Desinfektion av virus i dricksvatten

Transkript

1 Desinfektion av virus i dricksvatten Emma Forsberg Uppsats för avläggande av naturvetenskaplig masterexamen i Miljö- och hälsoskydd 30 hp Institutionen för biologi och miljövetenskaper, Göteborgs universitet Juni 2012

2 Sammanfattning Allvarliga problem med dricksvatten ansågs av många länge bara finnas i utvecklingsländer, men på senare år har denna uppfattning ändrats efter ett antal stora sjukdomsutbrott relaterade till dricksvatten i Sverige. Desinfektion i reningsverk med bland annat klor används för att säkerställa att dricksvattnet håller tillfredställande kvalitet. Klors desinfektionseffekt är bäst vid långa kontakttider, högt flöde, hög vattentemperatur och lågt ph. Ett mått på desinfektionen är Ct-värdet, som är koncentrationen multiplicerat med effektiva kontakttiden för de 10 % av vattnet som snabbast passerar desinfektionsutrymmet och med hänsyn till att koncentrationen av klor minskar med tiden. Med hjälp av detta kan inaktiveringsgraden av mikroorganismer vid en viss koncentration och kontakttid förutsägas. Det finns ett antal olika mikroorganismer som kan orsaka sjukdomar relaterade till dricksvatten, bland annat Campylobacter, norovirus och parasitära protozoer så som Cryptosporidium och Giardia lamblia. Hypotesen för detta arbete var att reduktionen av levande celler är ett bättre mått på inaktivering av virus än vad reduktionen av indikatorbakterier är. Försöksmetoden i detta arbete har varit att till ph-justerat filtratvatten från Lackarebäcks vattenverk tillsätta en viss mängd kolifager av typen phix174. Kolifager är en form av bakteriofager som infekterar E. coli. Till vattnet har sedan natriumhypoklorit, i tre olika koncentrationer, tillsats för att desinficera vattnet. Prover har sedan tagits ut vid olika tidpunkter under det 90 minuter långa försöket och analyserats med avseende på kolifager, levande celler, viruslika partiklar, fritt och totalt klor, ph, TOC samt odlingsbara mikroorganismer. Klors effektivitet som desinfektionsmedel mot bakterier beror på att klor orsakar fysiologiska effekter hos bakterierna och främst på deras cellmembran. Virus, som har en enklare uppbyggnad än bakterier, har färre mål för desinfektionsmedlen. De har heller ingen metabolism, och därför utgör virusets kapsid och dess genom mål för desinfektionsmedlen. För norovirus är det fortfarande oklart hur motståndskraftiga de är mot klor. Resultatet av gjorda experiment visar på att den faktiska reduktionen av intakta celler över hela 90-minutersperioden var större än eller likvärdig med den förväntade enligt Ctberäkningarna. Reduktionen av indikatorbakterier var initialt större än reduktionen av kolifager och större än reduktionen av levande celler. Kolifagen phix174 hade en faktisk reduktion som var betydligt större än den framräknade förväntade reduktionen och en stor del av fagreduktionen skedde i initialskedet. Slutsatsen är att reduktionen av intakta celler gav en betydligt bättre indikation på virusinaktivering än reduktionen av indikatorbakterierna. Den använda kolifagen tycks vara relativt klorkänslig, och ytterligare försök med mer klortåliga fager kan vara ett värdefullt underlag för bedömningar av hur tåliga humanpatogena virus är mot desinfektion med klor. 1

3 Summary Serious problems with drinking water have for a long time been seen as a problem only existing in developing countries, but recently this have changed due to a number of outbreaks of disease related to drinking water in Sweden. Disinfection with for example chlorine is used to ensure that the water has a satisfying quality. Its disinfection efficiency improves with long contact times, good mixture, high water temperature and low ph. To measure disinfection a Ct-value can be used, which is the concentration times the effective contact time for the first 10 % of the water and with consideration of that the concentration decline over time. By these means the inactivation rate at a certain concentration and contact time can be estimated. There are several different microorganisms that can cause diseases related to drinking water, for example Campylobacter, norovirus and the parasites Cryptosporidium and Giardia lamblia. The hypotheses for this report were that the reduction of living cells is a better indicator for virus inactivation than the reduction of indicator bacteria. The experimental approach was to ph-adjust water from the water plant and to add coli phages. Coli phages are a form of bacteriophages that infect coliform bacteria. After addition of sodium hypochlorite, at three different concentrations, to disinfect the water samples were collected at different times during 90 minutes. The samples were analyzed for coli phages, living cells, viruslike particles, free and total chlorine, ph, TOC and growth of microorganism. The effectiveness of chlorine as a disinfection substance against bacteria is due to its physiological effects on the cell membrane. Viruses, which have a simpler structure than bacteria, have fewer targets for disinfection substances. Viruses generally do not have a metabolism and therefore the capside and the genome is usually the target for the disinfection substances. It is still unclear how sensitive norovirus is against chlorine. The results from these experiments show that the actual reduction of living cells over the whole 90-minutes period where larger or equal with the expected reduction according to the Ct-calculations. The reduction of indicator bacteria where initially larger than the reduction of coliphages and overall larger than the cell reduction. The coliphage phix174 had a reduction that was much bigger expected, and much of it occurred early. The conclusion of the report is that decrease in living cells is a better indicator for virus inactivation than the reduction of indicator bacteria. Phix174 seems to be very sensitive to chlorine, and new experiments with more chlorine-resistant phages would lead to more information that could be important to determine how sensitive human patogene viruses are to disinfection with chlorine. 2

4 3

5 Innehållsförteckning Sammanfattning...1 Summary...2 Innehållsförteckning Inledning Dricksvattenrening Problemställning Syfte Avgränsningar Material och metod Försöksmetod Provvatten Temperering av provvatten ph-justering av provvatten Kolifag-lösning propagering av kolifager Tillsats av klor Tillsats av klor och kolifager Kontakttid Provtagning Beskrivning av genomförda försök Mikrobiologiska och kemiska analyser Resultat Resultat av litteraturstudien Resultat av genomförda försök Diskussion Problem med metoden Diskussion av analysresultaten Beräkning av initial halt fritt klor och Ct-värden baserade på klorkurvan Klors inaktiveringseffekt på virus Levande celler som indikatormetod för virusinaktivering? Förslag på fortsatta försök Slutsatser

6 Tackord...75 Referenser...75 Bilaga A. Analysresultat för försöken Bilaga B. Beräkning av initial klorkoncentration och förväntad reduktion av kolifager respektive levande celler Bilaga C. Analysresultat för Lackarebäck filtrat nord och filtrat syd Bilaga D. Analysresultat för Lackarebäck utgående dricksvatten Bilaga E. Trend för levande celler i Lackarebäcks utgående dricksvatten samt i filtraten Bilaga F. Trend för TOC för Lackarebäcks utgående dricksvatten samt filtraten Bilaga G. Trend för fritt klor i Lackarebäcks dricksvattensnäcka och utgående dricksvatten 5

