Frågor och svar till ordinarie tentamen för KE7001 period 4 (Biokemi, 10p) Totalpoäng: 70 p (23 frågor) Preliminär gräns för G: 37 p (53%)

Transkript

1 Frågor och svar till ordinarie tentamen för KE7001 period 4 (Biokemi, 10p) Totalpoäng: 70 p (23 frågor) Preliminär gräns för G: 37 p (53%) Fråga 1: Komplettera nedanstående dipeptid vid fysiologiskt ph (R1 och R2 markerar sidokejorna). Ange phi, psi och peptidbinding. Visa vilka av dessa nämnda bindningar som är roterbara. (2,5p) R1 R2 C α C α + H 3 N Roterbara bindningar φ Peptidbindning - kan inte rotera R1 R2 O α α C C N C φ H ψ H φ H ψ = Phi-vinkel C ψ = Psi-vinkel O O Rätt formel 0,75p, rätt laddningar 0,25p, 0,5p för varje korrekt bindning/vinkel. Fråga 2: Interaktionsytan mellan två subenheter i ett protein har experimentiellt visat sig vara av hydrofob karaktär. Vilka fyra aminosyror i sekvensen nedan förväntar du dig att finna i interaktionen? lys, asp, leu, ala, glu, arg, ile, phe, ser leu, ala, ile, phe är de enda hydrofoba (0,25p för varje rätt aminosyra) Fråga 3: Beskriv vad som menas med ett proteins kvartärstruktur. Kvartärstrukturen beskriver hur subenheterna i ett multimert protein sitter i förhållande till varandra. Ett monomert protein har ingen kvartärstruktur. Fråga 4: Vad karaktäriserar homologa proteiner? 1

2 Homologa proteiner har utvecklats från en ursprunglig anfader/anmoder. De har ett evolutionärt samband. Fråga 5: Du försöker rena ett glukosbindande protein (GBP) med affiniteskromatografi med hjälp av en kolonn som innenhåller en gelsubstans med glukos som aktiv ligand. Efter denna kolonn är dock GBP inte riktigt rent utan du har kvar mindre mängder av två kontaminerande (förorenande) proteiner A och B. Några egenskaper hos GBP, A och B är summerade i följande tabell. Protein Isoelektrisk Nativ Övrigt punkt (pi) molekylvikt GBP Binder till glukos Kontaminerande protein A Kontaminerande protein B a) Du betämmer dig för att försöka isolera GBP fritt från A och B med hjälp av jonbyteskromatografi. Beskriv kortfattat principen för denna metod och motivera varför den skulle kunna fungera i detta exempel. 2 p b) Nämn en annan vanlig proteinreningsmetod som du skulle kunna användas för att få fram GBP i ren form. Metoden får inte förstöra proteinet utan GBP ska fortfarande vara aktivt. Motivera svaret. 1 p (totalt 3p) a) Jonbyteskromatografi bygger på principen att proteiner kan anta olika laddning beroende av ph (0.5 p) och därför binda reversibelt till immobiliserade grupper av motsatt laddning (0.5 p). För att proteinerna ska lossa igen från liganden kan man höja jonstyrkan eller ändra ph (0.5 p). I detta exempel bör metoden kunna fungera då de båda förorenande proteinernas isoelektriska punkter ligger långt ifrån den hos GBP (0.5 p). (Kör t.ex. en anjonbytare vid ph 7.0) b) Prova att köra en gelfiltrering (0.5 p). A och B har mycket högre molekylvikter än GBP så det bör gå att hitta en lämplig gelfiltreringssubstans för att skilja molekylerna åt. (0.5 p) Fråga 6: Vad krävs för att en (kemisk) reaktion ska kunna ske spontant? Gibbs fria energi måste minska (ΔG <0), mao ändringen av Gibbs fria energi är mindre än 0, dvs produkterna måste ha lägre fri energi än utgångsämnena (ΔG = ΔH TΔS < 0). Fråga 7: a) Serinproteaser som trypsin, chymotrypsin, och elastas har likartade aktiva ytor och använder samma mekanism för att klyva polypeptidkedjor. Vilka tre sidokedjor finns alltid i aktiva ytan hos serinproteaser? Ange (översiktligt) hur var och en av de tre aminosyrorna deltar i den katalytiska reaktionsmekanismen. (3.5p) b) De tre enzymerna använder alla samma reaktionsmekanism för att klyva peptidbindningar men har väldigt olika substratspecificitet. Förklara! (Rita gärna figur!) (1.5p) (hela frågan 5p) 2

