Omtentamen KE0026, 10p, Max poäng = 76p. Preliminär gräns för G utan bonus = 57p.

Transkript

1 Omtentamen KE0026, 10p, Max poäng = 76p. Preliminär gräns för G utan bonus = 57p. Glöm ej kodnummer på varje blad! Skriv och rita tydligt! Lycka till! 1. Proteiner tillverkas på ribosomer genom att aminosyror kopplas kovalent till varandra i en bestämd ordning. Polypeptidkedjan veckas till en kompakt tredimensionell struktur vilken är den funktionella formen av proteinet. a) Vad bestämmer ordningsföljden av aminosyror i polypeptiden? (0.5p) b) Vilken är den huvudsakliga drivkraften som får polypeptidkedjan att anta en kompakt form? (0.5p) c) Vilka typer av interaktioner (förutom de kovalenta bindningarna inom peptidkedjan) stabiliserar proteinets tredimensionella struktur? (1p) Olika aminosyror har olika strukturella och kemiska egenskaper och återfinns därför generellt på olika platser i ett protein. Till exempel så är aminosyrorna G och P vanliga i beta-böjar. (4p) d) Förklara vilka egenskaper var och en av dessa två aminosyror har som gör att de ofta förekommer i beta-böjar (1p) e) En av ovanstående aminosyror återfinns endast sällan i alfahelixstruktur. Vilken aminosyra och varför passar den dåligt i en alfahelix? (1p) Rättningsmall fråga 1: a) Ordningen bestäms av bassekvensen hos genen som kodar för proteinet (0.5p) b) Hydrofoba effekten (0.5p) c) Vätebindningar, van der Waals-interaktioner, elektrostatiska interaktioner (0.75p) d) Glycin saknar sidokedja och phi & psi-vinklarna kan därför anta i stort sett vilka värden som helst Ë huvudkedjan kan böjas kraftigt (0.5p). Hos prolin binder sidokedjan tillbaks till huvudkedjan och gör därmed en knix på denna genom att låsa phi (0.5p). e) Prolin (0.25p). Alfahelix stabiliseras av vätebindningar mellan C=O (på aminosyra n) och NH (på aminosyra n+4); prolin saknar väte på peptidkvävet som därför inte kan delta i vätebindning. (0.75p) 2. Enzymet FMDH har subenhetskompositionen a 3 b 3 gd, och varje a-subenhet har två domäner. Hur många N- respektive C-terminaler finns det? (1p) Rättningsmall fråga 2:

2 8 st av varje (en N- och C-terminal per subenhet). (1p) 3. När ett bi försvarar sig genom att sticka någon sprutar det in ett gift som bland annat innehåller peptidtoxinet apamin. Apamin har aminosyrasekvensen CNCKAPETALCARRCQQH (1p) och det finns två disulfidbryggor. Klyvning med trypsin ger två fragment. Var finns S-S-bindingarna? Rättningsmall fråga 3: Mellan C1 och C3, och mellan C11 och C15 (1p) 4. a) Beskriv kortfattat principen för jonbyteskromatografi och hur ett typiskt sådant experiment kan utföras. (2p) b) Proteinet X har visat sig binda till en jonbytare med liganden DEAE (positivt laddad ligand) vid ph 6.5. Proteinet visar sig dock vara något instabilt vid detta ph och du beslutar dig därför att byta till en buffert med ph 8.0. Tror du att X som har en isoelektrisk punkt på 5.2 fortfarande binder till DEAE i detta fall? Varför? (2p) c) För analys av dina proteinfraktioner använder du dig av SDS- Polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) som bl.a. kan ge en uppfattning om renheten hos dina prover. Vilken funktion har SDS (anjonisk detergent) i detta sammanhang? (1p) (5p) Rättningsmall fråga 4: a) I jonbyteskromatografi utnyttjar man förmågan hos molekyler att binda reversibelt till immobiliserade laddade grupper. Beroende på proteinets laddning vilket i sin tur beror av ph väljer man positivt eller negativt laddade ligander. (1.0 p) Ett experiment kan gå till på så sätt att man packar en kolonn med önskad jonbytare och jämviktar denna i en buffert med låg jonstyrka. Provet appliceras och kolonnen tvättas med 2-3 kolonnvolymer av buffert med låg jonstyrka, detta för att obundet material ska få tillfälle att tvättas bort från kolonnen. Bundet material kan senare elueras genom att jonstyrkan höjs. (1.0 p) b) Ja, X binder till DEAE vid ph 8.0. (1p). X som har en isoelektrisk punkt på 5.2 bör ha en negativ nettoladdning vid alla ph:n som överstiger detta värde. X har alltså troligen en ännu större negativ laddning vid ph 8.0. (1 p) c) Den negativt laddade SDS-molekylen bryter upp alla icke-kovalenta bindningar vilket gör att proteinets tredimensionella struktur förstörs och proteinet förses med en negativ överskottsladdning. (1p)