7 1 Inledning Dricksvatten är ett av våra viktigaste livsmedel, och länge sågs problem med dricksvatten bara vara kopplat till utvecklingsländer. Men de senaste åren har denna uppfattning förändrats, bland annat på grund av sjukdomsutbrotten relaterade till dricksvatten i Östersund 2010 (Dahlberg, 2011) och Skellefteå I Göteborg beslutade kommunfullmäktige att ultrafilter skulle installeras vid Lackarebäcks vattenverk i syfte att förebygga problem med dricksvattenkvalitén redan innan de nämnda utbrotten ovan (Olof Bergstedt, muntligt). Enligt the World Health Organisation (WHO) är Campylobacter, norovirus och parasiten Giardia lamblia de vanligaste mikrobiella smittoämnena i dricksvatten. Utbrott av dessa, och speciellt norovirus, är enligt WHO den största hälsorisken relaterad till dricksvatten i världen (WHO, 2008). I dagsläget är det svårt att kvantifiera parasitära protozoer i tillräckligt låga halter i dricksvatten eftersom de analysmetoder som används inte är tillräckligt känsliga för detta. Riskvärderingen av påvisade halter försvåras mer av att standardanalyserna inte visar om de är viabla (levande) eller inte. Problemen med virus är ännu svårare eftersom det överhuvudtaget inte är möjligt att avgöra viabiliteten hos t.ex. humanpatogena norovirus i vatten, utan det måste göras genom försök med frivilliga vilket inte är tillåtet i Europa. I dag används ofta indikatorbakterier, såsom Escherichia coli (E. coli) för att påvisa förekomst av mikrobiologiska föroreningar i vatten. De kan påvisa färsk fekal förorening, och då kan slutsatsen dras att det också finns risk för förekomst av andra mikrobiologiska föroreningar. Frånvaron av indikatorbakterier visar dock inte att smittämnen som är tåligare i miljön och i dricksvattenberedningen inte skulle kunna finnas i skadliga halter (Dahlberg, 2011; Olof Bergstedt, muntlig). 1.1 Dricksvattenrening Enligt Livsmedelsverket gäller att dricksvatten ska vara hälsosamt och rent. Det ska anses vara hälsosamt och rent om det inte innehåller mikroorganismer, parasiter och ämnen i sådant antal eller sådana halter att de kan utgöra en fara för människors hälsa (SLV, 2001) Mikrobiologisk barriär En mikrobiologisk barriär är en del av reningsprocessen i ett vattenverk, som syftar till att reducera antalet mikroorganismer i vattnet. I Sverige finns det krav från Livsmedelsverket att det ska finnas ett tillräckligt antal mikrobiologiska barriärer i reningsprocessen (SLV, 2001). Kravet utgår från vilken typ av råvatten som används (grundvatten eller ytvatten) samt vad råvattnet har för mikrobiologisk kvalitet normalt sett. För att vara en mikrobiologisk barriär krävs att den kan oskadliggöra patogener antingen genom avskiljning eller genom inaktivering. Det finns ett antal metoder som kan fungera som mikrobiologiska barriärer, 6

8 bland annat primär desinfektion med klor, ozon och UV-strålning men också kemisk fällning med efterföljande filtrering (Lindberg och Lindqvist, 2005) Desinfektion Desinfektion är ett effektivt sätt att bli av med oönskade mikrobiologiska föroreningar i vatten. Idag används flera metoder för desinfektion och den vanligaste är kemiska desinfektionsmedel så som klor eller ozon, som båda är oxidationsmedel, samt UV-strålning. Fördelarna med kemisk desinfektion är att desinfektionsmedlet kan tillsättas på olika ställen i reningsprocessen, och att det går att kombinerar flera olika kemiska desinfektionsmedel med varandra. Fördesinfektion innebär att desinfektionsmedlet tillsätts direkt till råvattnet, medan primärdesinfektion är det huvudsakliga desinfektionssteget, där medlet syftar till att inaktivera mikroorganismer inne i reningsanläggningen. Utöver detta finns en sekundärdesinfektion, som syftar till att ha långvarig effekt och inaktivera mikroorganismer ute på ledningsnätet. Det finns ett antal olika faktorer som påverkar effekten av desinfektionen. För klor och ozon är det främst följande faktorer (Shin and Sobsey, 2008; Ødegaard et al., 2009): Kontakttiden mellan mikroorganismen och desinfektionsmedlet. Effekten av desinfektionsmedel kommer i regel att öka med en längre kontakttid vid en bestämd koncentration av desinfektionsmedlet. Koncentrationen och typ av desinfektionsmedel. Olika mikroorganismer har olika tolerans för olika desinfektionsmedel och för olika koncentrationer av dessa. Flödet i utrymmet där desinfektionen sker. Antalet mikroorganismer och art. Vattnets sammansättning och dess temperatur. Bland annat kommer vattnets innehåll av organiskt material, oxiderbart oorganiskt material och partiklar påverka effekten av desinfektionen på olika sätt. Även ph, temperatur, alkalinitet etc. påverkar desinfektionseffekten (Ødegaard et al., 2009) Hydrauliska förhållanden så som reaktorns utformning och omblandningsförhållandena i den (Shin and Sobsey, 2008). När vatten desinficeras är det oftast tre olika mekanismer hos patogenerna som är i fokus (EPA, 1999). Dessa är: Att genom fokus på viktiga delar i cellerna, så som cellväggen eller funktionen av semipermeabla membran, förstöra cellens uppbyggnad. Att göra enzymerna som är inblandade i energimetabolismen ofunktionella. Att genom att förhindra syntesen av proteiner, nukleinsyror och co-enzymer påverka biosyntesen och tillväxten av patogenerna. I vattenrening är det främst desinfektionsmedlets förmåga att oxidera eller förstöra cellväggen och dess förmåga att diffundera in i cellen och där integrera med cellaktiviteterna som tros påverka måttet av inaktivering tillföljd av desinfektion (EPA, 1999). 7

