Spermiekvalitet hos Xenopus tropicalis (västafrikansk klogroda) efter exponering för EE 2 under yngelperioden

Transkript

1 Projektrapport från utbildningen i EKOTOXIKOLOGI Ekotoxikologiska avdelningen Nr 114 Spermiekvalitet hos Xenopus tropicalis (västafrikansk klogroda) efter exponering för EE 2 under yngelperioden Rosita Eklund

2 INNEHÅLLSFÖRTECKNING SAMMANFATTNING...3 FÖRORD INTRODUKTION Inledning Xenopus Tropicalis Etinylöstradiol Utsläppskällor Ekotoxikologiska data Östrogenreceptorer Syfte och hypotes 9 2. MATERIAL OCH METOD hcg-inducering och parning EE 2 -exponering Yttre könskaraktärer Spermieutvärdering Gonadosomatiskt index Statistiska metoder RESULTAT hcg-inducering och parning EE 2 -exponering Morfologi Yttre könskaraktärer DISKUSSION Spermiekoncentration och motilitet Gonadmorfologi Yttre Könskaraktärer I miljön REFERENSER.19 2

3 SAMMANFATTNING Flera studier visar att runt vår jord blir groddjuren allt mer sällsynta. Fler och fler människor stoppar i sig syntetiska hormoner som slutligen hamnar i naturen och dessa kan bland annat påverka grodornas reproduktionsförmåga. Etinylöstradiol (EE 2 ) är ett syntetiskt hormon som används i läkemedel vid brist på östrogen, i p-piller, vaginalring och p-plåster. Tidigare studier visar att exponering för EE 2 under embryoperioden ger en skev könskvot hos grodor. Syftet med denna studie var att undersöka om exponering för låga EE 2 -koncentrationer under yngelperioden leder till försämrad spermiekvalitet hos hangrodor (västafrikansk klogroda, Xenopus tropicalis). Ynglen exponerades för 0, 0,006, 0,06 och 0,6 nm EE 2 från kläckningen till metamorfos. Resultaten visar att det inte var någon signifikant skillnad mellan grupperna vad gäller spermiekoncentrationen, spermiernas motilitet och gonadosomatiskt index. Resultaten visade dock en signifikant skillnad i könskvot vid koncentrationen 0,06 nm EE 2 med fler honor än hanar. Påverkad könskvot var den känsligaste testvariabeln i denna studie. Resultaten visar att det finns risk för att könskvoten hos frilevande grodor som exponerats för östrogenlika miljögifter ute i naturen kan bli skev med fler honor än hanar. 3

4 FÖRORD Denna rapport är den skriftliga delen av mitt examensarbete inom biologi (ekotoxikologi) på magisterprogrammet vid Uppsala Universitet. Arbetet utfördes på Avdelningen för Ekotoxikologi på Uppsala Universitet. Jag vill tacka Irina Pettersson för all hjälp under försökets gång och all praktisk information, Cecilia Berg för all handledning under examensarbetet och speciellt tack till båda två för att ni tagit er tid med mig så fort jag haft några frågor! Tack även till Gunnar Steinholtz för skötseln av grodorna under försökets gång. Tack även till alla andra på avdelningen för att de fått mig att känna mig välkommen och trivts som grodan i vattnet. De andra examensarbetarna är värda många tack för många glada stunder! Till sist ett tack till min sambo Johan som hjälpt mig med formuleringar och stöd!! 4

5 1. INTRODUKTION 1.1 INLEDNING Runt hela vår jord blir groddjuren allt mer sällsynta (Carey et al, 1995; Stuart et al, 2004). Vad beror det på? Är det människans skövling, bekämpningsmedel, syntetiska hormoner, ändrat klimat eller fler predatorer? Förmodligen är det en kombination av dessa saker som gjort så att groddjuren minskar i alla delar av världen (Amphibian declines hemsida). Fler och fler människor stoppar i sig syntetiska hormoner som slutligen hamnar i reningsverk som kanske inte har resurser att ta hand om dem utan släpper dem vidare ut i naturen (Larsson et al, 1999). Det är inte bara hormoner utan även hormonliknande föreningar som kan ställa till med stor skada i naturen. Ett exempel på det är atrazin, ett bekämpningsmedel som används på ogräs vid t ex planteringar av olika slag (Svenska Naturskyddsföreningens hemsida). I Sverige är det förbjudet sedan 1989, men i USA används det fortfarande flitigt (Hayes et al, 2002; Kemikalieinspektionens hemsida, a). Atrazin har visat sig ha en hormonstörande effekt och påverkar reproduktionssystemet hos groddjur (Hayes et al, 2002). Grodor ute i naturen exponeras för många ämnen, däribland androgener och östrogener, naturliga såväl som syntetiska. Allmänt gäller att grodor på laboratorium som exponerats under yngelstadiet för androgener blir maskuliniserade och grodor som exponerats för östrogener blir feminiserade (Hayes et al, 1998). I en studie utförd på grodor har man undersökt känsligheten hos två arter, Xenopus tropicalis (västafrikansk klogroda) och Rana temporaria (vanlig groda), då de exponerats för etinylöstradiol (EE 2 ) under yngelperioden och visat att koncentrationen 0,06 nm EE 2 resulterade i en skev könskvot hos båda arterna (Pettersson och Berg, 2007). MacKenzie et al. (2003) har jämfört känsligheten hos leopardgroda (Rana pipiens) och skogsgroda (Rana sylvatica) efter exponering under yngelperioden för EE 2 i koncentrationerna 1 och 10 µg/l. Efter metamorfos undersöktes grodorna histologiskt där hon bland annat tittade på differentieringen av gonaderna. Resultaten visade att leopardgroda var känsligare för könsbyte och utveckling av tvekönade gonader än skogsgroda. 5