3 a) I aktiva ytan finns hos alla dessa enzymer en s.k. katalytisk triad bestående av en serin, en histidin och en asparaginsyra (0.5p). Histidinen fungerar som syra/bas-katalysator i flera olika skeden, bl.a. tar den en proton från serinsidokedjans hydroxylgrupp så att denna aktiveras och blir en effektiv nukleofil. Serinen fungerar som nukleofil och attackerar karbonylkolet i peptidbindningen som skall klyvas. Asparaginsyran hjälper till att rikta in histidinen och stabiliserar den laddade formen av His-sidokedjan. b) Substratspecificiteten bestäms av aminosyrorna i specificitetsfickan. Glyciner möjliggör bindning av stora sidokedjor i specificitetsfickan hos chymotrypsin, strörre sidokedjor i dessa positioner ger specificitet för små aminosyror hos elastas. En negativt laddad aminosyra (Asp) i botten på fickan ger specificitet för positivt laddade aminosyror (Arg, Lys) i trypsin. (1.5p) Fråga 8: Enzymet E som följer Michaelis-Menten-kinetik har ett Km på 0.5 μm (mikromolar). Initiala hastigheten är 0.1 μm/min (mikromolar/min) vid en substratkoncentration på 1000 μm (mikromolar). Vad är den initiala hastigheten när [S] är lika med a) 1.5 mm (millimolar) b) 0.5 μm (mikromolar) c) 4 μm (mikromolar)? (hela frågan 3p) När [S] = 1000 μm så gäller [S] >> K m, och alltså är v 0 = V max = 0.1 μm/min a) här, liksom vid varje substratkoncentration >> K m (=0.5 μm) gäller v 0 = V max = 0.1 μ M/min b) [S] = K m så v 0 = V max /2, eller 0.05 μm/min c) Eftersom K m och V max är kända, kan Michaelis-Menten ekvationen användas för att beräkna v 0 vid varje substratkoncentration. v 0 = V max [S] / ( K m + [S] ) För [S] = 4 μm, v 0 = (0.1 μm/min) (4 μm) / (0.5 μm + 4 μm) = = 0.4/4.5 μm/min = = 0.09 μm/min Fråga 9: Hur fungerar proteolytisk aktivering? Ge två exempel på viktiga biokemiska processer som regleras genom proteolytisk aktivering. (3p) Proteolytisk aktivering sker genom enzymkatalyserad hydrolys (klyvning) (0.5p) av (en eller några) peptidbindingar i icke-aktiva prekursorer som kallas zymogener eller proenzymer (0.5p). Klyvningen leder till konformationsförändringar som i sin tur leder till att den aktiva ytan formas. Exempel: aktiveringen av matsmältningsenzymer (0.5p) som trypsin, eller av enzymerna i blodlevringskaskaden (0.5p). 3

4 Fråga 10: Vad håller ihop ett cellmembran? Vad innebär det för rörligheten av lipidmolekylerna? (3p) Hydrofoba effekten, van der Waals interaktioner, (0,5p). Lipiderna kan röra sig inom varje skikt men rör sig nästan aldrig från det ena skiktet till det andra (0,5p). Fråga 11: Hur kan ett G-protein omvandlas från en aktiv form till en inaktiv och från en inaktiv till en aktiv form? (4p) Ett G-protein är aktivt när det binder GTP och inaktivt när det binder GDP. Omvandlingen från aktiv till inaktiv sker genom klyvning (hydrolys) av GTP till GDP + P. G-proteiner är ofta dåliga GTPaser och behöver hjälp av aktiverande proteiner. Ett G-protein blir aktivt igen när GDP byts ut mot GTP. Till detta behöver G-proteinet hjälp av andra proteiner. Fråga 12: a) Förklara vad en cofaktor är. b) Vad är skillnaden mellan ett apoenzym och ett holoenzym. c) Vad är skillnaden mellan ett cosubstrat och en prostetisk grupp. d) Ge ett exempel på ett cosubstrat och ett exempel på en prostetisk grupp. (totalt 4 p) a) En cofaktor är en jon eller molekyl som ett potein behöver för att fungera, förutom de aminosyror som enzymet är uppbyggt av. b) Enzymet utan cofaktor(er) kallas apoenzym (0.5p), och med cofaktor(er) bundna kallas det holoenzym (0.5p). c) Ett cosubstrat binds reversibelt och deltar i reaktionen, men lämnar normalt enzymet efter reaktionen för att regenereras av ett annat enzym (0.5p). En prostetisk grupp är hårt bunden, ofta kovalent, och lämnar inte enzymet efter reaktionen utan regenereras på plats (0.5p). d) Exempel på cosubstrat: ATP (NTP, NDP etc), NAD+/NADH, CoenzymA, ubiquinone (0.5p). Exempel på prostetisk grupp: Hem, FAD/FADH2, TPP, PLP, Biotin (0.5p) Fråga 13: Beskriv vilka fyra huvudsakliga roller som kolhydrater spelar i levande organismer och ge exempel på minst en kolhydrat som är inblandad för var och en av de funktionerna. (4 p) 1) Bränsle, energilagring. Kolhydrater används som bränsle (glukos), för lagring av energi (glykogen, stärkelse) och ingår som intermediat i många metaboliska reaktionsvägar (fruktos, glyceraldehyd-fosfat, ribulos) ( p). 2) Ingår i nukleinsyror. Ribos och deoxyribos ingår i nukleotider och utgör "ryggraden" i RNA och DNA ( p). 3) Strukturell funktion. Polysackarider bygger upp bakteriers (peptidoglycan), svampars (kitin) och växters (cellulosa) cellväggar, och finns i bindväv och extracellulär matrix hos djur (heparin, hyaluronsyra) ( p). 4) Signalering (alt. proteinglykosylering). Oligosackarider som sätts på proteiner och lipider spelar en viktig roll för igenkänning och signalering i kontakter mellan celler och deras interaktion med omgivningen. Som exempel kan nämnas 4