9 1.1.3 Desinfektion med klor Klor används i olika former som desinfektionsmedel t.ex. klorgas (Cl 2 ), natriumhypoklorit (NaOCl) och kalciumhypoklorit (Ca(OCl) 2 ). Vid tillsats av dessa olika former av klor till vattnet, så kommer medlen att reagera på olika sätt och tre olika former av klor kan uppstå: HOCl (underklorsyrlighet), OCl - ( hypokloritjon) och Cl 2 (molekylärt klor). Dessa tre brukar kallas fritt tillgängligt klor och är den form av klor som ger mest effektiv desinfektion. Av de tre är HOCl det bästa desinfektionsmedlet (Au and LeChevallier, 2004; Ødegaard et al., 2009). Nedan beskrivs reaktionerna för Cl 2, NaOCl och Ca(OCl) 2 : När klorgas reagerar med vatten sker följande rektioner; (1) Cl 2 + H 2 O HOCl + HCl (2) HOCl H + + OCl- Reaktionerna är ph-beroende och reversibla. Om ph är 3,5-5,5 kommer HOCl vara den dominerande formen, mellan ph 5,5 och 8,0 kommer mängden av HOCl och OCl vara i stort sett lika och vid ph över 8 kommer klor i OCl-formen att dominera. (Au and LeChevallier, 2004; Ødegaard et al., 2009). Natriumhypoklorit bildas när klorgas löses upp i natriumhydrooxid. När natriumhypokloriten sedan reagerar med vatten sker följande reaktion: NaOCl + H 2 O HOCl + Na + + OH - I denna reaktion bildas en OH - -jon som kommer höja vattnets ph (EPA, 1999). Fällningen vid upplösningen av klorgas i en lösning av kalciumoxid och natriumhydrooxid kallas kalciumhypoklorit. När kalciumhypoklorit reagerar med vatten sker följande reaktion: 8

10 Ca(OCl) 2 + 2H 2 O 2HOCl + Ca OH - Även denna reaktion kommer att höja vattnets ph (EPA, 1999). Även NH 2 Cl (monokloramin), NHCl 2 (dikloramin) och NCl 3 (kvävetriklorid) används som desinfektionsmedel. Dessa tre former kallas bundet tillgängligt klor och är mindre effektiva som desinfektionsmedel än de tidigare nämnda grupperna (Ødegaard et al., 2009). Även de klor som under initialförbrukningen, IF, av kloret binder till organiskt material kallas bundet klor (Elisabeth Athley, muntligt). Klordesinfektion är effektiv mot många av de patogener som förekommer i vatten. Dessutom lämnar klor en kvarvarande produkt som är lätt att kontrollera. Klor är ekonomiskt försvarbart att använda, och det finns mycket dokumenterat om hur klor använts på ett tillfredställande sätt i vattenreningssituationer. De nackdelar som kan finnas är att när klor reagerar med organiska och oorganiska ämnen i vattnet kan det bildas oönskade biprodukter så som trihalometaner och andra halogenerade föroreningar. Dock anses risken för att de ska ha en effekt på människors hälsa som liten i jämförelse med riskerna som finns om desinfektionen istället skulle utebli (WHO, 2008; Ødegaard et al., 2009 ). Klor kan också vid höga doser ge problem med lukt eller smak i vattnet (Ødegaard et al., 2009). Utöver förmågan att desinficera vattnet från patogener är klor effektivt mot bland annat algtillväxt, reduktion av järn och mangan och mot lukt och smakproblem i vattnet (EPA, 1999). Klor är mycket effektiv mot bakterier. Klordesinfektionen kan dock få minskad verkan om bakterierna är bundna i flockar eller till partiklar som skyddar dem mot desinfektionen. Höga turbiditetsvärden kan också skydda mikroorganismer från desinfektion. Desinfektionseffekten av klor är oftast högst vid höga kvarvarande halter av fritt klor, långa kontakttider, god omrörning, hög vattentemperatur, lågt ph, låg turbiditet och låg förekomst av ämnen som kan påverka desinfektionen. Det faktorer som påverkar desinfektionen mest är ph och temperatur. Lågt ph är bäst, eftersom klor då främst finns i HOCl-formen som är den effektivaste formen av klor (EPA, 1999) Ct-begreppet Ct-begreppet används vid dimensionering och drift av reningsanläggningar med ett desinfektionssteg. Ct-värdet är koncentrationen multiplicerat med den effektiva kontakttiden för de 10 % av vattnet som snabbast passerar desinfektionssteget, med hänsyn till att koncentrationen hela tiden minskar. För att bestämma Ct-värdet behövs information om det initiala och slutliga kloröverskottet, tiden mellan dessa samt den totala uppehållstiden (Hartlid, 2009). Med hjälp av Ct-värdet kan inaktiveringsgraden vid en viss koncentration och kontakttid förutsägas. Därigenom kan Ct-värdet användas för att beräkna hur stor reduktion 9

11 vattenverken har av mikroorganismer vid de olika mikrobiologiska barriärerna. Med hjälp av detta kan olika desinfektionsmetoder och desinfektionsmedel jämföras. När ett desinfektionsmedel tillsatts till vattnet kommer det omedelbart att börja ske en förbrukning av ämnet, eftersom att det kommer att ske en oxidation av oxiderbara komponenter i vattnet. Detta är initialförbrukningen, IF. Till detta kommer också ske en förbrukning av desinfektionsmedlet under hela kontakttiden. Vanligtvis kan detta illustreras som exponentiellfunktionen; C dos = C i *e -kt (Ekv. 1) Där k är nedbrytningskonstanten för klor som beror av vattenkvaliten. C i är initial klorkoncentrationen och C dos är klorhalten. Arean under kurvan representerar de Ct-värden som mikroorganismerna upplevt under kontakttiden (Ødegaard et al, 2009). I figur 1 nedan illustreras detta samband. Figur 1. Illustration av initialförbrukning och förhållandet mellan initial koncentration fritt klor och utgående koncentration fritt klor (Ødegaard et al., 2009). I tabell 1 nedan visas olika Ct-värden för inaktivering av virus, bakterier och parasiter med olika typer av klor och med ozon vid olika temperaturer och ph. 10

12 Tabell 1. Dimensionerade Ct-värden (mg*min/l) för inaktivering av bakterier, virus och parasiter vid olika temperaturer och ph (Ødegaard et al., 2009). 3 log 3 log 2 log inaktivering av 2 log inaktivering av inaktivering av inaktivering parasiter av gruppen parasiter av gruppen bakterier av virus Giardia Cryptosporidium 4C 0,5C 4C 0,5C 4C 0,5C 4C 0,5C Klor ph < 7 1,0 1,5 4,0 6, i.a i.a ph 7-8 1,5 2,0 6,0 8, i.a i.a ph > 8 2,0 3,0 8,0 12, i.a i.a Kloramin i.a i.a Klordioxid 1,0 1, Ozon 0,5 0,75 1,0 1,5 1,5 2, i.a inget angett. Ct-värdena är så höga att det inte är ointressanta för praktiska ändamål I figur 3 nedan redovisas en figur med förhållandet mellan Ct-värde och ph. Figuren har gjorts med hjälp av värdena för 3 log virusinaktivering vid 4C i tabell 1 ovan. Figuren har i resultatdelen använts till att beräkna förväntad reduktion av kolifager och levande celler genom att avläsa ett Ct-värde som representerar ett visst ph. Det Ct-värdet som fås ut härifrån gäller alltså vid en temperatur på 4C och för en 3 log inaktivering av virus. Figur 3. Förhållandet mellan ph och Ct-värde vid 4C för 3 log virusinaktivering. 11