6 Det saknas studier där man undersöker effekter på fertiliteten hos grodor efter yngelexponering för EE 2 eller andra östrogener. Fort et al. (2004) har i en studie exponerat grodyngel (Xenopus tropicalis) under tidiga utvecklingsstadier (Nieuwkoop och Faberstadium 8) och därefter under 90 dagar för metoxyklor i koncentrationerna 0, 1, 10 och 100 µg/l (Nieuwkoop och Faber, 1956). Metoxyklor är en klorerad pesticid vars metaboliter har östrogena egenskaper (Fort et al, 2004; Gaido et al, 1999). Efter 90 dagar undersöktes kroppsvikt, testikelvikt och spermiekoncentration hos hanarna. Gruppen som exponerats för 100 µg/l visades ha en minskad testikelvikt och spermiekoncentration och ingen i den gruppen hade metamorfoserat. Könskvoten var skev i gruppen som exponerats för 100 µg/l, med fler honor än hanar. Både naturliga östrogener och östrogenlika miljögifter kan påverka olika delar av grodans liv, t ex påverkar de differentieringen av gonaderna, tidpunkten för sexuell mognad och de kan förändra könsorganens utveckling och det hanliga beteendet. Förändringar på gonaderna beror av när under utvecklingen som man exponerar grodan för ämnet (Milnes et al, 2005). På så vis kan man påverka olika delar av utvecklingen genom att påskynda eller fördröja processer (Sandstrom et al, 1994). Tuppar (vit Leghorn) som exponerats för EE 2 under embryoperioden visade sig i vuxen ålder ha mindre spermieproduktion (spermavolym) jämfört med kontrollfåglarna, men spermiekvaliteten var opåverkad (Blomkvist et al, 2006). Jobling et al (2002) har studerat frilevande mörtar (Rutilus rutilus) och visat att de som exponerats i miljön för östrogenlika miljögifter har försämrad fertilitet. Hon studerade spermiekvalitet och fertilitet hos frilevande mörtar i en flod som tog emot avloppsvatten från ett reningsverk, innehållande östrogenlika miljögifter och jämförde dem med mörtar från referenslokaler. Det visade sig finnas en koppling mellan tvekönade individer, feminisering och östrogenlika miljögifter. De mest påverkade fiskarna var helt infertila, men de flesta fiskarna som var tvekönade kunde producera spermier. Hos män har störd reproduktionsförmåga fått ett samlingsnamn, TDS = testikel dysgenesis syndrom (dysgenesis = bristande fortplantningsförmåga). Syndromet visar sig som demaskulinisering eller feminisering av manlig fenotyp, t ex minskad spermiekvalitet. De senaste 50 åren har antalet rapporterade TDS-fall ökat, samtidigt som fler och fler kemikalier 6

7 används i samhället. I en studie där man jämfört effekter av hormonstörande kemikalier på försöksdjur med symptom man sett på människa, drog man slutsatsen att dessa syndrom skulle kunna bero på hormonstörande miljögifter (Edwards et al, 2005). 1.2 XENOPUS TROPICALIS Xenopus tropicalis (västafrikansk klogroda) är en grodart som hör hemma i Västafrika där det finns ca 10 arter av släktet Xenopus. De är vattenlevande och blir vanligen 4-5 cm långa från nos till kloak. De kan lägga ägg per parning. De trivs i grumliga vatten och i vatten som rör sig långsamt (Nationalencyklopedins hemsida). I de flesta studier utförda på grodor har man använt sig av Xenopus laevis som är en släkting till X. tropicalis. X. laevis är större och tar mer plats. Det tar ca 1-2 år för X. laevis att bli könsmogen jämfört med bara ca 5 månader för X. tropicalis. Det gör att X. tropicalis är mer lämpad för studier på reproduktionen (University of Virginias hemsida) ETINYLÖSTRADIOL Etinylöstradiol är ett syntetiskt framställt östrogen som används i läkemedel vid behandling av brist på östrogen och i preventivmedel; alla kombinerade p-piller, vaginalring (NuvaRing ) och depotplåster (EVRA ) (Läkemedelsverket, 2006, s 57). I Sverige finns det 42 stycken produkter som innehåller EE 2 och är godkända av läkemedelsverket och år 2002 såldes läkemedel innehållande 6,4 kg EE 2 (Läkemedelsverket, 2006, s 59) Utsläppskällor Både naturligt östrogen och EE 2 utsöndras med urinen och hamnar ute i naturen via avloppsvattnet (Larsson et al, 1999). Depotplåstret, EVRA, används under en vecka och innehåller 2-4 gånger så mycket EE 2 som kombinerade p-piller som man intar oralt. Vaginalringen, NuvaRing, används under en månad och innehåller ännu mer EE 2 än depotplåstret. När dessa preventivmedel ska slängas är det fortfarande hög halt EE 2 kvar och därför är det viktigt att de slängs till förbränning. Om de skulle spolas ner i toaletten är reningsverket bara en mellanstation och EE 2 når slutligen miljön och kan ställa till stor skada (Läkemedelsverket, 2006, s 57). 7