5 blodgruppsantigenerna A,B,0 har terminal GalNAc, Gal, eller Fuc. Glykosylering av proteiner ökar dessutom generellt deras stabilitet och löslighet ( p). (Stryer kap , s ) Fråga 14: Rotenon är en toxisk isoflavonid som produceras i vissa växter. Den uppvisar en kraftigt inhiberande effekt på enzymet NADH-Q oxidoreductase (även kallat NADH reduktas) i flygmuskler hos insekter och i fiskmitokondrier. Antimycin A som är ett toxiskt antibioticum inhiberar oxidationen av ubiquinol (reducerat coenzym Q). a) Förklara varför rotenon i höga doser är letalt (dödligt) för vissa insekter och fiskar. b) Förklara varför antimycin A verkar som ett gift. c) Antag att rotenon och antimycin A är lika effektiva på att blockera elektrontransport kedjan, vilket av de två skulle vara mest toxiskt? Förklara. (totalt 3p) a). Rotenons inhibering av NADH reduktas reducerar elektronflödet genom elektrontransport kedjan vilket i sin tur reducerar ATP produktionen. Om bildandet av ATP är mindre än organismens behov dör den. b). Antimycin inhiberar oxidationen av UQ och därmed fortsatt transport av elektroner till syre och utvinning av ATP. c). Antimycin skulle vara mest toxiskt eftersom det blockerar allt flöde av elektroner från såväl NADH som FADH2 vilket gör att ingen bypass kan ske. Rotenone blockerar endast NADH-reduktase:t vilket medför att elektroner (från exempelvis fettsyra nedbrytningen) kan tas emot via FADH2. Fråga 15: Är det möjligt att bilda glukos ( nettosyntes av glukos) från fettsyrorna nedan. Motivera dina svar. (4p) a). 18:0 b). 17:0 a). Nej. Vid oxidation av jämna kolkedjor bildas acetyl-coa via beta oxidationen. I citronsyra cykeln kondenserar acetyl-coa och oxaloacetat och bildar därmed citrat. Därefter oxideras totalt två koldioxid bort i citronsyra cykeln viket medför att de två kol som tillförts citronsyra cykeln (som acetyl-coa) oxideras bort och kan därmed inte utnyttjas för nettosyntes av glukos. (2p) b). Ja. Men i mycket begränsad omfattning. Udda fettsyror oxideras även dessa via beta-oxidationen ända tills det återstår tre kol, propionyl-coa. Propionyl-CoA har sin inkörsport vid succinyl-coa i citronsyracykeln dvs. citronsyracykeln erhåller 4st extra kol som därmed kan utnyttjas för syntes av glukos via glukoneogenesen. (2p). Fråga 16: Du har fått jobb inom ett av Sveriges största foderföretag, där ombeds du att beskriva vad som händer biokemiskt/metaboliskt i levern hos en gris som drabbas av svält under ca 3 dagar. Den begränsning som du har är att text och figur inte får vara mer än en A4-sida. (7p) 5