3 5. a) Syretransport och lagring av syre i musklerna ställer olika krav på de inblandade proteinerna. Beskriv med hjälp av bindningskurvor hur syrebindning till myoglobin och hemoglobin skiljer sig åt och förklara kortfattat hur skillnaderna uppkommer! Vad kallas den egenskap som gör att hemoglobin kan fungera som en effektiv syretransportör? (4p) b) Beskriv en heterotrop alloster effekt hos hemoglobin. (1p) (5p) Rättningsmall fråga 5: a) Hyperbol kurva för Mb binder starkt även vid de låga syretrycken ute i vävnad. Sigmoidal kurva för Hb binder svagare vid lågt syretryck. (1p) Strukturell bakgrund: Hemoglobin består av fyra Mb-liknande subenheter som kan existera i två olika former: R och T (0.5p). R och T står i jämvikt med varandra (0.5p). T (deoxyhb) binder syre svagt; R (oxyhb) binder syre starkt (0.5p). Bindning av syre förskjuter jämvikten mot R-formen så att mer R-Hb finns i lungorna; vid låga syretryck förskjuts jämvikten mot T-formen och mer syre kan avges (0.5p). Detta sker genom att olika Hb-subenheter kommunicerar med varandra genom konformationsförändringar orsakade av syrebindning (0.5p). Egenskapen kallas kooperativ bindning eller (homotrop) allosteri (0.5p). b) Bohreffekten = sur miljö (H + ) och CO 2 "sköljer ut" O 2 från Hb genom at stabilisera deoxyhb. BPG i hålrummet i mitten av deoxyhb-tetrameren och stabiliserar den så att mer syre kan avges till musklerna. I syrefattig miljö ökas produktionen av BPG. (1p för ett korrekt exempel). 6. Beräkna DG för ATP-hydrolys i en cell vid 37 C där [ATP] = 3 mm, [ADP] = 0.2 mm och [Pi] = 50 mm. (2p) Rättningsmall fråga 6: kj/mol 7. Serinproteaser utsöndras som zymogener från bukspottkörteln. Efter aktivering i tarmen klyver de peptidkedjor med en gemensam katalytisk process, men varje serinproteas har olika specificitet och klyver peptidbindningar efter olika aminosyror. T. ex. klyver chymotrypsin peptidkedjor efter aminosyrarester med aromatiska eller andra stora sidokedjor, medan trypsin klyver efter positivt laddade sidokedjor.