8 1.3.2 Ekotoxikologiska data EE 2 har ett K oc -värde på 4590, vilket betyder att det binder hårt till markens organiska partiklar och är därmed svårrörligt (Halling- Sørensen et al, 1998) (se tabell 1). År 1999 publicerades en studie som visade att EE 2 hade påvisats i avloppsvatten från ett svenskt reningsverk där man hade hittat koncentrationer av både naturligt östrogen och EE 2 (Larsson et al, 1999). Naturligt östrogen finns i högre koncentration i avloppsvattnet, men det har en kortare halveringstid än EE 2, 1,2 dagar för estradiol-17beta jämfört med 17 dagar för EE 2 (Jürgens et al, 2002). Det sker en del nedbrytning i reningsverket, men ibland kan EE 2 vara så svårnedbrytbart att det åter hamnar i dricksvattnet (Larsson et al, 1999). Hos äggläggande ryggradsdjur styrs vitellogeninproduktionen av östrogen. Vitellogenin är ett ägguleprotein som bildas i levern. I en studie där fisk exponerats för avloppsvatten kunde det visas att vitellogenin som normalt uttrycks hos könsmogna honor kunde påvisas hos hanar (Larsson et al, 1999). I samma studie har han visat att EE 2, östron och 17α- östradiol har gånger högre koncentration i gallan än i det omgivande vattnet. EE 2 har ett BCF-värde på 244,2 som visar att ämnet tas upp i kroppen och bioackumulerar (tabell 1; Fass hemsida). Tabell 1. Etinylöstradiols kemiska, fysiska och ekotoxikologiska egenskaper Egenskap Enhet Molmassa 296,41 g/mol K oc -värde L/kg = svårrörligt PEC-värden 2,3 < 0,0001-0,0043 µg/l PNEC-värden 2,4 0,00002 µg /L BCF 5,6 244,2 1 Halling- Sørensen et al, Läkemedelsverket: Miljöpåverkan från läkemedel samt kosmetiska och hygieniska produkter; augusti PEC-värde = (Predicted Environmental Concentration) Den beräknade (förväntade) koncentrationen av ett ämne i den yttre miljön, t ex vattendrag. 4 PNEC = den koncentration som sannolikt inte förorsakar negativa effekter i vattenmiljön. 5 Fass, hemsida. 6 BCF = biokoncentrationsfaktor. 8

9 EE 2 är klassificerad som miljöfarlig enligt Kemikalieinspektionen och är tilldelad riskfrasen R51/53. Det betyder att den är giftig för vattenlevande organismer och kan orsaka skadliga långtidseffekter i vattenmiljön (Läkemedelsverket, 2006, s 74; Kemikalieinspektionens hemsida, b) Östrogenreceptorer EE 2 har samma verkningsmekanism som naturligt östrogen, men är mer motståndskraftigt mot nedbrytning (Läkemedelsverket, 2006). Det binder till östrogenreceptorerna (ER), ER-α och ER-β. Dessa receptorer har påvisats i många djurgrupper t ex: däggdjur, grodor och fågel. ER-α och ER-β finns i cellernas cytoplasma i många vävnader och organ, t ex i reproduktionsorganen, njurar, lungor, ben och kärl. Eftersom både honor och hanar producerar östrogen och har båda östrogenreceptorerna kan EE 2 påverka både honor och hanar (Amandusson et al, 2001). 1.4 SYFTE OCH HYPOTES Detta examensarbete syftar till att undersöka om exponering för EE 2 under yngelperioden leder till försämrad fertilitet hos hanliga grodor (Xenopus tropicalis). Hypotesen är att exponering för EE 2 orsakar minskad spermiekoncentration, spermiemotilitet och gonadosomatiskt index (GSI). I arbetet ingår en metodutvecklingen med syftet att undersöka om spermiekoncentration, spermiernas motilitet eller gonadosomatiskt index påverkas av injektion av humant gonadotropin och parning. Jag undersöker sedan om dessa variabler påverkats hos grodor som exponerats för EE 2 under yngelstadiet. Sedan undersöker jag även om det är möjligt att visuellt könsbestämma grodorna utifrån yttre, sekundära könskaraktärer. 2. MATERIAL OCH METOD 2.1 hcg-inducering OCH PARNING I metodutvecklingen användes 16 st hanar och 7 honor (Xenopus tropicalis) som inte exponerats för någon kemikalie. De var 2-3 år och första eller andra generationens avelsgrodor (4 respektive 12 stycken). Grodorna hölls i akvarier (26 ± 0,8ºC, 12 timmars ljus/mörkercykler) som innehöll 40 L vatten (nio delar avjoniserat vatten och en del kopparfritt kranvatten från Uppsala) med stycken i varje akvarium. 9