13 För att beräkna den förväntade log reduktion, den reduktion som kan förväntas vid de försökförshållanden som hades vid försöken i denna rapport, har ekvation 2 nedan använts tillsammans med de beräknade Ct-värdena, som fåtts från klorkurvan för varje koncentration: Log IA = n * Ct beräknat /Ct nödvändigt (Ekv. 2) Där; Log IA = Log inaktiveringsgrad (reduktion) n = Nödvändig log inaktivering kopplad till Ct nödvändig Ct beräknat = Beräknat Ct-värde (arean under klorkurvan) Ct nödvändigt = Nödvändigt Ct-värde för att uppnå viss inaktivering. Detta ger alltså den förväntade log reduktionen (Log IA) (Ødegaard et al, 2009). Generellt mäts graden av inaktivering av mikroorganismerna som log inaktivering, eftersom inaktivering mäts på en logaritmisk skala. Detta innebär att ett värde i procent mikroorganismer som är inaktiverade av desinfektionen måste beräknas, och en lathund för detta finns i tabell 2. En log inaktivering = 2 innebär alltså en procentuell inaktivering på 99,00 (Government of Newfoundland and Labrador, 2005). Tabell 2. log inaktivering och procentinaktivering (Government of Newfoundland and Labrador, 2005). Log inaktivering Procent inaktivering Dricksvattensberedning vid Lackarebäcks vattenverk Vattnet som kommer in till Lackarebäcks vattenreningsverk kommer huvudsakligen från Göta älv via Delsjöarna genom intaget i Lärjeholm. Råvattnet som tas in i ett vattenverk går först igenom en grovrening som oftast sker med ett grovgaller och ett fingaller där större partiklar och alger plockas bort. I nästa steg i reningsprocessen ph-justeras vattnet med hjälp av kalk till ph 9,5-10, så att efterkommande fällningssteg ska fungera tillfredställande. I det kemiska fällningssteget tillsätts aluminiumsulfat till vattnet, vilket gör att partiklar som finns i vattnet bildar flockar, och flockarna drar till sig de ämnen i vattnet som gör råvattnet grumligt och ger 12

14 det viss färg. I detta steg sjunker ph till 6,5. Efter detta förs vattnet vidare till sedimenteringsbassänger där flockarna kommer att sjunka eftersom de har högre densitet än vattnet. I botten på bassängerna finns skrapor som skrapar bort slammet som samlas på bottenytan. Vissa av flockarna är dock inte tillräckligt tunga för att sedimentera i bassängerna utan dessa avskiljs när vattnet förs genom ett snabbfilter som består av aktivt kol. Kolet adsorberar ämnen som annars kan ge viss lukt och smak i vattnet. Till sist, innan vattnet leds ut till reservoarerna, tillsätts kalk, lut och kolsyra för att justera ph till cirka 8. Detta görs för att undvika att vattnet utsätter ledningarna för korrosion. Slutligen tillsätts klor/klordioxid som desinficerar vattnet (Göteborg Stad, 2011). Pilotanläggning av ultrafilter Inom Göteborg Vatten gör Lackarebäcks vattenverk i dagsläget ett försök med en ultrafilteranläggning. Tanken är att installationen av ultrafilter vid vattenverket ska förbättra vattenverkets mikrobiologiska barriär. Ultrafiltret har vid försök visat ge en reduktion av somatiska kolifager (phix174) på >4 log. Reduktionen av viruslika partiklar har visat sig vara ungefär 4 log (Kjellberg, 2011). I dagsläget håller Lackarebäcks vattenverk på att bygga ut anläggningen med ultrafilter. 1.2 Mikroorganismer Till mikroorganismer hör bland annat bakterier, protozoer, alger och virus. Mikroorganismer finns överallt där det finns förutsättning för liv och därför finns de också naturligt i vatten. De flesta mikroorganismer är icke-patogena, dvs. att de inte orsakar sjukdom. De faktorer som kan påverkar förekomsten av mikroorganismer är bland andra ph, temperatur, ljus och näringsämnen (Dahlberg, 2011) Bakterier Bakterier är mindre än protozoer men större än virus. Deras storlek och laddning är av stor vikt för möjligheten att avlägsna dem via avskiljning i reningsprocessen. Bakterier är encelliga och finns överallt i vår omgivning. De flesta bakterier är känsliga för desinfektion och de har också ofta en dålig tillväxt i vattenverk, där tillväxtmöjligheterna för dem är dåliga till följd av låga temperaturer och lite tillgång på näring inne i verken. Dock är deras överlevnadsförmåga större vid lägre temperatur. De bakterier som hittills varit mest kopplade till sjukdomsutbrott orsakade av dricksvatten är Campylobacter, Salmonella och E. coli O157 (Lindberg och Lindqvist, 2005; Dahlberg, 2011) Virus Kunskapen om virus är sämre än den om bakterier. Kunskaper om deras överlevnad och förekomst i råvatten och dricksvatten är bristfällig och det är svårt att verifiera avskiljningen av virus. Liksom för bakterier så är virus chans att överleva större vid lägre temperatur. Virus 13

15 har genetiskt material (DNA eller RNA) inneslutet i ett proteinskal (kapsid) och kan inte växa utanför sin värdcell och inte heller föröka sig i vatten. Däremot krävs det endast en liten mängd virus för att infektera människor, och desinfektion har inte alltid inverkan på virus, så virus utgör därför ett hot mot människor och påverkar därigenom dricksvattnets kvalitet negativt (Lindberg et al., 2005; Dahlberg, 2011). Norovirus hör till familjen Calicivirus, som är den familj av virus som orsakar det vi kallar vinterkräksjukan. Norovirus kräver bara partiklar för att orsaka en infektion vilket innebär att de är väldigt virulenta, och spridningen av dem sker både via kontaktsmitta och genom aerosoler. Viruset har kort inkubationstid på timmar och symptomen är illamående, kräkningar och diarréer samt magsmärtor. Globalt antas norovirus orsaka 90 % av alla icke-bakteriella och 50 % av alla epidemier och sporadiska fall av mag-tarminfektioner. Norovirus består av enkelsträngat RNA som inte har något hölje (lipidhölje från värdorganismens cellmembran) och norovirus är ett av de minsta virus som finns, med en storlek på cirka 30 nm. Viruset är sfäriskt och har en enkel arvsmassa som bara kodar för ett par proteiner, och arvsmassan är under ständig förändring. Detta har lett till att det finns ett stort antal varianter av norovirus som till viss del har olika egenskaper. Totalt delas det in i fem olika grupper (GI till GV) som baseras på deras genetiska likheter, genogrupp GII är den grupp som står bakom de flesta av de rapporterade sjukdomsutbrott som finns dokumenterade. Utbrotten av viruset är nära sammankopplat till mat- och vattenburen smitta och det sprids i stor utsträckning från person till person, så kallad sekundär smitta (Dahlberg et al., 2010). Virusets egenskaper gör att det har förutsättningar för spridning och på så vis också förutsättningar för att orsaka sjukdomsutbrott. Dels krävs det ett fåtal partiklar för att orsaka infektion, dels utsöndras viruset under lång tid efter det att den infekterade blivit av med symptomen vilket gör att viruset sprids under längre tid. Viruset är stabilt och tål både att frysas ner samt att upphettas till 60 C. Dessutom tros norovirus vara mycket motståndskraftigt mot desinfektion och tåla höga koncentrationer av klor. Viruset når dricksvatten bland annat genom otillräcklig rening av avloppsvatten eller i samband med läckage av avloppsvatten vid extrem nederbörd då bräddning av avloppsvatten kan ske. Spridning av norovirus är ofta svårt att begränsa i samband med misstanke om vattenburen smitta, eftersom det inte finns några standardiserade metoder för att analysera förekomst av viruset i vatten. Just utbrott orsakade av vattenspridning är mycket allvarliga eftersom många människor riskerar att bli infekterade på kort tid, och när ett stort antal människor insjuknar innebär det en belastning på samhället med stora kostnader som följd (Dahlberg et al., 2010). Norovirus kan finnas kvar i vattenmiljöer under lång tid och gynnas av lägre vattentemperaturer och är i regel motståndskraftiga mot miljömässig inaktivering. En minskning av viruset kommer dock ske naturligt genom exponering för ph-variationer, solljus och värme samt inaktivering genom kemiska processer (Dahlberg et al., 2010). Enterovirus tillhör familjen Picornaviridae och familjen har tre underarter; coxsaxkievirus, echovirus och poliovirus. Poliovirus kan nå ryggmärgen och då orsaka polio det vill säga barnförlamning. Polio utrotades 1957 i Sverige tillföljd av vaccinationen mot polio. 14