4 a) Förklara med en figur hur denna substratspecificitet uppkommer. (2p) b) Genom kinetiska mätningar kan man bestämma k cat /K M (den s.k. specificitetskonstanten), som är ett mått på hur effektivt ett enzym är med avseende på ett substrat jämfört med ett annat. Förklara varför k cat /K M är ett bra mått på enzymeffektivitet. (2p) c) Följande tabell ger k cat och K M för ett antal artificiella chymotrypsinsubstrat. Vilken av aminosyrorna Phe och Tyr föredrar enzymet att klyva efter? (2p) Substrat kcat K M (s -1 ) (mm) AcTyr - NH AcPhe - NH AcTyr - GlyNH AcPhe - GlyNH AcTyr - AlaNH AcPhe - AlaNH (6p) Rättningsmall fråga 7: a) 2p för figur enl sid. 187 (fig 6.21) i boken eller liknande (olika fickor för binding av olika typer av sidokedjor). b) Vid låga substratkoncentrationer ges reaktionshastigheten av k cat /K M. Har man då två substrat med samma koncentration [A] och [B] får man för en given enzymkoncentration v A = (k cat /K M ) A * [E][A] v B = (k cat /K M ) B * [E][B] Om [A] = [B] får vi v A / v B = (k cat /K M ) A / (k cat /K M ) B c) Chymotrypsin föredrar att klyva efter Tyr genomgående högre k cat /K M 8. En kollega föreslår att du ska göra ett super-chymotrypsin som är mycket snabbare än vildtypen genom att göra punktmutationer som gör att enzymet binder substratet starkare. Är detta ett bra förslag? Varför/varför inte? Visa i ett energidiagram hur reaktionen förlöper i frånvaro av enzym, i närvaro av chymotrypsin, och i närvaro av super-chymotrypsin. (3p) Rättningsmall fråga 8: Det är ett dåligt förslag (om mutationen inte samtidigt gör att TS binds ändå starkare). Starkare substratbinding sänker energin för ES vilket (under förutsättning att inget annat påverkas) höjer aktiveringsenergin för reaktionen och alltså gör att reaktionen går långsammare (3p).

5 9. a) Liksom många andra enzymer följer serinproteaserna Michaelis-Mentenkinetik. Skriv det allmänna reaktionsschemat för en enzymkatalyserad reaktion som följer MM-kinetik. Glöm inte hastighetskonstanterna! Ange hur reaktionshastigheten v 0 = D[P]/Dt beror av koncentrationen av Michaeliskomplex. (1p) b) Hur påverkar ett enzyms Km respektive kcat förhållandet mellan koncentration av substrat och produkt vid jämvikt? (1p) c) Km kan ha samma värde som dissociationskonstanten (Ks) för sönderfall av ES-komplexet, och är då ett mått på hur hårt substratet binds, men bara under en viss förutsättning. Vilken? (1p) d) Visa i en Lineweaver-Burkeplot skillnaden mellan en enzymkatalyserad reaktion utan inhibitor och i närvaro av i) en kompetitiv inhibitor och ii) en ickekompetitiv (non competitive) inhibitor. (1p) (3p) Rättningsmall fråga 9: a) E + S = ES E + P (0.5p) v 0 = k cat [ES] (0.5p) b) Inte alls (1p) c) Km = (k-1 + kcat)/k1. Om kcat << k-1 blir Km = Ks (1p) d) Plot 1/v 0 vs 1/[S] med rät linje skärande x och y axlarna (0.5p). Kompetitiv: gemensam skärningspunkt y-axeln (samma Vmax) (0.5p). Icke-kompetitiv: gemensam skärningspunkt x-axeln (samma K M ) (0.5p). 10. Många kalciumbindande proteiner använder ett liknande motiv, en s.k. kalciumbindande EF-hand, för att binda kalciumjoner (se bild). Motivet består av två helixar förbundna med en loop. Nedan visas sekvensen i EF-handen från tre olika kalciumbindande proteiner. Identifiera de konserverade aminosyrorna och ange för var och en en trolig anledning till att den är konserverad. Parvalbumin Calmodulin Troponin-C V K K A E A I I D Q D K S G F I E E D E L K L F L Q N E F K E A F S L F D K D G D G T I T T K E L G T V M R S L L A D C F R I F D K N A D G F I D I E E L G E I L R A T <-- helix E --><---- loop ----><-- helix F --> (2p) Rättningsmall fråga 10: Parvalbumin Calmodulin Troponin-C V K K A E A I I D Q D K S G F I E E D E L K L F L Q N E F K E A F S L F D K D G D G T I T T K E L G T V M R S L L A D C F R I F D K N A D G F I D I E E L G E I L R A T * * * * * G, I, L är konserverade av strukturella skäl (1p). I, L p.g.a. packning, G behövs i loopen för att den skall böjas rätt så att kalciumliganderna hamnar på rätt plats. D, E (negativt laddade) funktionella skäl - binder kalciumjonen (1p).