10 Grodorna delades in i fem grupper, dessa redovisas i tabell 2. För att inducera parningsbeteendet injicerades hanarna och honorna i den dorsala lymfkörteln med humant gonadotropin (hcg, 0,1 ml, 200 enheter/ml) löst i 0,9 % NaCl-lösning dagen innan parningen ska äga rum. Samma dag som parningen ägde rum injiceras grodorna med en högre dos hcg (0,1 ml, 1000 enheter/ml). Grodorna placerades i små akvarier (hona + hane) och lämnades i fred under sex timmar. Med 45 minuters intervall kontrollerades om de parade sig eller ej. Tabell 2. Gruppindelning av de hanar (Xenopus tropicalis) som ingick i metodutvecklingen. Grupp Generation Behandling A1 1 Grodorna injicerades med hcg och sen sattes de ihop med en hona under sex timmar. Efteråt avlivades de. A2 2 Samma behandling som ovan. B2 2 Grodorna injicerades med hcg och efter sex timmar avlivades de. C2 2 Grodorna injicerades med hcg och efter en timme avlivades de. D2 2 Grodorna avlivades direkt utan injektion. 2.2 EE 2 -EXPONERING Yngel från fyra par västafrikanska klogrodor (Xenopus tropicalis) hölls i 10-litersakvarier med 70 yngel i varje. Ynglen exponerades för 0, 0,006, 0,06 eller 0,6 nm EE 2 i ett genomflödessystem (Pettersson och Berg, 2007). Exponeringen skedde från utvecklingsstadium till stadium 66 (färdig metamorfos) (Nieuwkoop och Faber, 1956). EE 2 löstes i aceton och späddes med avjoniserat vatten för att få rätt EE 2 - koncentration i akvarierna. Kontrollen fick bara aceton och vatten. Lösningen med aceton och vatten samt de tre stamlösningar med EE 2 fanns i e-kolvar och därifrån pumpades lösningen över i akvarierna med en flödeshastighet på 50 µl/min. Akvarierna hade ett vattenflöde på 60 ml/min. EE 2 - lösningarna byttes ut var femte dag. Acetonkoncentrationen var 0,0001 % i alla akvarier. Vattenprov samlades vid två tillfällen (dag 1 och 32) för senare analys av EE 2 -halt. Ynglen fördelades i två replikat (A och B) per koncentration. Hälften av grodorna avlivades vid metamorfos för bestämning av könskvot (Pettersson och Berg, 2007). Resten av grodorna fick tillväxa under åtta månader. 10

11 Efter åtta månader fick de grodor som bedömdes vara hanar enligt kriterierna nedan para sig med oexponerade honor. Grodorna inducerades med hcg och fick para sig under sex timmar som beskrivs under YTTRE KÖNSKARAKTÄRER För att avgöra huruvida det är en hane eller hona av arten Xenopus tropicalis finns det könskaraktärer som man kan använda sig av (tabell 3) (Harland Lab, University of California, Berkeley, hemsida). Tabell 3. Yttre, sekundära könskaraktärer hos Xenopus tropicalis Karaktär Specifikt för hane respektive hona Kroppsform Honan är större, päronformad Hanen är mindre, smalare Pigmenterade band Hanen har till skillnad från honan mörk pigmenterad hud på insidan av frambenen Kloak Honan har en större och mer utstående kloak som blir röd efter hcg-behandling 2.4 SPERMIEUTVÄRDERING Grodorna avlivades genom att placeras i 5 % bensocain, löst i 70 % etanol, och därefter genom att klippa sönder hjärtat. Hela grodan vägdes, vänster testikel dissekerades ut och vägdes. Den lades i ett eppendorfrör med buffertlösning: 113 mm NaCl, 1 mm CaCl 2, 2 mm KCl och 3,6 mm NaHCO 3 (1 ml buffert/10 mg vävnad) (Kouba et al, 2003). Testikeln klipptes i småbitar med sax under ca 5 minuter. Därefter centrifugerades vävnaden ner vid 50 g i 2 minuter. 150 µl av supernatanten överfördes till ett nytt rör för utvärdering av spermiekoncentrationen och motilitet. Med hjälp av en hemocytometer och mikroskop beräknades antalet spermier och motiliteten. En hemocytometer liknar ett objektglas i storleken, men har ett inristat rutnät med (2 16 rutor, där varje ruta är indelad i ytterligare 16 smårutor). Var och en av de stora rutorna har en definerad volym för att möjliggöra bestämning av spermiekoncentration. Spermieprovet späddes 4 gånger med avjoniserat H 2 O. Med hjälp av pasteurpipett fördes spermierna över till 11

12 hemocytometern (Kielberg et al, 1994). Spermieantalet ska ligga mellan stycken per stor ruta för att resultatet ska bli tillförlitligt (Kielberg et al, 1994). Efter spädningen filmades spermierna i en stor ruta (indelad i sexton smårutor) med en videokamera kopplad till ett mikroskop. Spermierna i rutan räknades direkt och därefter räknades rörliga spermier på filmen. Detta upprepades med ett annat replikat från samma supernatant, för varje prov. För bestämning av spermiekoncentrationen räknades spermierna i tre rutor mitt i hemocytometerns rutnät. Koncentrationen beräknades genom att antalet spermier multipliceras med spädningsfaktorn (spf 4), och divideras med volymen (0,0002 ml) (Kielberg et al, 1994). 2.5 GONADOSOMATISKT INDEX Genom att dividera grodans gonadvikt med kroppsvikten fick man ut gonadosomatiskt index, GSI. Utifrån GSI kan man bedöma om gonadvikten skiljer sig mellan grodor som exponerats för en kemikalie och grodor som inte blivit exponerade (kontroll). 2.6 STATISTISKA METODER Oparat t-test användes för att jämföra de olika behandlingsgrupperna med avseende på: spermiekoncentration, spermiernas motilitet och gonadosomatiskt index. Resultaten visade att grodorna i grupperna med kontroll och 0,006 var normalfördelade. Linjär regression användes för att testa om det fanns något samband mellan testikelvikten och spermiekoncentrationen. Skillnaden bedömdes vara signifikant vid p < 0,05. 12