16 Människor eller djur som blivit infekterade av viruset sprider det lät vidare eftersom att de exkreerar stora mängder av det som då kan kontaminera bland annat råvatten. Spridning av viruset ses som ett stort problem i länder där de sanitära förhållandena är dåliga. Enterovirus är motståndskraftiga mot höga temperaturer och mot höga koncentrationer av natriumklorid och på så vis tål det till viss grad klorering i reningsverk (Hällqvist, 2010). Bakteriofager är virus som bara infekterar bakterier. Kolifager är en form av bakteriofager som infekterar E. coli, och de kan fungera som indikatorer på fekal förorening i vattnet och även som indikatorer på hur effektiv reningsprocess ett reningsverk har. Kolifager är enkla att analysera och analyserna kan göras i ett vanligt mikrobiologisk laboratorium med snabba och billiga metoder (WHO, 2008). När ett bakterievirus infekterar en stam av E. coli bildas det som kallas en somatisk kolifag. Det första som sker i infektionsprocessen är att viruset binder in till bakteriens cellvägg och att virusets genetiska material injiceras in i värdcellen där det sedan amplifieras och tillföljd av detta bildas nya viruspartiklar. Detta kommer göra att värdcellen lyserar och till slut spricker vilket gör att viruset sprids och då kan infektera andra bakterieceller (Göteborg Vatten, 2010; ISO, 2000). Phix174 är en somatisk kolifag som består av en cirkel enkelsträngat DNA som är omgiven av ett skal av proteiner. Phix174 har en storlek på cirka nm och har en kapsid som är gjord för att hitta och infektera bakterieceller med sitt DNA. Phix174 attackerar E. coli och infekterar den och får den att tillverka mer virus (Goodsell, 2010). Fager delar många av de egenskaper som enteriska virus har bland annat: struktur, sammansättning, morfologi, storlek och plats för replikation. Anledningen till att fager används är att de är lättare att detektera än virus, och de metoder som används för att detektera dem visar om de fortfarande är ineffektiva. Fager är på grund av dessa faktorer lämpliga att använda som indikatororganismer för att bedöma virus beteende och överlevnadsgrad vid vattenrening och desinfektion. Om fager hittas vid analys är det ett tecken på att det även finns närvaro av enteriska virus. Om det inte finns några fager i vattnet tyder det ofta på att det inte heller finns några enteriska virus i vattnet, eftersom antalet fager i regel finns i mycket större antal än mängden virus. Faktorer som påverkar fagers överlevnad i vatten är: densitet hos värdbakterie och fag, närvaro av partiklar, närvaro av organiska ämnen, UV-ljus, ljus, temperatur, ph, koncentration och typ av joner, närvaro av mikroorganismer (inte värdorganismen) (Grabow, 2001) Protozoer Parasitära protozoer som Cryptosporidium och Giardia har ingen tillväxt i vatten, men de överlever länge i vatten och de har en god motståndskraft mot desinfektion. Dessutom krävs de endast en låg dos av dem för att de ska orsaka infektion. Protozoernas storlek gör dock att de är relativt lätta att avskilja i vattenverk, eftersom de är större än både virus och bakterier. Protozoer är urdjur som är encelliga och är speciella på så vis att de genomgår ett cyststadium som gör dem särskilt lämpliga att överleva under extrema förhållanden. Vanligen kan Giardia och Cryptosporidium hittas i ytvatten i Sverige och det var Cryptosporidium som visade sig 15

17 orsakade sjukdomsutbrottet i Östersund 2010 (Lindberg och Lindqvist, 2005; Dahlberg, 2011). 1.3 Problemställning Trots krav på mikrobiologiska säkerhetsbarriärer i de svenska vattenverken, når mikroorganismer konsumenterna och kan i vissa fall orsaka sjukdom relaterade till dessa (Dahlberg, 2011). Det är svårt att mäta halter av t.ex. virus i dricksvatten, eftersom att de ofta innehåller väldigt låga halter av virus och oftast används olika indikatororganismer för att dra slutsatser om det finns virus i vattnet eller inte. Men indikatororganismerna ger bara en indikation på att det kan finnas virus i vattnet men det ger inget säkert resultat. På grund av detta finns det en viss osäkerhet i hur effektiva desinfektionsstegen i dricksvattenverk faktiskt är med avseende på virus. 1.4 Syfte Syftet med denna studie var att genom försök på laboratoriet på Lackarebäcks vattenverk bestämma desinfektionseffekten av slutklorering med avseende på virus i dricksvatten. 1.5 Avgränsningar Försöken har begränsats till desinfektion med endast natriumhypoklorit (och inte andra typer av klor exempelvis klordioxid), dels på grund av tidsbrist, dels på grund av att det inte fanns någon utrusning uppsatt för denna analys på Lackarebäck då försöken gjordes. Försöksmatrisen har också begränsats till endast en typ av kolifager (phix174), en temperatur (cirka 4C) och ett ph (8). 2 Material och metod Arbetet inleddes med en litteraturstudie som fokuserades på desinfektion, mikroorganismer och på vilka mekanismer som klor inaktiverar hos olika virus och bakterier. Den följdes/kombinerades med laboratorieförsök där kolifager tillsattes till vattnet, och därefter tillsattes klor i form av natriumhypoklorit för att desinficera vattnet. Försöken gjordes vid en bestämd temperatur och ett ph. Prover togs ut från försöken och analyserades med avseende på bland annat levande celler, viruslika partiklar och kolifager. Desinfektionseffekten i försöken har jämförts med framräknade värden på förväntad reduktion för kolifager och levande celler. 16