6 Leverglykogen börjar ta slut. Alanin från musklerna transporteras till levern för syntes av glukos via glukoneogenesen, glukos transporteras ut i blodet. Fettsyror från fettväven frisättsför att användas som energi i muskel och lever Glycerol från triaylglycerolerna transporteras till levern för syntes av glukos. Brist på oxalacetat i levercellerna medför att ketonkroppar produceras och utsöndras i blodet. Fråga 17: Glykolysens hastighet regleras huvudsakligen av 3 stycken nyckelenzymer fosfofruktokinas, pyruvatkinas och hexokinas. Vad har dessa enzym gemensamt (vad gör ett kinas). Kinas är ett enzym som överför en fosfatgrupp från ATP till en motagarmolekyl. Fråga 18: Urea bildning: I lever cellen sker en oxidativ deaminering av glutamat. Kvävegruppen bildar tillsammans med bikarbonat så småningom carbomylfosfat. Urea innehåller två kvävegrupper den ena kommer från carbomylfosfaten men a).varifrån kommer den andra kvävegruppen? b). Vad kallas den metabolsika väg som dessa reaktioner deltar i? c).i vilket organ sker den huvudsakliga syntesen av urea. (totalt 3p) a). Från aspartat b). Urea cykeln c). Levern Fråga 19: Vad är ubiquitin? (Endast ett alternativ får anges) a). en aminosyra involverad i fotosyntesen b). ett protein involverat i protein turnover c). en kolhydratintermediär i pentosfosfat shunten d). ett B-vitamin involverat i proteinkatabolismen b Fråga 20: Energiomvandling/ljusreaktion Nysyntes av organiskt kol är en energikrävande process. a) Varifrån tas energin? b) Var sker energiinfångningen (i vilken organell och var i denna)? c) Vilken funktion har följande komponenter i energiinfångningen: (i) biologiskt membran, (ii) klorofyll, (iii) protein, (iv) redoxaktiva föreningar a) Energin tas från solljuset (ATP och NADPH som bildas i ljusreaktionen) b) Energiinfångningen sker i (kloroplastens) tylakoidmembran (6p) 6

7 c) Ett biologiskt membran fungerar som barriär och möjliggör bildning av en protongradient som driver ATP-syntes, klorofyll är en primär fotoreceptor som fångar in solljuset genom att dess elektroner kan exiteras av solljuset, proteiner förankrar fotoreceptorer (klorofyll) och fungerar som enzymer, redoxaktiva föreningar fungerar som elektronmottagare och bidrar till laddningseparation över membranet. Fråga 21: RNA-polymeras transkriberar gener. I bakterier är ett visst protein viktigt för att RNA-polymeraset skall hitta till rätt gen. Vilket är proteinet? Vad kallas DNAsekvensen (innehåller -35 och -10 regionerna) som detta protein binder och därmed ser till att RNA polymeraset transkriberar rätt gen? (2p) Sigmafaktorn alt. Sigmasubenheten binder till promotorn. Fråga 22: PCR är en teknik som revolutionerat molekylärbiologin. Vad står beteckningen PCR för? Du vill göra många kopior av en speciell gen och beslutar dig för att köra PCR. Vad stoppar du i provröret och hur ser du till att just den speciella genen och inget annat DNA kopieras under PCR reaktionen (rita gärna)? (3.5p) PCR står för Polymerase Chain Reaction. Du behöver DNA (0.5p) som innehåller din gen. Två (DNA) primers (0.5p) där den ena basparar/binder till början och den andra till slutet av genen (0.5). Dessutom behövs DNA polymeras (0.5p), och deoxynukleotider (dntps) (0.5p). Fråga 23: Vilka av följande påstående är falskt respektive sant a) DNA syntesen sker alltid i 5 till 3 riktning. b) Shine & Dalgarno sekvensen är viktig för terminering av proteinsyntes. c) Vid sekvensning av en gen behöver du använda ribonukleotider. d) Restriktionsenzymer katalyserar bindningen mellan trna och aminosyra. e) Introner innehåller information för avläsning till aminosyror. f) Ett operon utgörs av tre nukleotider som kodar för en specifik aminosyra g) Ett kodon utgörs av tre nukleotider som kodar för en specifik aminosyra h) Plasmider används ofta för att klona gener. (4p) Sant: a, g, h Falskt: b, c, d, e, f 0.5p för varje korrekt svar. 7