13 3. RESULTAT 3.1 hcg-injektion OCH PARNING Spermiekoncentration, spermiernas motilitet och GSI efter injektion av hcg och parning, redovisas i tabell 4. Tabell 4. Kroppsvikt, gonadvikt, spermiekoncentration, motilitet och gonadosomatiskt index (GSI) hos Xenopus tropicalis. Resultaten är angivna som medelvärden och standardavvikelse (±SD). För information om hur de olika grupperna behandlades se tabell 2, sid 11. Grupp 1 Antal Kroppsvikt (g) A1 4 4,70 (0,4) Gonadvikt (mg) Spermiekoncentration ( 10 6 spermier/ml) Motilitet (%) GSI (%) Höger Vänster Höger Vänster Höger Vänster Höger Vänster 5,6 (1,0) 7,0 (2,1) 4,4 (1,3) 4,6 (1,8) 35 (11) 32 (10,0) 0,118 (0,02) 0,149 (0,04) A2 3 4,18 (0,4) 5,4 (2,6) 7,3 (2,2) 2,8 (0,5) 2,9 (1,1) 45 (5,5) 42 (16,0) 0,126 (0,04) 0,175 (0,05) B2 3 4,76 (0,7) 5,2 (1,1) 9,4 (2,1) 2,6 (0,8) 3,2 (1,0) 46 (12,0) 34 (15,0) 0,114 (0,04) 0,196 (0,02) C2 3 5,01 (0,3) 7,8 (3,5) 11,8 (3,0) 2,6 (0,6) 3,2 (1,0) 46 (10,0) 53 (8,2) 0,158 (0,08) 0,237 (0,07) D2 3 4,99 (0,6) 5,1 (0,3) 7,3 (0,6) 4,1 (1,3) 3,6 (1,0) 39 (7,8) 48 (17,0) 0,066 (0,06) 0,148 (0,03) Det var ingen signifikant skillnad mellan de olika grupperna A-D beträffande spermiekoncentration, spermiernas motilitet och GSI. Däremot var vänster testikel signifikant tyngre än höger (p < 0,05). 3.2 EE 2 -EXPONERADE GRODOR Åtta månader efter metamorfos fanns det 151 stycken grodor. Av dessa bedömdes 37 stycken vara hanar och 114 stycken vara honor (figur 1). Antalet hanar i respektive exponeringsgrupp anges i tabell 5. 13

14 (%) 50 *** *** (50) (50) (18) (36) Honor Intersex Hanar 25 0 K 0,006 0,06 0,6 nm EE 2 Figur 1. Fördelningen (%) av hanar och honor bland Xenopus tropicalis efter exponering för EE 2 (0,006-0,6 nm) från de tidiga yngelstadierna till färdig metamorfos. Antal individer per koncentration finns angivet inom parentes. I gruppen som exponerats för 0,006 nm EE 2 fanns en individ med intersex (2 %). Spermiekoncentration, spermiernas motilitet och GSI hos de EE 2 -exponerade grodorna redovisas i tabell 5. Tabell 5. Kroppsvikt, gonadvikt, spermiekoncentration, motilitet och gonadosomatiskt index (GSI) hos grodhanar (Xenopus tropicalis) exponerade för EE 2 (0,006-0,6 nm) från de tidiga utvecklingsstadierna till färdig metamorfos. Resultaten är angivna som medelvärden och standardavvikelse (±SD) hos vuxna grodor. EE 2 (nm) Antal hanar Kroppsvikt (g) Gonadvikt (mg) Spermiekoncentration ( 10 6 spermier/ml) Motilitet (%) GSI (%) ,62 (0,86) 8,60 (2,51) 2,97 (1,38) 58 (17) 0,1 (0,031) 0, ,59 (0,91) 10,4 (3,2) 2,99 (1,27) 61 (26) 0,120 (0,029) 0,06 1 7,99 9,4 1, ,12 Den statistiska analysen visade inte på någon signifikant skillnad gällande de studerade variablerna mellan grodorna i kontrollgruppen och de som exponerats för koncentrationen 14