18 2.1 Försöksmetod Den generella försöksmetoden var att filtratvatten från Lackarebäcks reningsprocess tappades upp i 5 liters flaskor med kran dagen innan försöken. Vattnet ph-justerades sedan för att hålla ett ph på cirka 8. Efter detta tillsattes en bestämd volym av kolifag-lösningen som hade ett känt antal kolifager per milliliter till provvattnet. Sedan tillsattes klor i form av natriumhypoklorit i 3 olika volymer för att få en initial koncentration fritt klor på cirka 0,2, 0,32 samt 0,5 mg Cl 2 /l i provvattnet. Försöksflaskans vatten blandades med hjälp av en omrörare och flaskan ställdes tillbaka i kylen mellan provtagningarna för att behålla temperaturen på provvattnet. I varje försöksomgång gjordes fem försök, en nolla utan klor och kolifager och en kontroll med kolifager men utan klor samt tre flaskor med de tre olika klordoser. Det material som använts i försöken var: 5 liters glasflaskor med kran och kork, omrörare, magnetomrörare, kylskåp, polyetenflaskor för kemisk provtagning, glasflaskor för mikrobiologiskprovtagning med natriumtiosulfat, mikropipetter µl och µl samt pipettspetsar, 1M NaOH, natriumhypoklorit med 250 respektive 2740 mg Cl 2 /l och termometer. 2.2 Provvatten Proverna togs från filtratvatten i en provtagningsstation på vattenverket. Filtratvatten har gått igenom samtliga reningssteg i vattenverket utom de slutliga stegen innefattande desinfektion med klor och ph-justering innan vattnet går ut på rörnätet. Alltså innehöll provvattnet inget klor och hade ett lägre ph än dricksvattnet. Normalt ph för filtrat-vattnet ligger runt 6,6-6,7 enligt bilaga C. 2.3 Temperering av provvatten Temperering av provvattnet gjordes innan försöken. När vattnet togs från provtagningsstationen i vattenverket låg dess temperatur runt 3,5C. Temperering till cirka 4ºC gjordes i kylskåp över natt och vattnet kontrollmättes innan försöken startades. Kontrollmätning av temperaturen i kylskåp och i försöksflaskorna gjordes ett par gånger per dag innan försöken startade i ett försök att kartlägga de variationer som uppstod normalt i kylskåpet. Slutsatsen av dessa mätningar var att temperaturen i övre och undre delen av kylskåpet skiljde sig åt och att det var kallast i övre delen av kylskåpet. Temperaturerna i försöksflaskorna varierade också mellan olika tider på dygnet med de variationerna som normalt fanns i kylskåpet. Resultatet från tempereringsförsöken visar på att försöken i denna rapport har utförts i ett temperaturintervall från 3,5 5,5 ºC. Temperaturen i själva kylskåpet har legat på cirka 5 ºC. Försöksflaskorna ställdes in i kylskåpet igen efter varje omrörning och provtagning. Temperaturmätningar från de tidiga försöken har visat att under försökets 90 minuter har temperaturen i försöksflaskorna ökat ungefär 1C från sin ursprungstemperatur när denna metod använts. Till tempereringen användes termometer, kylskåp, provvatten och 5 liters försöksflaskor med kran och kork. 17

19 2.4 ph-justering av provvatten Provvattnet ph-justerades med 1 M natriumhydrooxid (NaOH) till önskat ph. Försöken gjordes med ett ph på cirka 8, för att efterlikna det ph som dricksvatten normalt har (se bilaga D). För att fastställa vilken mängd 1M NaOH som krävdes för ph-justeringen gjordes försök där 1,5 liter tempererat provvatten sattes på omrörning och sedan tillsattes små mängder 1M NaOH i taget för att nå rätt ph. Den erhållna volymen 1M NaOH från försöken omvandlades sedan till en volym 1M NaOH för att ph-justera försöksflaskorna på 5 liter. Resultaten av ph-justeringen blev att till 1,5 liter vatten behövdes 130 µl 1M NaOH tillsättas för att nå önskat ph och i försöket uppnåddes ph 8,10. Detta innebär att det till en 5 liters försöksflaska behövde tillsättas 433 µl 1M NaOH. Det material som användes var: 1M NaOH, 2 liters bägare, magnetomrörare, omrörare, mikropipett µl, pipettspetsar, ph-meter, termometer och provvatten. 2.5 Kolifag-lösning propagering av kolifager Kolifagerna som har använts i försöken är av typen phix174. De odlades fram i laboratoriet genom att infektera en stamlösning med E. coli med virus. Virusen infekterar då samtliga E. coli i lösningen. Stammen av phix174 kommer från Statens smittskyddsinstitut (SMI). För att kunna propagera phix174 har först en färsk lösning av fag-inokulum gjorts. Den görs genom att ta 100 ml MSB, 1 ml 14,6 %-ig CaCl 2 och 4 ml övernattkultur av E. coli som sedan inkuberas innan 10 ml av den gamla phix174 stammen tillsätts. Vid propageringen av phix174 har en övernatt kultur av E. coli tillsatts till 1000 ml MSB-buljong och 10 ml CaCl 2. Denna lösning har sedan inkuberats ett par timmar innan 10 ml fag-inokulum har tillsatts. Därefter har lösningen återigen inkuberats. Lösningen har sedan fått stå i rumstemperatur över natten och sedan har kloroform tillsats för att lysera E. coli-cellerna, efter en kvart hälls kloroformen av och lösningen är klar. I denna lösning kan bara ett visst antal kolifager växa fram och det är då direkt beroende av hur många E. coli som lösningen innehåller (Göteborg Vatten, 2010; ISO, 2000). Halten av kolifager i försöksvattnet är från början 0. Tillsatsen av kolifager anpassades så att filtratets normala tillstånd inte ändrades för mycket, men tillsatsen skulle ändå vara så stor så att en reduktion på kunde ses i resultatet. Propageringen av kolifager gjordes av personalen på laboratoriet. Innehållet i MSB (Modified Scholtens Broth)-buljongen är en blandning av pepton, jästextrakt, köttextrakt, NaCl, Na 2 CO 3 lösning, MgCl 2 -lösning och milliq-vatten (Göteborg Vatten, 2010; ISO, 2000). 2.6 Tillsats av klor Klor tillsattes i försöken i tre olika koncentrationer för att försöka få en initialhalt av fritt klor på cirka 0,2 mg/l, 0,32 mg/l respektive 0,5 mg/l. 18