6 11. Metanol är ett mycket farligt gift, inte på grund av sin egen biologiska aktivitet utan p.g.a. att metanolen metaboliskt omvandlas till formaldehyd m.h.a. enzymet alkholdehydrogenas. Formaldehyden kan inte effektivt metaboliseras vidare utan ackumuleras i kroppen med allvarliga konsekvenser. Ett led i behandlingen av metanolförgiftning går ut på att ge den förgiftade stora doser etanol. Förklara varför detta är en effektiv behandling. (2p) Rättningsmall fråga 11: i) Etanol fungerar som en kompetitiv inhibitor för metanolreaktionen ii) Då etanolen oxideras bildas stora mängder NADH så att jämvikten metanol + NAD+ = formaldehyd + NADH förskjuts mot metanol 12. a) Vilka huvudtyper av lipider hittar man i cellmembran, och hur ser grundstrukturen för lipid ut? (1p) b) Visa schematiskt hur ett cellmembran ser ut. Beskriv kortfattat hur egenskaper hos lipiderna påverkar cellmembranets egenskaper. (2p) c) Lipiddelen av ett biologiskt membran är ca 3 nm tjock. Uppskatta hur många hydrofoba aminosyror som behövs i en transmembranhelix som ska gå vinkelrätt genom membranet (för att få poäng ska du inte bara ange en siffra utan också tala om hur du kommer fram till svaret). (1p) (4p) Rättningsmall fråga 12: a) Fosfolipider (2 fettsyror med polär fosfatbunden huvudgrupp) (0.5p) Kolesterol (4 ringar med några dubbelbindningar) (0.5p) b) Dubbelmembran bildas genom att de hydrofoba svansarna packas mot varandra med de hydrofila huvudgrupperna ut mot vatten (0.5p). Kolesterol är hydrofobt och återfinns inuti membranet tillsammans med fosfolipidernas svansar (0.5p). Membranen är lättrörliga vid normala temperaturer. Kolesterol påverkar packningen mellan svansarna så att membranen förblir lättrörliga även vid lägre temperaturer (d.v.s. kolesterol sänker smältpunkten för membranet) (0.5p). Omättade fettsyror i svansarna hos fosfolipider ger en liknande effekt (0.5p). c) 20 aminosyror (3.6 aminosyror per varv x 30Å/5.4Å = 20) (1p) 13. Du har fått jobb på ett livsmedels-/foder-företag. Företaget har tagit fram en ny produkt som skall lanseras som ett hälsopreparat. Resultaten vid utfodringsförsök på djur har inte givit tillfredsällande resultat och det misstänks att någon eller några av de växtsubstanser som finns i preparatet inhiberar andningskedjan. Du får nu tillfälle att utnyttja de teoretiska och praktiska färdigheter som du erhållit i biokemi. (Du erhåller ett färdigt extrakt klart att användas). Hur går du tillväga för att bestämma var i andningskedjan inhiberingen sker. (5p)