15 0,006 nm EE 2. Det visade sig inte finnas något samband mellan testikelvikten och spermiekoncentrationen Morfologi Vid dissektionen upptäcktes en del missbildningar i gonaderna som t ex ovotestis (gonad som innehåller både äggceller och testikelvävnad) och delade testiklar (en liten testikelliknande struktur i direkt anslutning till testikeln). Fyra grodor i kontrollgruppen hade ovotestis. I den grupp som exponerats för 0,006 nm EE 2 fanns en tvekönad individ som hade både en testikel och ett outvecklat ovarium. I denna grupp fanns även en individ med ovotestis. Individer med delad testikel hittades både hos kontrollerna (3 stycken) och hos gruppen som exponerats för 0,006 nm EE 2 (5 stycken). 3.3 YTTRE KÖNSKARAKTÄRER Alla hanarna som användes vid metodutvecklingen hade en tydlig hanlig kroppsform. De svarta pigmenterade banden fanns endast synliga på en groda. Kloaken var något utstående hos vissa hanar och inte synlig alls på andra. Könskaraktärerna var lättare att bedöma på de grodor som ingick i EE 2 -studien. Alla hanarna hade en tydligt hanlig kroppsform. 46 % av grodorna hade lite utstående kloak (17 av 37 stycken). 84 % hade mörka pigmenterade band på frambenen (31 av 37 stycken). 4. DISKUSSION 4.1 SPERMIEKONCENTRATION OCH MOTILITET Under metodutvecklingen visades att det inte var någon signifikant skillnad i spermiekoncentration mellan grodorna som fått humant gonadotropin (hcg) och de som utgjorde kontrollen. Det var inte heller någon skillnad i spermiekoncentration mellan grodorna i grupperna A1 och A2, vilket visade att det inte var någon skillnad mellan generationerna. Det antogs innan att de grodor som parat sig skulle ha mindre spermiekoncentration än de som inte parat sig, men så var alltså inte fallet. På grund av att det inte var någon påvisbar effekt av hcg-injektionen på spermiekoncentrationen kunde man använda samma injektionsförfarande av hcg (0,1 ml, 200 enheter/ml och 1000 enheter/ml) på individerna exponerade för EE 2. Om de grodorna av någon anledning inte parade sig skulle det inte påverka spermiekoncentrationen. 15

16 Hypotesen var att spermiekoncentrationen skulle minska vid exponering för EE 2, men det visade sig inte vara någon signifikant skillnad mellan grupperna som exponerats för EE 2 och kontrollgruppen. Att spermiekoncentrationen inte påverkats kan bero på att hanarnas gonader inte påverkas av EE 2. Resultaten visar att en del hanar påverkas och därmed utvecklar äggstockar medan de andra inte påverkas alls. En möjlig felkälla kan vara att de exponerade hanarna har spermatocyter (outvecklade spermier) i gonaden som ser ut som mogna spermier, men en kommande histologisk utvärdering kommer förhoppningsvis att ge svar på det. Fort et al. (2004) har tidigare visat att spermiekoncentrationen kan beräknas med en hemocytometer. Han har använt sig av denna då han beräknade spermier från grodor (Xenopus tropicalis) som exponerats för metoxyklor. Där visade sig spermiekoncentrationen minska i den grupp som exponerats för den högsta undersökta koncentrationen (100 µg/l). I hans studie hade kontrollgruppen en spermiekoncentration (spermier/ml) på 2, och kontrollgruppen i den här studien hade en koncentration på 2, Blomkvist et al. (2005) visade att exponering för EE 2 under embryonalperioden hos tupp (vit Leghorn) gav en minskad spermavolym. Spermiekvaliteten var dock inte påverkad. Hos grodor är det svårt att bestämma ejakulatets volym eftersom sperman transporteras via njuren och vidare med urinen ut ur kroppen. Det finns få studier som handlar om EE 2 - effekter på grodor. Detta är den första studien där man studerat vuxna hangrodors fertilitet efter exponering för EE 2 under yngelperioden. Tidigare studier som utförts på grodor är en undersökning från 1955 där Chang et al. har exponerat grodyngel (Xenopus laevis) för estradiol i koncentrationerna µg/l. Endast i de grupper som exponerats för låg koncentration estradiol ( 25 µg/l) skedde en utveckling av hanar. Deras fertilitet undersöktes ej. De exponerade fenotypiska honorna fick para sig med oexponerade hanar och det resulterade i endast hanlig avkomma. Andelen rörliga spermier från de hanar som användes under metodutvecklingen varierade mellan %. Motsvarande andel från de hanar som användes i EE 2 -förösket varierade mellan %. Någon signifikant skillnad mellan grupperna kunde inte påvisas. Skillnaden i spermiernas motilitet mellan hanarna som användes under metodutvecklingen och EE 2 - försöket beror troligen på att grodorna kommer från olika återförsäljare i USA och kan 16

17 därmed komma från två olika stammar. Det är också en skillnad i ålder. Grodorna i metodutvecklingen var två till tre år gamla medan de i EE 2 -försöket var ca åtta månader. 4.2 GONADMORFOLOGI Vid metodutvecklingen observerades att det inte var någon signifikant skillnad i testikelvikt mellan grupperna. Däremot fanns det skillnad i vikt mellan höger och vänster testikel. Vänster var tyngre hos 10 av 12 individer och i fem fall dubbelt så tung som höger testikel. Spermiekoncentrationen var inte positivt korrelerad till testikelvikten. Det var inte väntat att ena testikeln var större än den andra och jag har inte hittat andra liknande observationer i litteraturen. Det fanns ingen signifikant skillnad i gonadvikt och GSI mellan de olika grupperna som exponerats för EE 2. Zebrafisk (Danio rerio) som exponerats för 17β-estradiol under embryoyngelstadiet visade inte heller på någon signifikant skillnad på vikten av gonaderna och GSI (Brion et al, 2004). Hos hanfiskar (amerikansk elritsa) resulterade en exponering för 10 ng EE 2 /L under yngelperioden i en signifikant minskning av GSI (Pawlowski et al, 2004). Vid dissektionen identifierades ett antal individer med avvikande gonadmorfologi. En individ som exponerats för 0,006 nm EE 2 var tvekönad. Fyra individer från kontrollgruppen och en individ som exponerats för 0,006 nm EE 2 hade ovotestis. Tre individer från kontrollgruppen och fem som exponerats för 0,006 nm EE 2 hade delad testikel. I tidigare studier har man hittat tvekönade individer hos flertal djurarter som exponerats för östrogenlika miljögifter i naturen, t ex frilevande mört (Jobling et al, 2002) och karp (Vigano et al, 2006). Även hos groddjur som exponerats under yngelstadiet på laboratorium för EE 2 ; leopardgroda (Rana pipiens) och skogsgroda (Rana sylvatica) har man identifierat tvekönade individer (MacKenzie et al, 2003). Det har utförts en studie på frilevande leopardgroda (Rana pipiens) som samlats in från områden där man använt bekämpningsmedlet atrazin. I dessa områden hade en stor andel av grodorna (92 %) ovotestis (Hayes et al, 2003). 4.3 YTTRE KÖNSKARAKTÄRER Under metodutvecklingen visade det sig vara svårt att bestämma könet på individen enbart med hjälp av de yttre karaktärer som finns att tillgå. På de grodorna som ingick i EE 2 -studien hade 46 % lite utstående kloak och 84 % hade svarta pigmenterade band på frambenen. Det hade dock ingen koppling till exponeringsnivån för EE 2 då både utstående kloak och 17