20 Koncentrerad natriumhypoklorit har en koncentration på ungefär 150 g klor/liter (Kjellberg, 2012) och har en molmassa på 74,5g/mol. Vid tillsats till vatten kommer natriumhypokloriten att höja vattnets ph samt påverka vattnets alkalinitet (Haas, 1999). Koncentrationen av fritt aktivt klor påverkas av initialförbrukningen av kloret och koncentrationen av totalt tillsatt klor. För att bestämma hur stor volym natriumhypoklorit som behövde tillsättas till provvattnet för att uppnå önskade halter av initialt fritt klor så utfördes några testförsök. Där 1 liter provvatten tempererades och ph-justerades och sedan tillsattes natriumhypoklorit i olika volymer till flaskan. Försöken gjordes också med olika kontakttider för att säkerställa att en eventuell initialförbrukning av kloret redan skett när provet tagits ut för analysen av halten fritt klor. Det material som användes var: Natriumhypoklorit med koncentration 250 respektive 2740 mg Cl 2 /l, 1 liters glasflaskor med kork, magnetomrörare, omrörare, polyeten flaskor för provtagning, mikropipett µl och µl, pipettspetsar, bägare, termometer, 1M NaOH, tidtagarur, provvatten. Till de första försöken användes en natriumhypoklorit-lösning som hade en klorkoncentration på 2740 mg Cl 2 /l, och resultaten från försöken återfinns i tabell 3 nedan. Tabell 3. Uppmätt halt fritt klor (mg Cl 2 /l) vid olika klortillsatser till ph-justerat provvatten, natriumhypoklorit koncentration 2740 mg Cl 2 /l. Försök Tillsats klor(µl) Kontakttid (sek) ph-justering 1M NaOH (µl) Start temperatur(ºc) Volym (l) Fritt klor (mg/l) ,6 5, ,6 4,2 1 0, ,6 3,9 1 0, , , ,6 7,1 1 0, ,6-1 0, ,6-1 0, ,6-1 0,55 I de första försöken användes 470, 625 respektive 945 µl för att uppnå de tre initiala klorkoncentrationerna av fritt klor i fem liters flaskorna. Alltså den volym som visades sig ge rätt klorkoncentration i 1 liters flaskan gånger fem ex. 94 µl*5= 470 µl. 19

21 I nästkommande försök användes den natriumhypoklorit-lösning med koncentrationen 250 mg Cl 2 /l. Resultaten från detta försök visas i tabell 4 nedan. Tabell 4. Uppmätt halt fritt klor (mg Cl 2 /l) vid olika klortillsatser till ph-justerat provvatten, natriumhypoklorit koncentration 250 mg Cl 2 /l. Försök Tillsats klor(µl) Kontakttid (sek) ph-justering 1M NaOH (µl) Start temperatur(ºc) Volym(l) Fritt klor (mg/l) , , ,6 7,7 1 0, ,6 7,9 1 0, ,6-1 0, ,6-1 0,47 Volymerna natriumhypoklorit som tillsattes i 5 liters flaskorna var 7,2, 9,7 respektive 13,5 ml för att uppnå de tre önskade koncentrationerna av fritt klor initialt. Alltså den volym som visades sig ge rätt klorkoncentration i 1 liters flaskan gånger fem ex µl*5= 7150 µl = 7,2 ml. 2.7 Tillsats av klor och kolifager När kolifagerna tillsattes till vattnet (5 ml kolifager till 5 liter vatten) upptäcktes problem med klortillsatsen, eftersom kolifagerna och den buljong, MSB, de fanns i förbrukade allt fritt klor. Därför gjordes ytterligare försök för att fastställa orsaken till den snabba förbrukningen av fritt klor och hur försöket skulle utformas för att kringgå detta problem. De alternativ som fanns var att det var antingen MSB-buljongen, kolifagerna eller de E. coli som finns kvar i lösningen som förbrukade det fria kloret. Ett försök gjordes först med samma försöksförutsättningar som det första försöket men med en tillsats av endast 0,5 ml ofiltrerad kolifag-buljong till 5 liter provvatten, men även detta gav en snabb initialförbrukning av klor och försöket avbröts innan ytterligare analyser gjordes. Resultaten från dessa två första försök återfinns i resultatdelen i denna rapport under avsnitt och För samtliga kommande avsnitt användes följande material; Natriumhypoklorit med koncentration 2740 mg Cl 2 /l respektive 250 mg Cl 2 /l, 1 liters glasflaskor med kork, magnetomrörare, omrörare, polyeten flaskor för provtagning, mikropipett µl och µl, pipettspetsar, glasbägare, termometer, 1M NaOH, tidtagarur, MSB-buljong, provvatten, kolifag-lösning, LTLSB-buljong, centrifug med varvtal 6000 rpm, 5ml plastsprutor, 0,2 µm filter (Whatman, Anotop 25 0,02 µm cat., 20

22 No Inorganic membrane filter, 0,02µm 25mm 50 units.), 0,45 µm filter (Filtropur S 0,45. LOT REF Från Starstedt.), 0,02 µm filter och falconrör 50 ml (50 ml polypropylene, 30*115mm, från Becton Dickinson Labware) Försök med MSB-buljong I tabell 5 återfinns resultaten från försök gjorda endast med MSB-buljongen, utan innehåll av kolifager och E. coli. Försöken gjordes för att kunna se om det var MSB-buljongen i sig som förbrukade allt fritt klor. Till en liter ph-justerat provvatten tillsattes en viss mängd MSB-buljong och sedan 125 µl natriumhypoklorit. Ett prov togs ut efter 30 sekunders kontakttid. Från resultaten kunde konstateras att det verkade vara MSB-buljongen som förbrukade det fria kloret då tillsats av bara MSB-buljong till filtrat-vattnet även det gav stor förbrukning av fritt klor. Tabell 5. Resultat av försök med olika tillsatser av MSB-buljong och kolifag-lösning för att fastställa orsaken till den stora förbrukningen av fritt klor. Nr. Innehåll i försöksflaska MSB (ml) V(l) Klor(µl) 1M NaOH(µl) Fritt klor (mg/l) Totalt klor(mg/l) 1 MSB + filtrat + klor 0, ,6 <0,03 0,44 2 MSB + filtrat + klor 0, ,6 0,28 0,42 3 MSB + filtrat +klor 0, ,6 0,28 0,43 4 Kolifag-lösning + filtrat + klor 0, ,6 0,28 0,41 Det sista försöket, nummer 4, gjordes för att se hur stor klorförbrukningen var vid tillsats av en låg volym kolifag-lösning och som framgår i tabell 5 är klorförbrukningen inte längre lika stor. Men volymen, 10 µl, är en för liten tillsats av kolifag-lösningen för att en tillräckligt stor reduktion av kolifager ska kunna ses i försöken. Till följd av dessa resultat gjordes ytterligare försök för att försöka filtrera bort så stor del av MSB-buljongen som möjligt för att försöka komma förbi problemet att den förbrukar så mycket fritt klor, beskrivning och resultat av dessa försök återfinns i avsnitten nedan Filtrering av kolifag-lösning med 0,2 µm respektive 0,45 µm filter En mindre tillsats av kolifaglösningen minskade förbrukningen av fritt klor men förbrukningen var fortfarande för stor för att kunna uppnå de klorkoncentrationer som var tänkta med försöken från början. Och en tillsats på 0,05 ml av kolifaglösningen till 5 liter 21

