arbete med hud och inte med annan vävnad är inte känd. På vanliga objektsglas fäster epidermis bra. Att epidermis veckar ihop sig är främst ett problem vid mikrodissektion av basallager i epidermis. Mikrodissektion av tumörvävnad påverkas ej så mycket av detta då tumörvävnaden ligger djupare. Alltså användes membranglas vid mikrodissektion av tumör. Vilken typ av glas som ska användas vid mikrodissektion av basallager i epidermis återstår att besluta. Vi lyckades inte isolera RNA från basallager i epidermis som mikrodissekerats från snitt på vanliga objektsglas och 16

17 katapultats med ett stort antal skott. Det är däremot svårt att säga om detta beror på glasen och katapultsteget eller på att metoden då inte fungerade för att RNA bröts ner. Ett möjligt alternativ till att katapulta upp de utskurna bitarna är att plocka upp dem för hand med hjälp av en skalpell, vilket är tidskrävande och ställer stora krav på ett stabilt handlag. Det är dessutom stor risk för kontamination som kan leda till degradering av RNA. När vi efter lyckade inledande tester fick problem med att överhuvudtaget kunna detektera RNA efter isoleringssteget blev målsättningen att först och främst identifiera felkällan och åter få metoden att fungera. Efter att vi bytt ut de rör som användes, samt blandat nya lösningar och noggrant rengjort de utrymmen som utnyttjas till RNA arbete, verkar metoden nu fungera. En trolig förklaring är att rören som tidigare användes var kontaminerade. Mängden RNA som kunde isolerades från ca 7000 celler är tillräcklig för realtids PCR. När metoden nu fungerar kommer arbetet att gå vidare med att mikrodissekera specifika cellpopulationer från tumörvävnad respektive normal basallager från ett antal patientfall med BCC. Tio gener som är differentiellt uttryckta i BCC kommer att väljas ut för realtids PCR, men vilka, som väljs ut är ännu inte slutgiltigt bestämt. 17

18 REFERENSER [1] Alonso, L, Fuchs, E. Stem cells in the skin; waste not, Wnt not. Genes Dev 17 (2003) [2] Watt F M, David M. Contribution of Stem Cells and Differentiated Cells to Epidermal Tumors, Nature 3 (2003) [3] Alonso L, Fuchs E. Stem cells of the skin epithelium, PNAS 100 (2003) [4] Watt F M. Stem cell fate and pattering in mammalian epidermis, Current Opinions in Genetics and Development 11 ( 2001) [5] Hanahan D, Weinberg R A. The hallmarks of cancer. Cell 100 (2000) [6] Knudson A G. Two genetic hits (more or less) to cancer. Nature Reviews 1 (2001) [7] Holíková Z, Massi D, Lotti T, Hercogová J. Insight into the pathogenesis of sporadic basal cell carcinoma. International Journal of Dermatology 43 (2004) [8] Lear J T, Hoban P, Strange R C, Fryer A A. Basal cell carcinoma: from host response and polymorphic variants to tumour suppressor genes. Clinical and Experimental Dermatology 30 ( 2005) [9] Cancer i siffror. Cancerfonden och Socialstyrelsen (2001) cancerfonden.com [10] Wong C S M, Strange, R C, Lear J T. Basal Cell Carcinoma: Clinical review. [11] Tetsushiko Tachikawa, Tarou Irié. A new molecular approach in morphology: basic method and application of laser microdissection. Med Electron Microsc 37 (2004) [12] David J. Duggan, Michael Bittner, Yidong Chen, Paul Meltzer, Jeffrey M. Trent. Expression Profiling using cdna microarrays. Nature Genetics Supplement 21 (1999) [13] Asplund A, Gry Björklund M, Nilsson P, Pontén F, and Lundeberg J. Transcript Profiling of Microdissected Cell Populations Selected from Basal Cells in Normal Human Epidermis and Basal Cell Carcinoma, Manuscript [14] Wester K, Asplund A, Bäckvall H, Micke P, Derveniece A, Hartmane I, Malmström P-U, Pontén F. Zink- fixative improves preservation of genomic DNA and proteins in histoprocessing of human tissues. based Laboratory Investigation 83 (2003)

19 [15] Beckstead J H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues. J Histochem Cytochem 42 (1994) [16] Scheidl SJ, Nilsson S, Kalen M, Hellstrom M, Takemoto M, Hakansson J, Lindahl P. mrna expression profiling of microbeam microdissected cells from slender embryonic structures. Am J Pathol 160 (2002)

20 20

21 21