18 pigmenterade band fanns representerad jämnt över koncentrationerna. Den tillförlitligaste karaktären var kroppsformen. Skillnaden i könskaraktärerna mellan individerna som användes vid metodutvecklingen och EE 2 -försöket beror troligen som tidigare beskrivits på att grodorna kommer från två olika stammar. Det är skillnad i ålder, men det borde inte påverka könskaraktärerna. Slutsatser som kan dras från utvärderingen är att kroppsformen är den karaktären som stämde bäst med gonadtypen. Att titta på kloak och de pigmenterade banden för att bestämma könet på individen är inte en lika säker metod. 4.4 I MILJÖN Den känsligaste testvariabeln i denna studie var könskvoten som var skev vid så låg exponeringsnivå som 0,06 nm EE 2 (motsvarande 17,8 ng/l). Utanför ett reningsverk i Sverige har det uppmätts 0,015 nm EE 2 (motsvarande 4,5 ng/l), ett värde som överstiger det uträknade PNEC-värdet på 0,02 ng/l (Larsson et al, 1999). Den högsta uppmätta koncentrationen i Europa var 0,42 nm EE 2 (motsvarande 125 ng/l) i bukten utanför Venedig (Pojana et al, 2004). Resultaten från den här studien visar att Xenopus tropicalis är känslig för EE 2. Som tidigare nämnts har Xenopus tropicalis känslighet jämförts med Rana temporarias (vanlig groda) som är en vanligt förekommande grodart i Sverige. Båda grodarterna exponerades under yngelperioden för EE 2 i koncentrationerna 0, 0,006, 0,06 eller 0,6 nm. Båda arterna uppvisade skev könskvot vid koncentrationen 0,06 nm EE 2 vilket visar att det finns risk för skev könskvot hos vildlevande europeiska grodor (Pettersson och Berg, 2007). Slutsatsen av mitt examensarbete är att yngelexponering för EE 2 inte påverkade spermiekvaliteten, dvs spermiekoncentration och spermiernas motilitet eller GSI. Detta är den första studien där man studerat vuxna hangrodors fertilitet efter exponering för EE 2 under yngelperioden. Det finns få studier som handlar om EE 2 -effekter på grodor och fler behövs, till exempel för att få reda på vilket genetiskt kön de grodor har som exponerats för EE 2 under yngelperioden. Det vore även intressant att undersöka synergism mellan flera ämnen eftersom grodorna ute i naturen ofta exponeras för flera östrogenlika miljögifter samtidigt. 18

19 5. REFERENSER Artiklar: Amandusson Å och Blomqvist A Östrogenreceptorer kan reglera känsligheten för smärta. Tidsk Nor Lægeforen; 121: Blomqvist A, Berg C, Holm L, Brandt I, Ridderstråle Y, och Brunström B Defective reproductive organ morphology and function in domestic rooster embryonically exposed to o,p - DDT or ethynylestradiol. Biology of reproduction 78: Brion F, Tyler CR, Palazzi X, Laillet B, Porcher JM, Garric J och Flammarion P Impacts of 17β-estradiol, including environmentally relevant concentrations, on reproduction after exposure during embryo-larval-, juvenile- and adult-life stages in zebrafish (Danio rerio). Aquatic toxiclogy 68: Carey C och Bryant C J Possible interrelations among environmental toxicants, amphibian development, and decline of amphibian populations. Environ Health Perspect.103 (Suppl 4): Chang C och Witschi E Breeding of sex-reversed males of Xenopus laevis daudin. Proc Soc Exp Biol and Med 89: Edwards TM, Moore BC, Guilliette Jr LJ Reproductive dysgenesis in wildlife: a comparative view. International journal of andrology 29 ( ). Fort DJ, Thomas JH, Rogers RL, Noll A, Spaulding CD, Guiney PD och Weeks JA Evaluation of the developmental and reproductive toxicity of methoxychlor using an anuran (Xenopus tropicalis) chronic exposure model. Toxiclogical science 81 ( ). Gaido KW, Leonard LS, Maness SC, Hall JM, McDonnell DP, Saville B, Safe S Differential Interaction of the Methoxychlor Metabolite 2,2-Bis-(p-Hydroxyphenyl)-1,1,1- Trichloroethane with Estrogen Receptors α and ß 1. Endocrinology 140 (12):