23 vatten var för liten för att tillräckligt stor reduktion av fagerna skulle kunna ses. På grund av detta gjordes ett försök med att filtrera kolifaglösningen genom ett 0,45 µm filter och sedan tillsattes den filtrerade lösningen i låg volym till 1 liter ph-justerat provvatten dit också 125 µl natriumhypoklorit tillsattes. Från detta uppmättes ett värde på fritt klor till 0,25 mg/l vilket innebär att det inte verkade finnas någon skillnad i klorförbrukning mellan filtrerad (0,45 µm) och ofiltrerad tillsats av kolifag-lösning. Innan försöket gjordes sattes ett prov med filtrerad kolifag-lösning för att se hur mycket kolifager som förloras genom filtreringen. Det visade sig att denna förlust var mycket liten och filtrerad mängd kolifager hamnade på 8,7*10 8 pfu/ml jämfört med normalhalten som brukar ligga runt 2,9*10 9 pfu/ml. När 0,45 µm filtret inte hade någon effekt gjordes ett försök att filtrera kolifaglösningen genom ett 0,2 µm filter. Kolifaglösningen filtrerades först och sedan tillsattes 10 µl kolifaglösning till 1 liter ph-justerat vatten och sedan tillsattes 125 µl natriumhypoklorit. Halten fritt klor uppmättes då till 0,23 mg/l vilket tydde på att filtreringen med 0,2 µm inte heller hade gett någon effekt Försök med LTLSB-buljong Ett försök gjordes med LTLSB-buljong för att se om den buljongen förbrukar lika mycket klor som MSB-buljongen. Tanken var att om LTLSB-buljongen inte förbrukar lika mycket klor så fanns det en möjlighet att försöka propagera upp kolifagerna i den istället för i MSBbuljongen. Resultatet av detta var dock att även LTLSB-buljongen förbrukade mycket klor och vid en tillsats av 0,1 ml LTLSB-buljong till 1 liter ph-justerat provvatten och med 125 µl natriumhypoklorit så var halten fritt klor <0,03 mg/l alltså under detektionsgränsen Centrifugering av kolifaglösning Ett försök gjordes att centrifugera kolifaglösningen för att separera kolifagerna från övrig lösning. Centrifugeringen gjordes med 6000 rpm (rotations per minut) under 20 minuters tid och sedan gjordes ett försök där 10 µl av den centrifugerad kolifag-lösning tillsattes till 1 liter ph-justerat provvatten. Där efter tillsattes 125 µl natriumhypoklorit till vattnet och ett prov togs ut för analys och halten fritt klor mättes till 0,24 mg/l. Detta innebar alltså att centrifugeringen inte heller minskade förbrukningen av fritt klor Filtrering och backspolning av kolifaglösningen med 0,2 µm respektive 0,02 µm filter Då ingen av ovanstående lösningar gav ett tillfredställande resultat gjordes försök att först sprutfiltrera kolifaglösningen genom ett 0,2 µm filter. Efter det sögs denna lösning upp genom ett 0,02 µm upp i sprutan. Tanken var då att kolifagerna skulle fastna på filtret och att buljongen skulle följa med genom filtret in i sprutan. Sedan togs filtret av och buljongen sprutades ut ur sprutan (1,8 ml). Efter det sattes filtret på igen och ultrafiltrerat vatten sögs upp i sprutan för att skölja rent kolifagerna från så mycket buljong som möjligt. Tillsist drogs dubbelt så mycket ultrafiltrerat vatten upp som buljong (3,6 ml) i sprutan utan filter, filtret 22

24 sattes på igen och vattnet pressades genom filtret i ett försök att då skölja med kolifagerna. Kvar fanns då en lösning bestående av till stor del kolifager (med små rester av buljong kvar) samt ultrafiltrerat vatten. På detta sattes sedan prov för att analysera kolifager för att se hur stor förlust av kolifager som uppstod längs processen, resultatet av detta var att i den ofiltrerad phix174 räknades antalet till 1,20*10 9 och mängden i provet där phix174 filtrerats enligt ovan mättes till 1,70*10 8. Genom filtreringen har alltså en tiopotens förlorats i mängden kolifager. Kolifaglösningen testades sedan i 1 liters flaskor där 0,1 ml respektive 2 ml av den filtrerade kolifaglösningen tillsattes till ph-justerat provvatten och sedan tillsattes 125 µl natriumhypoklorit, resultatet finns i tabell 6. Tabell 6. Uppmätta halter av fritt klor (mg Cl 2 /l) vid tillsats av en kolifaglösningen som är filtrerad genom ett 0,2 µm filtrerad och sedan backspolad genom ett 0,02 µm filter till 1 liter ph-justerat provvattnen. Försök V (l) 1M NaOH (µl) Klor (µl) Kolifager (µl) Fritt klor (mg/l) , , , <0,03 Som resultatet i tabellen visar så blev resultatet tillfredställande vid tillsats av 0,1 ml kolifaglösning men vid större tillsats så var klorförbrukningen återigen för stor. Slutsatsen av detta var att försöken kunde köras med en tillsats av 0,5 ml till 5 liter provvatten av den kolifaglösning som först är filtrerad genom ett 0,2 µm filter och sedan backspolad genom ett 0,02 µm filter. Efter detta gjordes en större mängd av lösningen som skulle räcka till samtliga försök. Även denna lösning analyserades med avseende på kolifager och resultatet blev att lösningen innehöll 1,6*10 8 pfu/ml. Denna gång användes ett 0,45 µm filter istället för 0,2 µm filtret. Detta kunde göras då tidigare försök visat att båda filtren verkade ha ungefär samma effekt på kolifagerna. Denna lösning användes sedan genom försöken och har kontrollerats vid varje försöksomgång så att den bibehöll samma halt av kolifager. Resultat från detta finns i avsnitt i denna rapport. Lösningen förvarades i ett falconrör i ett kylskåp med en temperatur runt 6-7 C. 2.8 Kontakttid Den längsta kontakttiden i försöken är relaterad till den effektiva kontakttiden av klor i reservoarerna på Lackarebäcks vattenverk. I vattenverket är den 84 minuter (Elisabeth Athley, muntligt) och därför bestämdes det att försöken skulle pågå i 90 minuter. 23