7 Rättningsmall fråga 13: Till en suspensionen innehållande mitokondrier, buffert, substrat (glutatmat (NADH)) och ADP (eller ADP-genererande system) tillsätts extraktet. Förändring i syrgaskonsumtion registreras. Om inhibering sker tillsätts nästa substrat (Succinat (FADH2)) om inhibering sker tillsätts askorbat/tmpd. Om syrgaskonsumtionen ökat efter tillsatts av succinat sker inhiberingen mellan Komplex 1 och 2. Om andningen kommer igång efter tillsatts av askorbat/tmpd sker inhibering mellan komplex 3 och 4. Om ingen ökning av syrgas-konsumtionen sker inhiberas överföringen av elektroner från komplex 4 till O2. 3p plus 2p för disskussion om var ev. inhibering sker. 14. Fosfofruktokinas I och fosfofruktokinas II spelar en viktig roll i glykolysens reglering. Beskriv kortfattat hur dessa två enzymer regleras och hur de reglerar övriga glykolysen. (4p) Rättningsmall fråga 14: F-2,6-BP (produkt från PFK II) aktiverar PFK I (1p). PFK II aktiveras eller inaktiveras hormonellt genom reversibel fosforylering (1p). F-1,6-BP (produkt från PFK I) aktiverar pyruvatkinas (feedforwardaktivering) (1p). PFK I är allostert; aktiveras (förutom av F-2,6-BP) av AMP, inaktiveras av ATP och citrat (1p). 15. De flesta djur lägger upp ett reservföråd av energi i form av fett. Hur mycket mer energi i form av ATP-ekvivalenter erhålls då en mol steraninsyra (C18:0) oxideras jämfört med en mol glukos. Endast den energi som erhålls i citronsyracykeln och via oxidativ fosforylering skall redovisas (inga tidigare steg). I citronsyracykeln genereras 3 NADH, 1 FADH2 och en GTP per varv. (3p) Rättningsmall fråga 15: Vid förbränning av 1 mol glukos erhålls 2 mol acetyl CoA Vid förbränning av sterarinsyra erhålls 9 mol acetyl CoA 3 NADH= 3x2.5= 7.5 ATP 1 FADH2= 1x1.5 =1.5 ATP 1 GTP =1x1= 1 ATP Summa :10 ATP per acetyl CoA 1 mol Glukos = 20 ATP

8 1 mol stearinsyra = 90 ATP 16. a) Vilket ämne reagerar med oxaloacetat i citronsyracykelns första steg? (1p) b) Vilka processer förser citronsyracykeln med detta ämne? (1p) c) Om en cell befunnit sig i vila kan oxaloacetatet ha förbrukats och då kan alltså inte citronsyracykeln fungera. Hur kan oxaloacetat nyproduceras för att starta cykeln igen? (1p) (3p) Rättningsmall fråga 16: a) Acetyl-CoA (1p) b) från pyruvat (glykolys) eller från betaoxidation av fettsyror (1p). c) Pyruvatkarboxylas och PEP-karboxylas katalyserar syntes av oxaloacetat (1p). 17. a) Beskriv huvudkomponenterna i fotosyntesens ljusreaktion. Illustrera gärna med en enkel skiss. (2.5p) Besvara sedan följande frågor: b) Var sker fotosyntesens ljusreaktion? (0.5p) c) Vad heter den vanligaste ljusinfångande komponenten hos växter? (0.5p) d) Vilken allmän fysikalisk egenskap hos molekylerna som ingår i ljusreaktionen utnyttjas för att transportera elektroner? (0.5p) e) Varifrån tas elektronerna? (0.5p) f) Vilken är den slutliga elektron-mottagaren? (0.5p) (5p totalt) Rättningsmall fråga 17: a) Ett (biologiskt) membran (0.25p) en elektronkälla (H 2 O) (0.25p) ljusinfångande pigment (klorofyll) (0.25p) elektrontransporterande kofaktorer (redox-centra) (0.25p) protein (reaktionscenter (0.25p), cytokrom bf-komplex (0.25p)) vattenlösliga elektronbärare (cytokrom c (0.25p), plastocyanin (0.25p)) elektron-mottagare (NADP + ) (0.25p) ljus (0.25p). See t.ex. Fig 16.7 i Horton. b) I kloroplasternas tylakoidmembran. (0.5p) c) Klorofyll (a) (0.5p) d) Reduktionspotentialen (redox-potentialen). (0.5p) e) H 2 O (0.5p) f) NADP + (0.5p)

9 18. Vilka egenskaper hos deoxynukleotider gör att dessa kan bygga upp en dubbelhelix? (2p) Rättningsmall fråga 18: Sockret (ribos) har en fri 3 -hydroxyl som kan bilda en fosfoesterbindning till 5 fosfatgruppen på en annan nukleotid så att nukleinsyrakedjor bildas (1p). Kvävebaserna vätebinder till varandra; A-T, G-C. De flata kvävebaserna stackar mot varandra inuti dubbelhelixen. (1p)