20 Halling-Sorensen B, Nors Nielsen S, Lanzky PF, Ingerslev F, Holten Lutzhoft HC, Jorgensen SE Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment- a review. Chemosphere, 36(2): Hayes TB Sex determination and primary sex differentiation in amphibians: Genetic and developmental mechanisms. J. Exp. Zoo 281: Hayes TB, Collins A, Lee M, Mendoza M, Noriega N, Stuart AA, Vonk A Hermaphroditic, demasculinized frogs after exposure to the herbicide atrazine at low ecologically relevant doses. Proc Natl Acad Sci USA.99 (8): Hayes TB, Haston K, Tsui M, Hoang A, Haeffele C och Vonk A Atrazine-induced hermaphroditism at 0.1 ppb in American leopard frogs (Rana pipiens): Laboratory and field evidence. Environmental Health Perspectives. Vol 111(4): Jobling S, Coey S, Whitmore JG, Kime DE, Van Look KJW, McAllister BG, Beresford N, Henshaw AC, Brighty G, Tyler CR, Sumpter JP Wild intersex roach (Rutilus rutilus) have reduced fertility. Biology of reproduction 67, Jürgens MD, Holthaus KIE, Johnson AC, Smith JJL, Hetheridge M, Williams RJ The potential for estradiol and ethinylestradiol degradation in English rivers. Environ Toxicol Chem; 21: Kielberg V, Brünner N, Briand P Cellodling- En praktisk handbok i odling av mammalieceller. sid Novum Grafiska AB, Göteborg. Kouba AJ, Vance CK, Frommayer MA, Roth TL Structural and functional aspects of Bufo americanus spermatozoa: Effects of inactivation and reactivation. Journal of experimental zoology 295A: Larsson DGJ, Adolfsson-Erici M, Parkkonen J, Pettersson M, Berg AH, Olsson P-E, Forlin L Ethinyloestradiol - an undesired fish contraceptive? Aquatic Toxicology, Volume 45,

21 MacKenzie CA, Berrill M, Metcalfe C, Pauli BD Gonadal differentiation in frogs exposed to estrogenic and antiestrogenic compounds. Environmental Toxicology Chemistry. 22(10): Milnes MR, Bermudez DS, Bryan TA, Edwards TM, Gunderson MP, Larkin ILV, Moore BC, Guillette jr LJ Contaminant-induced feminization and demasculinization of nonmammalian vertebrate males in aquatic environments. Environ Res. 100(1):3-17. Nieuwkoop PD och Faber J Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). North-Holland Publishing Company. Amsterdam. Parrott JL och Blunt BR Life-cycle exposure of fathead minnows (Pimephales promelas) to an ethinylestradiol concentration below 1 ng/l reduces egg fertilization success and demasculinizes males. Environmental toxicology 20(2): Pawlowski S, van Aerle R, Tyler CR och Braunbeck T Effects of 17α-ethinylestradiol in fathead minnow (Pimephales promelas) gonadal recrudescence assay. Ecotox and environm safety 57 ( ). Pettersson I och Berg C Environmentally relevant concentrations of ethynylestradiol cause female-biased sex ratios in Xenopus tropicalis and Rana temporaria. Environmental Toxicology Chemistry, under tryckning. Pettersson I, Arukwe A, Lundstedt-Enkel K, Mortenson AS, Berg C Persistent sexreversal and oviducal agenesis in adult Xenopus (Silurana) tropicalis frogs following larval exposure to the environmental pollutant ethynylestradiol. Aquatic Toxicology; 2021, Pojana G, Bonfa A, Busetti F, Collarin A, Marcomini A Estrogenic potential of the Venice, Italy, lagoon waters. Environ Toxicol Chem 23(8): Sandstrom O Incomplete recovery in a coastal fish community exposed to effluent from a modernized Swedish bleached kraft mill. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. Vol. 51, no. 10, pp

22 Stuart SN, Chanson JS, Cox NA, Young EB, Rodrigues ASL, Fischman DL, Waller RW Status and Trends of Amphibian Declines and Extinctions Worldwide Science Express. Vol no. 5702, pp Vigano L, Mandich A, Benfenati E, Bertolotti R, Bottero S, Porazzi E, Agradi E Investigating the estrogenic risk along the river Po and its intermediate section. Arch Environ Contam Toxicol. 51: Nätsidor: Amphibian declines: , kl 15:50 Fass för allmänheten, , kl 11,00 Harland Lab, University of California, Berkeley: , kl 15:50 Kemikalieinspektionen, a: , kl 11:00 Kemikalieinspektionen, b: , kl 9,24 Läkemedelsverket: Bengtsson BE, Gunnarsson B, Wall T och Wennmalm Å Miljöpåverkan från läkemedel samt kosmetiska och hygieniska produkter, Nationalencyklopedin; sökord etinylöstradiol: ; kl 09:49 22

23 Nationalencyklopedin; sökord Xenopus tropicalis: , kl 11:30 Nationalencyklopedin; sökord xenoöstrogener: , kl 11:35 Svenska Naturskyddsföreningen: , kl 10:51 Sjukvårdsrådgivningen: , kl 14:09 Riktlinjer angående preventivmedel, Centrala Mödrahälsovården, 2002, Mona Söderlund/EG: %20vid%20MVC%20i%20NU-omr%C3%A5det.doc , kl 13:27 University of Virginia: , kl 12:04 23